不同基因型戊型肝炎病毒重组蛋白的抗原性分析

目的 :探讨不同基因型和亚型戊型肝炎病毒 (HEV)重组蛋白氨基酸序列的变化对HEV抗原性的影响 ,筛选出最佳的HEV抗原用于戊型肝炎的免疫诊断。方法 :用已知序列的HEV基因工程表达蛋白作为包被抗原 ,对已知血清标本进行酶联免疫吸附试验测定。结果 :6种不同抗原对 3 0份正常献血者血清无抗原性 ,对 17份急性戊型肝炎病人血清和 5份实验感染动物血清均呈阳性反应 ,但血清抗体滴度的高低与所用抗原的基因型有关 ,尤其是受到该抗原第 76位氨基酸变化的影响。结论

轮状病毒新敏感细胞的筛选

轮状病毒(RV)的细胞培养问题尚未完全解决,其原因之一可能与敏感细胞较少有关。为此,我们进行了RV新敏感细胞的筛选,发现恒河猴胚肾传代细胞Frhk-4感染不同血清型的人和动物RV标准株Wa、DS-1、YO、ST-3、SA-11和UK后,37℃旋转或静止培养均能产生明显CPE。培养物经ELISA测定含RV抗原,用PAGE检测有特征性RV核酸图型,电镜超薄切片检查感染细胞可见RV颗粒,证实Frhk-4是RV的敏感细胞,这在国内外尚未见报道。同时与MA104和CV-1细胞的比较研究表明,三种细胞对Wa和DS-1的敏感性及增殖滴度,以CV—1最高,Frhk-4次之,MA-104最低。

病毒空斑技术的研究和应用概况

病毒空斑技术有细胞单层法和琼脂细胞悬浮法,近年又建立了不需预制细胞单层的速成单层法。凝胶添加物的使用可促进空斑形成,显斑方法的改进包括采用荧光、酶标和放射性同位素技术,使非CPE病毒的空斑研究日趋方便。空斑技术除用于测定病毒效价、感染性核酸、病毒感染或转化细胞外,尚可获取病毒克隆、筛选ts突变株及检测病毒抗体、干扰素或其它抗病毒药物。

协同凝集试验检测轮状病毒抗原的研究

作者收集346份粪便标本,进行协同凝集试验(CoA)检测轮状病毒(RV)抗原的研究,结果表明建立的 RV-CoA 有较好的特异性、敏感性和重复性,粪便标本用氯仿抽提、10%SPA 稳定液吸收、再与1%白蛋白0.1%吐温20混匀后进行 RV-CoA 检测,能有效控制非特异性凝集。RV-CoA 的阳性率与电镜法和 PAGE 法相比,无显著差异,但明显高于 ELISA 法。在 RV 流行季节,应用 RV-CoA 进行婴幼儿 RV 腹泻的快速诊断,可在40min 内出结果,阳性率为68.91%。RV-CoA 简便、快速、经济,适用于基层医院开展实验诊断和现场流行病学调查。

轮状病毒细胞培养的若干研究

轮状病毒(RV)细胞培养问题迄今尚未完全解决。为此,我们从筛选RV 敏感细胞和改变 RV 培养条件入手研究,发现恒河猴胚肾传代细胞 Frhk-4对不同血清型的人和动物 RV 标准株敏感,感染后有明显 CPE。将刀豆素 A(Con A)加入营养液中,在细胞生长过程中预处理细胞时,能显著增加 Wa 株的空斑数目和增殖滴度,加速 CPE 的发展,而用 Con A 预处理病毒、加入病毒接种液或加入凝胶覆盖物时,则明显抑制 Wa 株的空斑形成。此外,我们发现,Wa 株经细胞培养多次传代后,有变异株产生,所分离到的3个克隆株的基因图谱与原始 Wa 株有明显差异。对此,国内外均未见报道。

核酸电泳同时检测粪便中的轮状病毒和腺病毒

报告用聚丙酰凝胶电泳同时检测225份腹泻粪便标本中的轮状病毒(RV)和腺病毒(Ad)的结果。在秋冬季收集的婴幼儿腹泻标本中,以检出 RV 为主,且流行优势株在不同年份出现明显变化,但 Ad 的检出率也高达11.2%;在夏季收集的成人腹泻标本中,以检出 Ad 为主,检出率为39.4%,且发现有核酸分子量不同的 Ad 同时流行。结果表明,除 RV 外,Ad 也是我国病毒性腹泻的重要病原。

