pEGFP-N3-TRIM22真核表达载体的构建及在HEK293T细胞中的表达

目的构建pEGFP-N3-TRIM22真核表达载体,观察其在293T细胞中的表达特点。方法用RT-PCR法扩增出TRIM22基因编码序列,克隆至真核表达载体pEGFP-N3,通过菌落PCR、双酶切及测序进行鉴定。将pEGFP-N3-TRIM22载体转染293T细胞,通过流式细胞仪、荧光显微镜观察TRIM22-EGFP的表达;通过激光共聚焦,经Lyso Tracker Deep Red及DAPI分别染色溶酶体及细胞核,观察TRIM22-EGFP在293T细胞的分布特点。结果经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,成功构建pEGFP-N3-TRIM22真核表达载体。流式细胞仪检测发现,转染细胞中TRIM22-EGFP+细胞约70%左右。荧光显微镜检测发现,TRIM22-EGFP在293T细胞中能以弥散、小斑点或大颗粒团块3种形式存在。激光共聚焦检测发现,在不同的293T细胞中TRIM22-EGFP可分别优势表达于细胞核、细胞浆,或者在胞核及胞浆均有大量表达。结论 TRIM22-EGFP能以弥散、小斑点或大颗粒团块形式分布于细胞核或细胞浆中。

哮喘儿童诱导痰IL-8、IL-17、白三烯B4检测及临床意义

目的通过检测哮喘儿童白细胞介素(interleukin,IL)-8、IL-17及白三烯B4水平,探讨其在儿童哮喘发病中的作用。方法收集我院2015年8月—2017年3月住院的哮喘患儿66例作为研究对象,同期于我院进行健康体检并排除哮喘疾病的健康儿童30例为正常对照组。收集两组儿童诱导痰标本,采用ELISA法进行IL-8、IL-17及白三烯B4检测。结果哮喘患儿组诱导痰液IL-8、IL-17及白三烯B4含量均高于对照组(F值分别为67.80、54.64和17.36,均P<0.05)。结论 IL-8、IL-17及白三烯B4均参与了哮喘的发病机制,对于儿童哮喘病情变化、诊断和治疗方面的研究提供了进一步探索的基础。

流式细胞仪检测HLA-B27抗原在强直性脊柱炎诊断中的意义

目的经流式细胞仪(FCM)检测外周血T淋巴细胞表面HLA-B27抗原,探讨其在强直性脊柱炎诊断中的临床意义。方法分别用流式细胞仪和微量淋巴细胞毒法检测外周血T淋巴细胞表面HLA-B27抗原并进行对比。结果流式细胞仪检测86例强直性脊柱炎患者标本,79例阳性,微量淋巴细胞毒法检测为76例阳性。流式细胞仪和微量淋巴细胞毒法检测HLA-B27抗原无显著性差异。结论通过流式细胞仪检测HLA-B27抗原,方法简便,稳定性好,重复性高。

TRIM22与HIV衣壳蛋白p24在脑胶质瘤细胞中的表达特点及共定位研究

目的观察外源性三基序蛋白22(TRIM22)与HIV衣壳蛋白p24在U-251脑胶质瘤细胞中的表达特点及共定位情况。方法分别将pEGFP-N3-TRIM22或pDsRed1p24载体转染U-251细胞,通过激光共聚焦显微镜观察TRIM22-EGFP和p24-DsRed1的表达和分布情况。通过激光共聚焦xyz轴扫描,经ImageJ 1.50i软件进行3D结构重建,观察p24-Dsred1在U-251细胞中的分布特点。将pEGFP-N3-TRIM22和pDsRed1p24载体在U-251细胞中共表达,观察TRIM22-EGFP和p24-DsRed1是否存在共定位关系。结果单独转染pEGFP-N3-TRIM22或pDsRed1p24载体时,TRIM22-EGFP和p24-DsRed1在U-251细胞的胞体或突起中均有较高水平的表达;且3D结构重建显示外源性p24-DsRed1可迁移至U-251细胞的足突。在U-251细胞共转染pEGFP-N3-TRIM22和pDsRed1p24载体时,TRIM22-EGFP与p24-DsRed1存在共定位关系,并能以出胞形式脱离细胞。结论 TRIM22与HIV衣壳蛋白p24在U-251脑胶质瘤细胞中存在共定位关系。

医学检验分析前误差的原因及对策

随着近几年临床检验技术不断提高,实验室对于检验的质量管理已经原来越重视。检验数据的准确和快速不但能为临床诊断与治疗提供有力的证据,同时对患者的保护和对医患关系的稳定都有十分重要的社会价值。国外有报道称目前检验过程出现误差在分析前、分析中。

