二肽基肽酶4基因沉默对脂多糖诱导肺泡巨噬细胞焦亡的促进作用及其机制

目的观察二肽基肽酶4(DPP-4)基因沉默对脂多糖(LPS)诱导肺泡巨噬细胞焦亡的促进作用,并探讨其可能的机制。方法取对数生长期的MH-S肺泡巨噬细胞系(简称MH-S细胞),随机分为Control siRNA组(转染Control siRNA)、DPP-4 siRNA组(转染DPP-4 siRNA)、Control siRNA+LPS组(转染Control siRNA后加入LPS)、DPP-4 siRNA+LPS组(转染DPP-4 siRNA后加入LPS)。倒置显微镜下观察各组细胞形态是否呈焦亡表现(细胞空泡化、发生聚团及细胞膜破裂),CCK-8法观察细胞增殖活性,乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性实验观察焦亡所致细胞毒性(以LDH释放量表示),Calcein-AM/PI双染法观察细胞死亡情况(以PI阳性细胞率表示),Western blotting法检测细胞焦亡通路标志蛋白核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1 p20亚基(Caspase-1 p20)、焦孔素D-N端(GSDMD-N)及炎症因子白细胞介素18(IL-18)、白细胞介素1β(IL-1β)蛋白相对表达量。取对数生长期的MH-S细胞,随机分为Control siRNA+LPS作用组(转染Control siRNA后加入LPS)、DPP-4 siRNA+LPS作用组(转染DPP-4 siRNA后加入LPS)、Control siRNA+SB203580+LPS作用组(转染Control siRNA后加入p38抑制剂SB203580、LPS)、DPP-4 siRNA+SB203580+LPS作用组(转染DPP-4 siRNA后加入p38抑制剂SB203580、LPS),采用Western blotting法检测细胞p38活化相关指标及焦亡通路标志蛋白表达。结果Control siRNA组细胞无焦亡表现,DPP-4 siRNA组可见少量细胞呈焦亡表现,Control siRNA+LPS组和DPP-4 siRNA+LPS组可见大量细胞呈焦亡表现,以DPP-4 siRNA+LPS组细胞焦亡表现更明显。Control siRNA组、DPP-4 siRNA组、Control siRNA+LPS组、DPP-4 siRNA+LPS组细胞增殖活性依次降低,LDH释放量、PI阳性细胞率及细胞NLRP3、ASC、Caspase-1 p20、GSDMD-N、IL-18、IL-1β蛋白相对表达量均依次升高,组间两两比较P均<0.05。与DPP-4 siRNA+LPS作用组比较,Control siRNA+LPS作用组、Control siRNA+SB203580+LPS作用组、DPP-4 siRNA+SB203580+LPS作用组p-p38/p38、p-NF-κB/NF-κB及NLRP3、Caspase-1 p20、GSDMD-N蛋白相对表达量均降低,以Control siRNA+SB203580+LPS作用组、DPP-4 siRNA+SB203580+LPS作用组降低更明显(P均<0.05)。结论DPP-4基因沉默可促进LPS诱导的肺泡巨噬细胞焦亡,其机制可能与促进p38、NF-κB磷酸化后启动NLRP3炎症小体形成及炎症因子释放,从而调控Caspase-1介导的经典细胞焦亡通路有关。