基础医学实验课改革初探

一、改革势在必行医学是一门实践性很强的科学。不少医学院校的毕业生的调查表明,大多数毕业生的基础理论和基本知识比较扎实,但是刚毕业时的操作技能和动手能力比理论知识差,适应专业工作的时间较长,这一问题暴露了医学教学过程中,实践性教学环节的薄弱和不足,“重理论、轻实验”的教学现象尚未得到纠正。

速成单层法病毒空斑技术影响因素的探讨

速成单层法病毒空斑技术是一种新的病毒空斑技术。本文以脊髓灰质炎病毒Ⅰ型（PV Ⅰ）Mahoney株为代表,探讨速成单层法病毒空斑技术的实验条件。结果表明,选用HeLa细胞、以0.02％EDTA消化、加含20％小牛血清的营养液制成细胞悬液,用国产16孔组织培养板、每孔加细胞4×105/0.4ml,置CO2培养箱吸附贴壁60～90min,并取国产琼脂糖作覆盖物凝胶是速成单层法PV Ⅰ空斑滴定的较佳条件,这对其它病毒-细胞系统的速成单层法空斑试验也具较大的参考价值。

脊髓灰质炎病毒对非灵长类细胞的感染性

传统认为脊髓灰质炎病毒(PV)仅能在人或灵长类细胞中增殖,本文报道一株对PV高度敏感的非灵长类动物细胞——兔子宫内膜上皮传代细胞系(ZMRUE-85)。经与HeLa、Hep-2、FL、MERN和MA104等细胞的比较研究,证实PV在ZMRUE-85细胞上能产生典型的溶细胞型病变和空斑,TCID_(90)和空斑滴度均近似或高于上述5种人源或猴源细胞,这对PV宿主范围、受体本质及其感染性和致病性的进一步研究可能有一定价值。

轮状病毒半微量空斑技术的研究

本文以轮状病毒(RV)Wa株和SA-11株为代表,采用国产16孔组织培养板,进行了RV半微量空斑技术的研究,并与常规培养瓶空斑法和TCID_(50)滴定法作了比较。结果表明,RVWa株与SA-11株在MA_(104)细胞上的空斑特征和感染滴度有较大差异,半微量法空斑数目与病毒浓度呈良好的线性关系,且重复试验能获得相近空斑滴度,显示了经济方便、稳定可靠的优点。此外,应用空斑中和试验测定了RV型特异性抗血清的中和效价,并首次注意到用活性染料中性红染色的空斑标本经福尔马林固定后可长期保存不褪色。

四种方法检测粪便中轮状病毒的比较

用电镜(EM)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和协同凝集试验(CoA)等四种方法检测腹泻患儿粪便中轮状病毒,在20份四种方法全检标本中,EM 阳性13份,PAGE16份,ELISA14份,CoA16份。在70份PAGE、ELISA 和 CcA 三种方法检测标本中,PAGE 阳性率为76%,ELISA60%,CoA79%。以 PAGE 为参照,ELISA 和 CoA 两法的敏感性各为75%和91%,特异性各为88%和59%,诊断准确度各为79%和83%。本文对四种方法的优缺点作了评价。

与人类关系密切的7种动物对戊型肝炎病毒易感性的初步研究

目的 用双抗原夹心法ELISA (DS -ELISA)和逆转录巢式PCR法 (RT -nPCR)研究与人类生活关系密切的猪、犬、山羊、鸡、鸭、鸽子和兔等 7种动物对戊型肝炎病毒 (HEV)的易感性。方法 用多基因型HEV重组蛋白建立检测HEV抗体的DS -ELISA ,并用于 5 91份猪、警犬、家犬、宠物犬、山羊、鸡、鸭、鸽子和兔等多种动物血清标本的HEV抗体检测 ;用HEV多基因型通用性引物RT -nPCR扩增 14 3份犬血清标本HEVRNA。结果 在猪、家犬和宠物犬血清标本中检测到HEV抗体 ,阳性率分别为 4 3 93%、15 19%和 4 6 5 % ,但在警犬、山羊、鸡、鸭、鸽子和兔血清标本中未检测到HEV抗体 ;14 3份犬血清标本用RT -nPCR未扩增出HEVRNA。结论 用多基因型HEV重组蛋白建立的双抗原夹心法ELISA适用于多种动物血清标本HEV抗体的检测 ;猪和犬对HEV易感 ,在HEV传播中可能起重要作用。

