围绕FFPE样本特性的DNA纯化纳米磁珠优化

目的 探讨围绕福尔马林固定石蜡包埋(formalin fixed paraffin embedded, FFPE)样本特性获取更高质量/得率的纳米磁珠核酸提取方案,改进分子病理技术。方法 合成4大类15个小类的备选磁珠,以FFPE样本为中心,筛选高质量/得率磁珠。模拟常规组织、粗针穿刺(肝脏)、纤维支气管镜样本(肺),装管相同张数连片。采用筛选的最佳磁珠与市场出售的常见磁珠试剂提取核酸,横向对比纯化总量、片段大小等质量参数。应用PCR和Sanger验证核酸的下游应用。结果 以FFPE样本DNA为中心筛选自制纳米磁珠,获得最佳性能纳米磁珠总回收率为58.5%±1.58%,5种市售商品化磁珠和3种国产磁珠总回收率为18.68%~40.71%。相同组织量(连片)提取的DNA总量,在模拟常规组织、粗针穿刺和纤维支气管镜样本核酸得率比市售试剂盒提高39.49%~181.72%(P<0.05)。模拟纤维支气管镜样本1张(4μm)总量可达100 ng以上、5张总量可达400 ng以上。结论 以FFPE样本DNA为中心筛选的DNA纯化纳米磁珠,与商品化磁珠相比有较大提升,为临床分子病理检测的质量保证、自动化检测和项目拓展提供空间。

荧光定量PCR与抗酸特殊染色对疑似骨关节结核中结核分枝杆菌的检测对比

目的探讨实时荧光定量PCR(real time PCR,RT-PCR)与抗酸染色法检测石蜡包埋骨关节组织中结核分枝杆菌在辅助诊断结核病的作用。方法回顾性分析253例骨关节石蜡包埋组织RT-PCR与抗酸染色法检测结核杆菌结果,并与临床结果对比分析检测的灵敏度及特异性。结果253例组织形态学表现为肉芽肿性炎伴或不伴坏死的送检样本中,RT-PCR检出率为38.3%(97/253),抗酸染色检出率为41.5%(105/253),两种检测的符合率为88.1%。RT-PCR检测的灵敏度、特异性分别为89.9%、94.8%。抗酸染色检测的灵敏度、特异性分别为85.9%、87.0%。两种检测均阳性比仅抗酸染色阳性与临床诊断结果的符合率差异有统计学意义(P<0.05);仅RT-PCR阳性比仅抗酸染色阳性与临床诊断结果的符合率差异有统计学意义(P<0.05)。结论同时行RT-PCR与抗酸染色检测有助于石蜡包埋骨关节组织中快速、准确诊断结核病。可用于疑似骨关节结核的肉芽肿性病变的鉴别诊断,具有较高的临床应用价值。

结直肠癌组织基因突变与临床病理及MMR蛋白表达的相关性分析

目的分析结直肠癌组织KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因突变与临床病理因素及MMR蛋白表达的相关性。方法采用扩增阻碍突变系统(ARMS)和免疫组化法对122例结直肠癌石蜡组织进行回顾性分析。结果 122例结直肠癌组织中KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因突变率分别为48.4%(59/122)、4.1%(5/122)、5.7%(7/122)和5.7%(7/122)。检出KRAS与PIK3CA双突变病例3例,BRAF与PIK3CA双突变1例,未发现BRAF与KRAS或NRAS基因同时突变病例。女性患者KRAS突变率高于男性患者(P<0.05),低分化腺癌KRAS突变率高于高、中分化腺癌(P<0.001)。女性患者、有淋巴结转移者和MLH1蛋白表达缺失者与男性患者、无淋巴结转移和MLH1表达者比(P<0.05),PMS2蛋白表达缺失者比表达者的BRAF突变率更高。黏液腺癌PIK3CA突变率较其他肿瘤组织学类型高(P<0.05)。结论该4种基因在结直肠癌的突变率依次为KRAS、 BRAF、PIK3CA、NRAS,不存在4种基因全突变及3种基因突变。BRAF与KRAS、NRAS基因突变存在相互排斥现象。KRAS、BRAF、PIK3CA基因突变与结直肠癌临床病理特征存在相关性。