转染DPP-4 siRNA或(和)加入SP600125的小鼠肺泡巨噬细胞极化及JNK/AP-1信号通路激活情况观察

目的观察转染二肽基肽酶-4(DPP-4)siRNA或(和)加入c-Jun N-末端激酶(JNK)抑制剂(SP600125)的小鼠肺泡巨噬细胞极化情况、JNK/AP-1信号通路激活情况。方法体外培养小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S),并随机分组:Control组转染空载siRNA、siDPP-4组转染DPP-4 siRNA、LPS组转染空载siRNA+LPS、siDPP-4+LPS组转染DPP-4 siRNA+LPS、LPS+SP600125组转染空载siRNA+LPS联合SP600125、siDPP-4+LPS+SP600125组转染DPP-4 siRNA+LPS联合SP600125。采用Western boltting法检测巨噬细胞中M1型和M2型极化标志物CD86、CD206蛋白及JNK、激活蛋白-1(AP-1)转录蛋白(c-Jun、c-Fos)磷酸化,RT-qPCR法检测巨噬细胞中M1型标志物(CD86、TNF-α、iNOS、IL-1β)和M2型标志物[CD206、精氨酸激酶-1(ARG-1)、IL-4、IL-10]mRNA,一氧化氮(NO)测定试剂盒、免疫荧光检测巨噬细胞上清液中M1型促炎因子NO和细胞内活性氧(ROS)生成情况。结果与Control组比较,LPS组M1型促炎型因子NO、ROS生成含量及M1型极化标志物(CD86蛋白及CD86、TNF-α、iNOS、IL-1βmRNA)表达升高,M2型极化标志物(CD206蛋白及CD206、ARG-1、IL-4、IL-10 mRNA)表达降低,P均<0.05。与LPS组比较,siDPP-4+LPS组M1型促炎型因子NO、ROS生成含量及M1型极化标志物(CD86蛋白及CD86、TNF-α、iNOS、IL-1βmRNA)表达升高,M2型极化标志物(CD206蛋白及CD206、ARG-1、IL-4、IL-10 mRNA)表达降低,P均<0.05。与LPS组比较,siDPP-4+LPS组p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos蛋白磷酸化相对表达量升高,P均<0.05。与siDPP-4+LPS组比较,siDPP-4+LPS+SP600125组p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos蛋白磷酸化相对表达量降低,P均<0.05。结论转染DPP-4 siRNA可促进LPS诱导的小鼠肺泡巨噬细胞M1型极化,抑制肺泡巨噬细胞M2型极化,并增加JNK、c-Jun、c-Fos蛋白磷酸化表达;加入JNK抑制剂后,可降低由转染DPP-4 siRNA引起的JNK、c-Jun、c-Fos蛋白磷酸化表达升高。转染DPP-4 siRNA促进LPS诱导的小鼠肺泡巨噬细胞M1型极化的作用机制可能与激活JNK/AP-1信号通路有关。

医用胶在急诊小儿颌面部外伤中的临床应用

目的:观察医用胶在急诊小儿颌面部创伤中的临床疗效。方法2011年1月~2013年10月在我院急诊科接诊的126例4~14岁儿童均为颌面部皮肤裂伤,并随机分为实验组(63例)和对照组(63例),实验组采用清创医用胶粘合术,对照组采用清创美容缝合术。分别对患儿伤口疼痛程度评分和手术时间,以及对患儿伤口愈合情况及愈合外观满意程度进行对照观察。结果两组患儿手术时间、伤口疼痛程度评分观察组较对照组明显降低(P<0.05),且伤口愈合满意程度优于对照组(P<0.05),伤口愈合情况比较无统计学意义。结论清创医用胶粘合术治疗小儿颌面部皮肤裂伤能较好的减轻患儿痛苦,患儿能较好的配合治疗,且术后得到患儿家属较好的满意程度,值得推广。

环氧二十碳三烯酸在心肌缺血/心肌缺血再灌注损伤中的保护性作用机制研究进展

环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acid,EETs)是花生四烯酸(arachidonic acid,AA)在细胞色素P450表氧化酶(Cytochrome P450epoxygenases)作用下生成的一类化合物。在包括人在内的诸多哺乳动物多个器官都发挥重要的生物学作用。在心脏和冠脉,EETs通过调节离子通道、调节基因表达、激活信号转导、与受体结合以及作用于细胞特定位置等诸多方式,发挥着舒张血管、减小冠脉循环阻力、促进心肌细胞缺血后功能恢复、抗凋亡等诸多生物学效应。本文主要就EETs在心肌缺血/缺血再灌注损伤中产生的保护性作用机制及研究进展综述如下。

