LAG3分子对泡球蚴感染小鼠肝脏B淋巴细胞亚群及其功能的影响

目的 探究淋巴细胞活化基因-3(Lymphocyte activation gene-3,LAG3)分子对泡球蚴感染小鼠肝脏B淋巴细胞亚群及其功能的影响。方法 将野生型(C57-wild-type, WT)和LAG3基因敲除(LAG3-knockout, LAG3-KO)小鼠经肝门静脉注射泡球蚴原头节,感染12周免疫组织化学染色观察小鼠肝脏CD19和α-SMA表达及定位,流式细胞术检测小鼠肝脏B细胞及其各亚群和表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子的表达情况。结果 泡球蚴感染12周小鼠肝脏LAG3-KO组CD19阳性区及面积占比略高于WT组,但差异均无统计学意义。α-SMA在LAG3-KO组阳性区及面积占比显著高于WT组(t=-3.224、-3.227,P均<0.05)。LAG3-KO组肝脏B细胞表达CD80和MHC-Ⅱ分子的比例显著上调,差异具有统计学意义(t=-2.379、-3.321,P均<0.05)。LAG3-KO组B2细胞占比显著高于WT组,差异有统计学意义(t=-2.695,P<0.05)。LAG3-KO组B1b细胞表达CD80比例亦显著上调,差异具有统计学意义(t=-5.315,P<0.001),而B2细胞表达CD80比例显著低于WT组,且差异具统计学意义(t=2.806,P<0.05)。LAG3-KO组B2细胞表达MHC-Ⅱ分子显著上调,且具统计学差异(t=-4.227,P<0.01)。结论 泡球蚴感染中期12周,LAG3分子影响小鼠肝脏B细胞亚群及功能,并以B2型淋巴细胞尤为显著,LAG3对B细胞的活化以及MHC-Ⅱ类分子表达产生抑制作用,提示其可能参与泡球蚴感染下的B细胞耗竭。

LAG3对多房棘球蚴感染小鼠模型CD8^(+)T细胞免疫功能调节作用的研究

目的研究淋巴细胞激活基因3(Lymphocyte activation gene 3,LAG3)对多房棘球蚴慢性感染小鼠CD8^(+)T细胞免疫功能的调节作用。方法取C57BL/6野生型(Wild-type,WT)和LAG3缺陷型(Knock-out,KO)小鼠各10只,每只小鼠经肝门静脉接种3000个多房棘球蚴原头节建立多房棘球蚴感染模型。感染12周后,分别取两组小鼠肝脏和脾脏组织,采用苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色观察肝脏病灶周围炎性细胞浸润和病理表现,通过免疫组织化学观察肝脏病灶周围“炎症微环境”与脾脏中CD8^(+)T的比例。收集两组小鼠肝脏与脾脏淋巴细胞,采用流式细胞术筛选不同CD8^(+)T细胞亚群,检测CD8^(+)T细胞、效应记忆CD8^(+)T细胞(Effector memory CD8^(+)T cell,CD8^(+)Tem)、中心记忆CD8^(+)T细胞(Central memory CD8^(+)T cell,CD8^(+)Tcm)、初始CD8^(+)T细胞(Naive CD8^(+)T cell,CD8^(+)Tn)比例与绝对数,以及分泌细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素10(IL-10)和白细胞介素17A(IL-17A)的比例。通过多房棘球蚴虫体蛋白体外刺激两组小鼠肝脏淋巴细胞,采用流式细胞术检测CD8^(+)T细胞分泌细胞因子IFN-γ、IL-10和IL-17A的比例。结果HE染色结果显示,与野生型小鼠比较,LAG3缺陷型小鼠肝脏形成的炎性病灶数量增多,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学结果显示,与野生型小鼠比较,LAG3缺陷型小鼠肝脏病灶周围CD8^(+)T细胞募集升高,差异有统计学意义(P<0.05);LAG3缺陷型小鼠脾脏CD8^(+)T细胞募集有降低的趋势,差异无统计学意义(P>0.05)。流式细胞术结果显示,与野生型小鼠比较,LAG3缺陷型小鼠肝脏效应记忆型CD8^(+)T细胞比例有升高的趋势,差异无统计学意义(P>0.05);脾脏CD8^(+)T细胞比例降低,脾脏CD8^(+)Tem表型比例升高,差异均有统计学意义(P<0.01)。LAG3缺陷型小鼠肝脏和脾脏CD8^(+)T细胞分泌TNF-α和IL-10能力均增强,差异均有统计学意义(P<0.05)。多房棘球蚴的虫体蛋白体外刺激肝脏淋巴细胞实验结果显示,与野生型小鼠比较,LAG3缺陷型小鼠CD8^(+)T细胞分泌IFN-γ、IL-10比例升高,差异均有统计学意义(P<0.05);LAG3缺陷型小鼠CD8^(+)T细胞分泌IL-17A的能力有升高趋势(P>0.05)。结论在小鼠多房棘球蚴慢性感染中,LAG3可抑制肝脏和脾脏CD8^(+)T细胞免疫应答能力,调节炎症反应。