甲状腺癌中PTEN蛋白表达与BRAF^(V600E)突变的相关性研究

目的:探讨PTEN蛋白在甲状腺乳头状癌(PTC)中的表达情况,并进一步分析此蛋白的表达量与BRAF^(V600E)基因突变的相关性及临床意义,初步揭示两者在PTC发生、发展中的致癌作用。方法:采用免疫组化En Vision两步法检测70例PTC中PTEN蛋白的表达水平;采用PCR法及DNA测序法检测上述标本中BRAF^(V600E)突变情况,分析PTEN蛋白表达与BRAF^(V600E)突变的相关性及其与PTC临床病理特征的关系。结果:70例PTC中PTEN阴性率为78.6%(55/70),与癌旁组织1 8.6%(1 3/7 0)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。PTEN表达下调与性别、肿瘤淋巴结转移、临床分期有关(P<0.05);与BRAF^(V600E)突变、年龄、肿瘤直径无关(P>0.05)。70例PTC中BRAF^(V600E)突变率为60%,BRAF^(V600E)突变与肿瘤淋巴结转移、临床分期密切相关(P<0.05);与患者年龄、性别、肿瘤大小无关(P>0.05)。结论:PTEN蛋白表达与BRAF^(V600E)突变无相关性。两者可能是PTC生物侵袭高的独立危险因素,可能作为评估PTC预后不良的不同肿瘤标记物。两者对甲状腺癌的临床个体化治疗及判定预后有指导意义。

毛细管电泳基因扫描和凝胶电泳异源双链分析在免疫球蛋白/T细胞受体基因重排检测中的应用研究

目的探讨免疫球蛋白轻链IgK及T细胞抗原受体（TCRT）基因重排更有效的检测方法。方法收集四川大学华西医院病理科2013～2014年淋巴组织增生性病变石蜡样本共139例，采用B10MED2系统扩增，分别使用毛细管电泳基因扫描和凝胶电泳异源双链分析两种方法进行IgK和TCR7基因重排检测，比较不同方法之间的检出率。结果81例行IgK基因重排检测，其中59例病理诊断为B细胞淋巴瘤，毛细管电泳基因扫描检出阳性47例（79．66％），凝胶电泳异源双链分析检出阳性34例（57．63％），二者差异有统计学意义（P=0．01）。58例行TCR7基因重排检测，其中26例病理诊断为T细胞淋巴瘤，毛细管电泳基因扫描检出阳性21例（80．77％），凝胶电泳异源双链检出阳性17例（65．38％），差异无统计学意义（P=0．211）。结论毛细管电泳基因扫描在抗原受体基因重排检测中比凝胶电泳异源双链分析有更好的检测灵敏度。

结直肠癌MMR蛋白和MSI检测对比及临床病理特征分析

目的探讨结直肠癌(CRC)患者MMR蛋白表达与微卫星不稳定(MSI)检测的一致性以及与临床病理特征的相关性,分析两种检测结果不一致的原因。方法选取392例CRC石蜡包埋组织(FFPE)样本,采用免疫组化(IHC)法检测4种MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6及PMS2)表达,至少1种蛋白表达缺失判定为错配修复蛋白表达缺失(dMMR),全部阳性判定为错配修复蛋白表达完整(pMMR);采用PCR毛细管电泳法检测MSI,将至少2个单核苷酸重复位点发生改变,归纳为高度MSI(MSI-H);仅有1个单核苷酸重复位点发生改变,归纳为低度MSI(MSI-L);未发生改变,归纳为微卫星稳定(MSS)。结果392例CRC中,dMMR为18.9%(74/392),MSI-H占比18.1%(71/392)。IHC法检测的敏感度、特异性分别为97.2%和98.4%;PCR法检测结果的敏感度、特异性分别为93.2%和99.4%,两种检测方法的一致性为98.2%。7例检测结果不一致的样本中,2例PCR法检测结果为MSI-H,IHC法检测结果为pMMR;5例PCR法检测结果为MSS,IHC法检测结果为dMMR,其中2例MSH6蛋白单独缺失,3例肿瘤为黏液腺癌。dMMR组与pMMR组、MSI-H组与MSS/MSI-L组在发病年龄、肿瘤直径、肿瘤部位、组织类型、临床分期及淋巴结转移等方面比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论IHC法检测MMR蛋白与PCR法检测MSI具有较高的一致性。MSH6单独缺失时,PCR检测可能表现为MSS。肿瘤中含黏液时,肿瘤实际占比<50%可能对PCR检测有一定的影响。CRC中dMMR/MSI-H患者具有明显的临床病理特点,对临床病理诊断、治疗有一定的指导意义。