65株临床分离MRSA的SCCmec基因分型及耐药性研究

目的了解临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的葡萄球菌盒染色体(SCCmec)基因型分布特点及耐药状况。方法多重聚合酶链反应(PCR)对MRSA进行SCCmec基因分型;普通PCR对MRSA进行4种耐药基因扩增;应用纸片扩散法测试MRSA对19种抗菌药物的敏感性。结果 SCCmec分型显示60株受试MRSA为SCCmecⅢ型菌株,4株为SCCmecⅣa型菌株,1株未分型。65株MRSA临床株对多种抗菌药物耐药,对氯霉素耐药率(4.62%)相对较低,对利奈唑胺、奎奴普丁/达福普汀、万古霉素、替考拉宁均敏感。4种耐药基因的阳性率分别为aac(6')/aph(2'')93.85%、aph(3')Ⅲ52.31%、tetM 92.31%、ant(4')9.23%。结论临床分离的MRSA SCCmec基因型以Ⅲ型为主,且具有多重耐药的特征,对氨基糖苷类、四环素类耐药基因有较高的携带率,多重PCR可以有效地用于大批量临床分离的MRSA SCCmec分型研究。

Trim22 B细胞表位预测及多克隆抗体制备与鉴定

目的:预测人Trim22的B细胞抗原表位,制备并鉴定其多克隆抗体。方法:利用生物信息学软件分析Trim22的氨基酸序列,确定抗原表位并人工合成多肽。将合成肽与牛血清白蛋白(BSA)偶联,免疫大白兔制备抗Trim22的抗体。经饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,并对抗体进行ELISA、Western blot鉴定。结果:获得抗Trim22的多克隆抗体,抗体效价为1∶16 000,该抗体能特异性地识别包含(382～397)区段的Trim22缺失突变体,同时该抗体不能识别Trim22旁系同源分子Trim5α、Trim6和Trim34α。结论:采用人工合成多肽作为半抗原制备出抗Trim22的多克隆抗体,对研究内源性Trim22与HIV-1衣壳蛋白的相互作用机制具有重要价值。

三基序蛋白34(TRIM34)与微核染色体共定位并阻碍染色体在有丝分裂中期向赤道板的移动

目的观察三基序蛋白34（TRIM34）与微核是否存在共定位关系,及对微核染色体在有丝分裂时移动的影响。方法构建并鉴定TRIM34-p EGFP-N3真核表达载体,转染TRIM34-p EGFP-N3载体至HEK293T细胞,经4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色,用荧光显微镜观察TRIM34与微核间是否存在共定位关系。通过激光共聚焦显微镜技术结合Mito TrackerDeep Red线粒体示踪剂,进一步明确TRIM34、微核与线粒体间的位置关系。观察TRIM34-微核结合体在HEK293T细胞有丝分裂中期与赤道板的位置关系。结果经测序鉴定,成功构建TRIM34-p EGFP-N3真核表达载体。TRIM34-p EGFP-N3载体转染HEK293T细胞后,通过荧光显微镜发现TRIM34与微核可能存在共定位关系。经激光共聚焦显微镜技术进行后续检测发现,存在共定位关系的TRIM34小体与微核间在外形上较一致。TRIM34-微核结合体与线粒体未见明显的共定位关系。在有丝分裂中期,结合TRIM34的微核染色体不能移动至赤道板。结论 TRIM34可以结合微核染色体,阻碍后者在有丝分裂中期向赤道板的移动。

HIV衣壳蛋白P24与TRIM22在HEK293T细胞中的表达及共定位

目的观察人类免疫缺陷病毒(HIV)衣壳蛋白P24与三基序蛋白22(TRIM22)在HEK293T细胞中的共定位情况。方法以慢病毒载体p LP1为模板,通过PCR法扩增p24编码序列,克隆至p DsRed-Monomer-N1真核表达载体。经菌落PCR、双酶切及DNA测序进行鉴定。将p DsRed-Monomer-N1-p24与p EGFP-N3-TRIM22载体共同转染HEK293T细胞,用荧光显微镜观察p24-DsRed-Monomer和TRIM22-EGFP的表达及共定位情况。结果经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,成功构建p DsRedMonomer-N1-p24真核表达载体。通过荧光显微镜检测发现,p24-DsRed-Monomer和TRIM22-EGFP在HEK293T细胞中存在共定位关系。结论 HIV衣壳蛋白P24与TRIM22存在共定位。

围绝经期综合征病人发病的相关因素研究进展及健康教育

围绝经期综合征原称更年期综合征,是围绝经期妇女发病率最高的一种病症针对此将其发病的相关因素的研究进展作一综述,并提出健康教育对策。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCCmec基因分型与耐药性研究

目的了解临床MRSA菌株SCCmec基因型分布和各种基因型的耐药特征。方法采用应用多重聚合酶链式反应(PCR)技术对MRSA进行SCCmec基因分型;采用K-B纸片扩散法检测MRSA抗菌药物敏感性。结果 65株MRSA菌株中包括SCCmecⅢ型60株(92.31%),SCCmecⅣa型4株(6.15%),未分型1株(1.54%)。耐药性分析显示所有菌株对万古霉素、利奈唑烷、替考拉宁和奎奴普丁/达福普汀完全敏感,对氯霉素耐药率较低,各型别间无显著差异(P>0.05)。对其它非β-内酰胺类的抗菌药物,SCCmecⅢ型MRSA菌株表现为多重耐药,其耐药率显著高于SCCmecⅣa型,其中对加替沙星、庆大霉素,利福平,四环素的耐药率有显著差异(P<0.05)。结论 SCCmecIII型菌株为临床分离MRSA主要流行菌株,该型菌株对多种抗生素呈多重耐药。多重PCR对MRSA进行SCCmec基因分型适合临床实验室。