多房棘球绦虫基因组DNA三种提取方法的比较

目的综合比较95℃水浴法、碱裂解法及离心柱法提取多房棘球绦虫虫体基因组DNA的质量差异,筛选出适用于PCR鉴定多房棘球绦虫线粒体DNA分型的DNA提取方法。方法无菌条件下取适量多房棘球绦虫原头节(Protoscoleces,PSCs)、囊壁组织样本为实验材料,分别采用95℃水浴法、碱裂解法及离心柱法提取虫体样本中的基因组DNA,检测其浓度与A260/A280比值,并以提取的DNA为模板,通过PCR扩增多房棘球绦虫核基因延伸蛋白样蛋白(Ezrin/radixin/moesin-like protein,elp)和线粒体基因细胞色素b(Cytochrome b,cob)、NADH脱氢酶亚基2(NADH dehydrogenase subunit 2,nad2)和细胞色素c氧化酶亚基I(Cytochrome c oxidase subunit 1,cox1)的片段,综合比较3种方法提取的基因组DNA扩增效果。结果3种方法均可从PSCs中提取出基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳和核酸定量结果显示离心柱法提取的基因组DNA A260/A280比值最高,差异具有统计学意义(P<0.01),且在加样模板总量一致的情况下,以离心柱法提取的PSCs DNA为模板扩增的cob、nad2和cox1基因产物电泳条带清晰、明亮,片段长度准确;而使用95℃水浴法和碱裂解法提取的PSCs基因组DNA仅有效扩增出cob基因条带。通过离心柱法提取的囊壁组织DNA为模板仅扩增出elp基因片段,小鼠组织基因组DNA未扩增出任何虫体的目的基因片段。结论使用离心柱法从多房棘球绦虫PSCs中提取的基因组DNA质量最佳,能够有效扩增出虫体线粒体基因片段,且无宿主来源细胞的污染,可满足后续实验室对多房棘球绦虫不同虫株的基因型鉴定研究。

