血清14型副猪嗜血杆菌的分离与多克隆抗体制备

【目的】探明引起猪副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)病发病的病原菌,并制备分离病原菌的多克隆抗体,为该病的治疗及疫苗的研发提供技术支撑。【方法】从送检病料分离出保育猪发病病原菌,并对其进行形态观察、生化鉴定与PCR鉴定,明确分离病原菌的类型及血清型;同时使用甲醛对分离病原菌进行灭活后再与弗氏佐剂乳化制备灭活菌体抗原,经肌肉和皮下免疫BALB/C小鼠,制备该分离病原菌的鼠源多克隆抗体;采用饱和硫酸铵沉淀法对制备的多克隆抗体进行纯化,利用SDS-PAGE方法鉴定纯化抗体的纯度,通过免疫荧光进一步检测抗体与抗原的结合效果。【结果】从病料中分离得到1株革兰氏阴性短小杆菌,经形态学观察、生化鉴定与PCR鉴定,分离到的病原菌为血清14型副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS);灭活后的HPS与佐剂乳化后免疫BALB/C小鼠制备得到分离病原菌的多克隆抗体,阳性菌液与纯化后稀释500倍和2000倍的多克隆抗体结合并加入荧光二抗后于显微镜下观察,病原菌发出红色荧光;经Western blot检测,制备多克隆抗体在约13 ku、30 ku和50 ku处有3条清晰条带,Western blot和免疫荧光试验均证实制备的多克隆抗体可与分离病原菌发生特异性反应。【结论】制备的血清14型HPS多克隆抗体可与分离病原菌发生特异性反应。

1株血清7型副猪嗜血杆菌的分离与鉴定

研究旨在确定河南省南阳市一猪场送检样品中的病原,对病例进行流行病学调查和临床症状观察,对送检病料进行细菌分离、纯化、鉴定和基因测序分析等检测。结果显示,送检病料中分离得到一株革兰氏阴性短杆菌,分离菌在常用细菌鉴别培养基上无法生长,在含有NAD的TSA培养基上呈露珠状;纯化得到的分离菌NY2020株和金黄色葡萄球菌共同培养具有"卫星现象";采用副猪嗜血杆菌16S rRNA鉴定引物和血清7型引物均能够扩增出特异性条带。序列分析表明,该分离菌NY2020株与7型副猪嗜血杆菌处于同一进化树分支。研究表明,该分离菌为血清7型副猪嗜血杆菌。

犬细小病毒新乡株的分离鉴定及其VP2基因的序列分析

【目的】探究河南省新乡地区犬细小病毒(Canineparvovirus,CPV)的流行和遗传变异进化情况,为有效防控区域性CPV流行提供参考。【方法】对从新乡地区宠物医院收集的23份疑似患犬细小病毒病的病犬粪便样品和眼、鼻、口、肛拭子预处理后进行PCR检测。将PCR检测结果为阳性的样品采用浸泡、过滤除菌处理后接种于单层猫肾细胞CRFK进行病毒增殖培养,将分离的病毒置于透射电子显微镜下观察。参考GenBank中已收录的国内外CPV不同亚型的毒株序列,经PCR分段扩增、测序后拼接获得病毒全长基因,利用分子生物学软件对病毒基因进行序列分析和氨基酸序列同源性分析。【结果】从送检的样品中成功分离出1株CPV,命名为XX-2022株。该病毒株能使CRFK细胞产生明显病变,导致细胞出现变圆、拉网和脱落。通过透射电镜可观察到典型的病毒粒子,呈圆形或六边形,直径约25 nm,无囊膜。通过PCR分段扩增拼接后获得的病毒全基因组序列全为长4588 bp,CPV系统进化分析结果显示,XX-2022株与Canine/SH/1/2019(MN840830.1)株的亲缘关系较近。利用MegAlign软件对XX-2022株VP2基因推导的氨基酸序列进行分析,该毒株与YANJI-5(MW715601)的VP2氨基酸序列在同一小分支,氨基酸同源性为99.7%。根据CPV的基因分型原则,最终确定XX-2022株CPV属于CPV-2a型。【结论】从临床病料中成功分离出1株CPV,经分析确定为CPV-2a型,研究结果可为新乡地区CPV的流行病学、致病性及生物学特性研究提供依据,为CPV的区域流行及有效防控提供参考,为新疫苗的研发提供地方种毒。