戊型肝炎病毒Ⅰ、Ⅱ与Ⅲ、Ⅳ基因型B细胞抗原表位的异同

目的 :制备戊型肝炎病毒 (HEV)缅甸株和墨西哥株ORF2重组蛋白 (p16 6Bur和p16 6Mex)的单克隆抗体(McAbs) ,用于分析HEV不同基因型B细胞抗原表位的特点。方法 :将免疫BALB C小鼠脾细胞与SP2 0骨髓瘤细胞融合 ,获得分泌抗 p16 6Bur和抗 p16 6MexMcAbs的杂交瘤细胞株 ,然后采用ELISA和免疫印迹法测定McAbs与不同基因型HEVORF2编码蛋白p16 6的免疫反应性。结果 :获得 4株杂交瘤细胞株 ,即分泌抗 p16 6BurMcAbs的 2C2 、2B1 以及分泌抗 p16 6MexMcAbs的D8G1 0 和E5E1 2 ,其中 2B1 分泌的McAb仅能与第Ⅰ、Ⅱ基因型编码的重组蛋白结合 ,而其余 3株分泌的McAbs既能与I、II基因型HEV的p16 6重组蛋白发生反应 ,也能与III、IV基因型的p16 6蛋白反应。结论 :HEV第Ⅰ、Ⅱ基因型与Ⅲ、Ⅳ基因型ORF2编码蛋白既有共同又有不同的B细胞抗原表位。

肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型分离株的VP1基因特征分析

目的:探讨苏皖地区手足口病(HFMD)患者肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)分离株的VP1基因特征。方法:采集南京市、马鞍山市2009至2010年HFMD患者临床标本进行病毒分离和RT-PCR鉴定;扩增并测定VP1基因序列;从GenBank中选取EV71和CA16不同基因型参考毒株,利用生物信息学软件进行同源性比对和系统进化树分析。结果:共分离到9株EV71和4株CA16,EV71分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为96.5%～99.8%和99%～100%;CA16分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性为96.2%～98.5%和99.3%～100%;系统进化树分析显示,9株EV71全部属于C4a基因亚型,而4株CA16则全部属于B1b基因亚型。结论:2009至2010年苏皖地区分离到的EV71和CA16毒株分别属于C4a和B1b基因亚型,与国内其他地区HFMD病原学及分子进化研究结果一致,有望成为疫苗候选株作进一步研究。

戊型肝炎病毒Ⅳ型中国恒河猴动物模型的建立

目的研究中国恒河猴是否是戊型肝炎病毒(HEV)Ⅳ型的敏感动物模型。方法用Ⅳ型HEV RNA阳性的人粪便提取液感染2只中国恒河猴,动态观察动物感染前后ALT和肝组织学改变及血清、粪便HEV RNA。结果2只恒河猴于感染HEVⅣ型后第5周出现血清ALT升高,持续6周恢复正常;肝组织出现急性肝损伤样改变;感染3周于血清中检出HEV RNA,分别于第32天和第40天粪便中检出HEV RNA。结论中国恒河猴是HEVⅣ型的敏感动物模型。

树状DNA杂交技术在戊型肝炎病毒检测中的应用

目的 研究树状DNA杂交 (DDH)技术在戊型肝炎病毒 (HEV)检测中的应用。方法 以逆转录巢式PCR法 (RT nPCR)检测筛选HEV阳性标本 ,逆转录产物进行DDH。研究DDH技术检测HEV病毒的敏感性和通用性。结果 2 5份HEV阳性标本的逆转录产物DDH检测均显阳性 ,HEV 5个不同基因型和亚型逆转录产物DDH检测也呈阳性。结论 RT

丙型肝炎病毒不同编码区重组抗原在抗体检测中的应用

目的 探讨丙型肝炎病毒 (HCV)不同编码区重组蛋白片段的免疫反应性及其在抗体检测中的应用。方法 分别以 4种HCV单片段抗原 (C、NS3、NS4或NS5 )检测抗 HCV抗体阳性血清 ;以 4种单片段抗原的混合物 (MIX)检测抗 HCV抗体阳性血清、大学生体检血清和抗 HCV抗体阴性质控血清。结果 90份抗 HCV抗体阳性血清中共有 75份可与一种或多种单片段抗原反应 ,阳性率分别为 70 .0 % (C)、6 1.1% (NS3)、5 2 .2 % (NS4 )、4 4 .4 % (NS5 ) ,其中仅与C、NS3、NS4和NS5一种抗原发生反应的分别有 8份、1份、2份和 3份血清标本 ;90份抗 HCV阳性血清经MIX抗原检测 ,阳性率为 83.3% (75 / 90 ) ;10 0份大学生血清和39份阴性质控血清经混合抗原检测均阴性。结论 HCV不同编码区重组蛋白片段有不同的免疫反应性 ,在发展抗 HCV抗体诊断试剂时 ,应采用各种不同编码区的混合抗原。