CTHRC1在乳腺癌中的表达及其临床意义

目的探讨乳腺癌中胶原三螺旋重复蛋白1(CTHRC1)的表达情况及其临床意义。方法选择手术切除的乳腺癌组织及其配对的癌旁组织各120份,采用免疫组化SP法检测上述组织中CTHRC1蛋白的表达情况;分析CTHRC1蛋白表达与乳腺癌临床病理特征的关系。结果在120份乳腺癌组织中,CTHRC1蛋白阳性表达率为73.3%(88/120),高于癌旁组织的57.5%(69/120),差异有统计学意义(P﹤0.05);CTHRC1蛋白表达在不同年龄、肿瘤直径的患者中比较,差异无统计学意义(P﹥0.05),而在不同淋巴结转移、临床分期、分子分型和组织学分级的患者中比较,差异有统计学意义(P﹤0.05)。结论 CTHRC1蛋白在乳腺癌的发生、发展中可能发挥着一定的作用,对乳腺癌的临床诊断、不良生物学行为的预测有一定的指导意义。

BRAF V600E和TERT启动子突变与甲状腺乳头状癌临床病理特征的关系

目的探讨鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)V600E和端粒酶逆转录酶(TERT)启动子突变与甲状腺乳头状癌(PTC)临床病理特征之间的关系。方法采用聚合酶链式反应(PCR)直接测序检测326例PTC患者肿瘤组织的BRAF V600E和TERT启动子的突变情况,并分析其与临床病理特征之间的关系。结果 BRAFV600E突变率为82.52%(269/326),TERT启动子突变率为3.37%(11/326),其中C228T位点突变9例,C250T位点突变2例,BRAF V600E和TERT启动子同时突变者10例(3.07%)。单因素分析结果显示BRAF V600E基因突变与PTC患者年龄及是否肿瘤复发/远处转移有关(P<0.05),TERT启动子突变与患者年龄、肿瘤最大径、是否甲状腺腺外侵犯、T分期、AJCC分期及是否肿瘤复发/远处转移有关(P<0.05)。BRAF V600E和TERT启动子同时突变与患者年龄、肿瘤最大径、是否甲状腺腺外侵犯、T分期及AJCC分期有关(P<0.05)。结论 PTC患者肿瘤组织BRAF V600E和TERT启动子同时突变时提示肿瘤侵袭性高。

儿童朗格汉斯细胞组织细胞增生症的BRAF-V600E基因突变及临床意义

目的探讨儿童朗格汉斯细胞组织细胞增生症(LCH)的BRAF-V600E基因突变的意义。方法采用实时荧光定量PCR技术检测26例儿童LCH患儿石蜡包埋组织样本中的BRAF-V600E基因突变情况,并回顾性分析BRAF-V600E基因突变与临床特征及预后的关系。结果 25例患儿接受正规化疗,2年总生存率(OS)及无事件生存率(EFS)分别为100%、88%。70%(18/26)的病理标本来自骨组织,BRAF-V600E基因突变阳性率达50%(13/26)。BRAF-V600E基因突变与LCH患儿年龄、性别、受累器官、临床分类、早期治疗效果、复发情况以及2年OS及EFS均无相关性(P>0.05),但与LCH的临床分组相关(P<0.05)。结论 LCH患儿总体生存率较高,BRAF-V600E基因突变发生率高,BRAF-V600E基因突变与LCH临床分组相关。