LAG3缺陷对多房棘球蚴感染小鼠自然杀伤细胞功能及肝纤维化的影响

目的探讨淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3,LAG3)缺陷(LAG3^(⁃/⁃))对多房棘球蚴感染小鼠自然杀伤(natural killer,NK)细胞功能及肝纤维化的影响。方法取体质量为(20±2)g的C57BL/6小鼠,分为LAG3^(⁃/⁃)组和野生型(wild type,WT)组,分别经肝门静脉接种3000个多房棘球蚴原头节。感染后12周,取小鼠肝脏制备肝脏组织切片,天狼星红染色观察肝脏病灶和纤维化程度。分离小鼠肝脏和脾脏淋巴细胞,流式细胞术检测小鼠肝脏和脾脏NK细胞比例,NK细胞表面CD25、CD44和CD69分子表达水平,以及γ干扰素(interferonγ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-4、IL-10、IL-17A等相关细胞因子分泌水平。结果天狼星红染色结果显示,与WT组相比,LAG3^(⁃/⁃)组小鼠肝脏病灶周围炎性细胞带增宽、纤维化结缔组织增生,且呈现较多胶原纤维沉积。流式细胞术检测结果显示,LAG3^(⁃/⁃)组小鼠肝脏(6.29%±1.06%vs.11.91%±1.85%,P<0.0001)和脾脏NK细胞比例(4.44%±1.22%vs.5.85%±1.10%,P>0.05)均低于WT组;LAG3^(⁃/⁃)组小鼠肝脏NK细胞表面CD44分子平均荧光强度显著高于WT组(t=-3.234,P<0.01),而LAG3^(⁃/⁃)组和WT组小鼠肝脏和脾脏NK细胞表面CD25和CD69分子平均荧光强度差异均无统计学意义(P均>0.05)。LAG3^(⁃/⁃)组和WT组小鼠肝脏NK细胞分泌IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-17A的比例差异均无统计学意义(t=-0.723、-0.659、-0.263、-0.455、0.091,P均>0.05);LAG3^(⁃/⁃)组小鼠脾脏NK细胞分泌IFN-γ的比例显著高于WT组(58.40%±1.64%vs.50.40%±4.13%;t=-4.042,P<0.01),但分泌TNF-α、IL-4、IL-10、IL-17A的比例差异均无统计学意义(t=-1.902、-1.333、-1.356、0.529,P均>0.05)。结论在多房棘球蚴感染小鼠过程中,LAG3^(⁃/⁃)促进脾脏NK细胞高分泌IFN-γ,可能参与逆转NK细胞免疫功能,从而导致肝脏纤维化加重。

多房棘球蚴感染对小鼠脾脏自然杀伤细胞Tim 3表达的影响

目的探讨多房棘球蚴感染对小鼠脾脏自然杀伤(natural killer,NK)细胞Tim3及其与免疫检查点分子2B4和LAG3共表达的影响。方法取体质量为(20±2)g的C57BL/6小鼠,随机分为高剂量感染组(15只)、低剂量感染组(13只)和对照组(11只),高、低剂量感染组分别经肝门静脉接种2000、50个多房棘球蚴原头节,对照组经肝门静脉注射等量生理盐水。分别于感染后12、24周收集小鼠脾脏细胞,采用流式细胞术检测小鼠脾脏NK细胞Tim3表达及其与2B4和LAG3共表达水平。结果多房棘球蚴感染后12周,各组小鼠脾脏NK细胞Tim3表达比例及其与2B4共表达比例差异有统计学意义(F=13.559、12.465,P均<0.01);低剂量感染组小鼠脾脏NK细胞Tim3表达比例[(23.84±2.28)%]高于高剂量感染组[(15.72±3.67)%]和对照组[(16.14±3.83)%](P均<0.01);低剂量感染组小鼠脾脏NK细胞Tim3和2B4共表达比例[(22.20±2.13)%]高于高剂量感染组[(14.17±3.81)%]和对照组[(15.20±3.77)%](P均<0.01)。多房棘球蚴感染后24周,各组小鼠脾脏NK细胞Tim3表达比例及其与2B4共表达比例差异有统计学意义(F=5.243、4.659,P均<0.05);高剂量感染组小鼠脾脏NK细胞Tim3表达比例[(20.55±7.04)%]、Tim3和2B4共表达比例[(20.98±7.12)%]均低于对照组[(31.38±3.19)%、(31.25±3.06)%](P均<0.05),低剂量感染组小鼠脾脏NK细胞Tim3表达比例[(26.80±6.47)%]、Tim3和2B4共表达比例[(26.48±6.48)%]与对照组差异均无统计学意义(P均>0.05)。感染后12、24周,各组小鼠脾脏NK细胞Tim3和LAG3共表达比例差异均无统计学意义(F=2.283、0.375,P均>0.05)。低剂量感染组中,多房棘球蚴感染后12、24周小鼠脾脏NK细胞Tim3表达比例、Tim3和2B4共表达比例差异均无统计学意义(t=-1.137、-1.658,P>0.05);感染后24周,小鼠脾脏NK细胞Tim3和LAG3共表达比例较感染后12周上调(t=-5.261,P<0.01)。高剂量感染组中,多房棘球蚴感染后12、24周小鼠脾脏NK细胞Tim3表达比例差异无统计学意义(t=-1.546,P>0.05);但感染后24周,小鼠脾脏NK细胞Tim3和2B4共表达比例、Tim3和LAG3共表达比例均较感染后12周小鼠上调(t=-2.425、-4.745,P均<0.05)。结论NK细胞表面Tim3表达及其与LAG和2B4共表达均受多房棘球蚴不同感染剂量及不同病程阶段影响,并在多房棘球蚴病病程中呈现出不同表型。NK细胞在多房棘球蚴感染后随病程进展形成免疫抑制表型趋势,利于多房棘球蚴免疫逃逸及慢性寄生。