Trim5α对TAB2诱导的NFκB启动子荧光素酶报告基因活性的影响

目的构建人Trim5α的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Trim5α,观察其对TAB2诱导的NFκB启动子荧光素酶报告基因活性的影响。方法提取Hela细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增出Trim5α基因编码区全长片段,克隆到5`-Flag-pcDNA3.1(+),经酶切、菌落PCR及测序进行鉴定。转染HEK293T细胞,Western blot检测Trim5α蛋白的表达,双萤光素酶报告基因系统检测Trim5α对TAB2诱导的NFκB报告基因活化的影响。结果经鉴定,成功构建Trim5α表达载体,该载体可在HEK293T细胞中表达Trim5α,Trim5α对TAB2诱导的NFκB报告基因活化无显著影响。结论 Trim5α对TAB2诱导的NFκB报告基因活化未见显著影响,初步建立了Trim蛋白对NFκB报告基因影响的功能筛选平台。

Trim22缺失突变体真核表达载体的构建

目的构建Trim22缺失突变体的真核表达载体,为进一步研究Trim22与HIV-1衣壳蛋白的相互作用奠定基础。方法以野生型Trim22真核表达质粒为模板,用PCR方法扩增出5种类型Trim22缺失突变体的基因片段,克隆到5`-Flag-pcDNA3.1(+)真核表达载体,通过酶切、菌落PCR及测序进行鉴定。将该载体转染HEK293T细胞,用蛋白印迹及免疫沉淀检测Trim22缺失突变体的蛋白表达。结果通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建5种人Trim22缺失突变体的表达载体,载体均可以在HEK293T细胞中表达。结论成功构建5种人Trim22缺失突变体的真核表达载体,为探寻Trim22与HIV-1衣壳蛋白相互作用的关键结构域奠定了基础。

PKCθ在结核杆菌抗原刺激人γδT细胞NFκB活化中的作用

目的初步探讨PKCθ在结核杆菌抗原(MtbAg)刺激γδT细胞转录因子NFκB活化中的作用。方法 MtbAg刺激健康人外周血单个核细胞(PBMC),获得γδT细胞优势扩增细胞群。PKCθ选择性阻断剂rottlerin(粗糠柴毒素)预处理,MtbAg刺激γδT细胞,通过凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)检测γδT细胞NFκB活性,流式细胞术(FCM)检测γδT细胞活化分子CD69的表达。结果 MtbAg刺激30min,γδT细胞NFκB活性逐渐增加,刺激60min时NFκB活性显著增强;rottlerin使Mt-bAg激发的γδT细胞NFκB活性明显减弱。Rottlerin可显著抑制MtbAg诱导的γδT细胞活化分子CD69的表达(P<0.01)。结论 PKCθ参与MtbAg诱导的γδT细胞转录因子NFκB活化。

高校附属医院检验专业住院医师规范化培训的探索

检验专业住院医师规范化培训是从事检验科工作的医师毕业后教育的一部分,对培训医学检验专业高层次医师,提高临床检验质量和水平极为重要,更是高层次医学检验专家形成过程的基础和关键所在。高校附属医院作为医学院重要的辅助教学单位,承担着住院医师规范化培训的主要任务,为各级医疗机构培训了具有高尚医德、扎实理论基础和临床技能的高水平医学人才。为更好的做好检验专业住院医师规范化培训工作,文章结合自身实际,从建章立制、明确目标、师资建设、言传身教、生物安全教育等五个方面探讨了高校附属医院检验专业住院医师规范培训的体会,为进一步提高住院医师规范化培训质量提供了经验。

医院感染的金黄色葡萄球菌多重耐药机制研究

目的研究医院感染的金黄色葡萄球菌的多重耐药机制,指导临床合理用药。方法对本院感染标本分离出的金黄色葡萄球菌进行药敏试验,聚合酶链反应(PCR)测定mecA、aac(6')/aph(2')、aph(3')-III、ermA、ermC、tetM和tetK基因。结果 MecA基因检测阳性为84株,为MRSA,阳性率48%,其余91株为MSSA;MRSA对12种抗菌药物敏感率均低于MSSA敏感率;MRSA与MSSA对耐药基因携带率各不相同,MRSA高于MSSA。结论医院感染的金黄色葡萄球菌对抗菌药物有很高的耐药性,金黄色葡萄球菌的多重耐药与获得mecA基因紧密相关。

过敏性哮喘急性发作患儿CCL18水平测定及意义

目的探讨哮喘急性发作期患儿血清趋化因子CCL18水平变化及意义。方法将52例支气管哮喘急性发作患儿按病情严重程度分为轻、中、重组,采用ELISA法检测各组治疗前后血清CCL18水平,同时与10例正常人血清CCL18水平作对照。结果中度、重度组治疗前血清CCL18水平明显高于对照组(P<0.01),结论血清CCL18的水平可能与哮喘急性发作的严重程度有关;其在哮喘发病及病情判断中可能起重要作用。