戊型肝炎病毒第4基因型中国株ORF2编码蛋白的抗原表位分析

以戊型肝炎病毒（HEV）第4基因型中国株ORF2编码蛋白p166Chn制备单克隆抗体（McAbs）,同时制备20个N端或C端逐渐截短的p166Chn截短蛋白,与7种不同基因型和亚型的p166蛋白一起,通过ELISA、免疫印迹（Western blot）以及竞争抑制实验对主要存在于我国的HEV第4基因型毒株进行抗原表位分析。结果发现所制备的McAbs与p166Chn截短蛋白的免疫反应有两种类型,以1G10为代表的McAbs能与N端不短于aa477、C端不短于aa613的截短蛋白反应,其针对的抗原表位是构象依赖型表位,依赖于aa477-aa613肽链区段;而McAb2F11则能与N端不短于aa474、C端不短于aa617的截短蛋白反应,其针对的抗原表位也是构象表位,但需依赖于较长的肽链区段（aa474-aa617）。竞争抑制实验显示两类McAbs互不抑制,进一步证实了所发现的两个抗原表位在空间位置上的不同。更有意义的是,两类McAbs均能与其他不同HEV基因型和亚型来源的p166重组蛋白发生阳性反应,表明这两个抗原表位是HEV基因型共同性的,可以在世界各国分布的不同基因型HEV毒株中诱导交叉免疫。

载体和基因片段的选择对戊型肝炎病毒基因免疫抗原表达的影响

目的比较不同载体和不同大小的目的基因片段对戊型肝炎病毒(HEV)基因免疫抗原表达的影响,为基于HEV中和抗原表位的HEV基因免疫提供一定的依据。方法将含Ⅳ型HEV中国株中和抗原表位的p166和p179片段编码基因分别克隆入pTR421和pCDNA3.1两种真核表达载体,用脂质体介导基因转染HepG2人肝癌细胞系,经间接免疫荧光和Western blot分析以及将质粒注射小鼠局部肌肉组织后经免疫组织化学染色检测,分析目的基因在体内外的表达水平。结果成功构建了pTR421-166、pTR421-179、pCDNA3.1-166和pCDNA3.1-179四种重组质粒,经限制性内切酶双酶切和核苷酸测序鉴定,编码基因正确无误;pTR421-179转染的细胞以及注射小鼠的局部肌肉组织可以检测到p179的表达,而pCDNA3.1-179、pCDNA3.1-166以及pTR421-166均检测不到目的基因在体内、外的抗原表达。结论载体和目的基因片段的选择显著影响HEV抗原在体内、外的表达,直接关系到基因免疫的成功与否。

抗戊型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建与筛选

目的 :构建人抗戊型肝炎病毒 (HEV)噬菌体抗体库 ,筛选人源中和性抗HEV的单克隆抗体 (mAb)。方法 :取抗HEV抗体阳性的 6例HE患者静脉血 ,分离淋巴细胞 ,提取细胞总RNA后逆转录。用一组人IgGFab基因特异性引物 ,分别扩增IgGκ0轻链与重链Fd段基因。将κ轻链与Fd段基因先后克隆入噬菌体载体pComb3的相应位点 ,经电穿孔法转化大肠杆菌XL1 Blue ,再以辅助噬菌体VCSM13超感染 ,构建人抗HEV噬菌体抗体库。采用独特的 5轮筛选法 (逐渐降低抗原包被量 ,严格洗脱条件 ) ,以固相化的 4种含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原 ,筛选人噬菌体抗体库 ,并以ELISA鉴定噬菌体抗体。结果 :经数次电转化构建了容量为1.9× 10 7重组率为 80 %的κ轻链基因库 ;容量为 1.8× 10 7重组率为 2 0 %的Fab基因库。以含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原特异淘筛 5次 ,出现特异富集。ELISA鉴定第 5轮筛选产物 ,得到 4株与HEVORF2重组混合抗原具有较高亲和力的Fab噬菌体抗体 ,可能为中和抗体。结论 :成功地构建了人抗HEV噬菌体抗体库 ,并获得人源抗HEV特异性噬菌体抗体。