多房棘球蚴感染小鼠腹腔ST2^(+)T细胞亚群功能及其免疫检查点分子表达变化

目的探讨多房棘球蚴感染对小鼠腹腔ST2^(+)T细胞亚群功能及其免疫检查点分子表达的影响。方法11只BALB/c小鼠随机分为感染组(5只)、对照组(6只)。感染组每鼠经肝门静脉接种4000个多房棘球蚴原头节,对照组注射等量的生理盐水。感染24周后小鼠腹腔内注入RPMI 1640,取腹腔内液体,离心后收集淋巴细胞,采用流式细胞术筛选小鼠腹腔不同T细胞亚群,检测生长刺激表达基因2蛋白(ST2)的表达变化,比较不同ST2^(+)T细胞亚群功能和表达免疫检查点分子杀伤细胞凝集素样受体G1(KLRG1)、淋巴细胞激活基因-3(LAG3)和程序性死亡受体-1(PD-1)的细胞比例与绝对数,及分泌细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)和IL-17A的细胞比例与绝对数。采用SPSS 25.0软件进行统计学分析,采用独立样本t检验。结果感染后24周,感染组小鼠腹腔内可见囊泡状或实体病灶,ST2^(+)CD4+T细胞绝对数为(5.06±3.06)×10^(4),记忆ST2^(+)CD4+T细胞绝对数为(4.66±3.18)×10^(4),均高于对照组的(3.31±2.77)×10^(3)和(3.27±2.77)×10^(3)(t=3.442、3.035,均P<0.05);且感染组小鼠腹腔记忆ST2^(+)CD4+T细胞比例为(22.78±6.05)%,绝对数为(4.66±3.18)×10^(4),均高于非记忆ST2^(+)CD4+T细胞比例[(6.68±1.25)%]和绝对数[(3.88±5.20)×10^(3)](t=5.830、2.962,P<0.01、0.05);感染组小鼠腹腔记忆ST2^(+)CD8+T细胞比例为(7.03±1.09)%,高于非记忆ST2^(+)CD8+T细胞的(4.10±1.57)%(t=3.417,P<0.01)。感染小鼠中表达KLRG1、LAG3和PD-1的记忆ST2^(+)CD4+T细胞绝对数分别为(2.77±1.41)×10^(3)、(5.52±3.95)×10^(3)、(6.59±3.75)×10^(3),均高于对照组的(3.66±6.42)×10^(2)、(1.67±0.72)×10^(2)、(1.69±1.49)×10^(3)(t=3.760、3.356、2.956,P<0.01、0.05、0.05)。感染组小鼠分泌IFN-γ的记忆ST2^(+)CD4+T、ST2^(+)CD8+T细胞比例为(5.48±1.33)%和(16.24±4.08)%,均低于对照组的(14.82±3.04)%和(44.70±5.31)%(t=-6.325、-9.786,均P<0.01);感染组小鼠分泌IL-4的记忆ST2^(+)CD8+T细胞比例为(13.10±3.60)%,高于对照组的(4.59±0.36)%(t=5.264,P<0.01)。结论多房棘球蚴感染小鼠腹腔T细胞和记忆T细胞表面ST2表达上调,且表达记忆ST2^(+)T细胞KLRG1、LAG3和PD-1分子的比例上调伴随IFN-γ分泌能力减弱,提示记忆ST2^(+)T细胞存在免疫功能耗竭。