β-氨基丙腈联合血管紧张素Ⅱ改良法建立小鼠主动脉夹层模型

目的探讨一种构建小鼠主动脉夹层模型的改良方法。方法β-氨基丙腈(β-aminopropionitrile,BAPN)联合血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,Ang-Ⅱ)建立小鼠主动脉夹层模型。100只6周龄雄性C57BL/6J小鼠随机取20只作为对照组,另80只用于造模,其中单纯BAPN组40只和BAPN+Ang-Ⅱ组40只。BAPN组小鼠给予0.1 g·kg^(-1)·d^(-1) BAPN饮水;BAPN+Ang-Ⅱ组小鼠除给予BAPN 0.1g·kg^(-1)·d^(-1)饮水外,皮下注射Ang-Ⅱ(根据时间调整注射剂量:1~7 d Ang-Ⅱ剂量为1.5 mg·kg^(-1)·d^(-1),8~14 d Ang-Ⅱ为0.75 mg·kg^(-1)·d^(-1),15~16 d Ang-Ⅱ为0.375 mg·kg^(-1)·d^(-1)),BAPN组注射等体积生理盐水。药物干预16 d后取材。记录小鼠体质量及饮水量,实验进程中小鼠如有死亡立即解剖,分析死因。实验17 d,将未死亡的小鼠颈部脱臼处死,留取组织备用;HE染色判断主动脉夹层形成情况。结果BAPN+Ang-Ⅱ组及BAPN组分别与对照组相比,动物饮水量均减少、体质量增加趋势减慢(P<0.05)。对照组夹层发生率及死亡率均为0;BAPN组夹层发生率为7.5%,死亡率为2.5%,BAPN+Ang-Ⅱ组夹层发生率为80%,死亡率为30%。BAPN+Ang-Ⅱ组小鼠均死于调整Ang-Ⅱ剂量后1~3 d,83.3%小鼠死于注射药物后数分钟。结论给于C57BL/6J小鼠持续BANP饮水联合Ang-Ⅱ皮下注射成功构建主动脉夹层模型,具有周期短、模拟效果确切、死亡时间有一定规律、经济、稳定可重复等优点。

生物钟蛋白CRY1抑制AngⅡ诱导的小鼠主动脉平滑肌细胞表型蛋白标志物变化

目的探讨生物钟(circadian clock)相关蛋白隐花色素1(CRY1)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的小鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转化中的作用。方法将VSMCs分为对照(control)组和实验组,用不同浓度AngⅡ处理VSMCs不同时间,RT-PCR和Western blot检测收缩型标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、合成型标志物骨桥蛋白(OPN)及CRY1 mRNA和蛋白的表达;分别构建CRY1的干扰RNA(siCRY1)、YAP1的干扰RNA(siYAP1)进行基因沉默,构建CRY1的过表达质粒(pcDNA-CRY1)进行过表达,RT-PCR、Western blot双重验证各基因组mRNA和蛋白的表达;将VSMCs分为4组,对照组、AngⅡ组、AngⅡ+siCRY1组、AngⅡ+pcDNA-CRY1组,将siCRY1、siYAP1、pcDNA-CRY1转染至经AngⅡ处理VSMCs中,RT-PCR和Western blot检测α-SMA、OPN、CRY1、YAP1 mRNA和蛋白的表达及CCK-8法检测细胞增殖情况。结果不同浓度AngⅡ刺激VSMCs不同时间后,VSMCs收缩型标志物表达减少,VSMCs合成型标志物表达增加,CRY1表达减少;转染siCRY1、siYAP1、pcDNA-CRY1处理VSMCs后,CRY1在siCRY1组中表达下降,在pcDNA-CRY1组中表达升高,YAP1在siYAP1组中表达下降,在siCRY1组中表达升高;转染siCRY1进一步减少AngⅡ诱导VSMC收缩型标志物的表达(P<0.05),增加合成型标志物、YAP1的表达,以及促进VSMCs的增殖(P<0.05);转染pcDNA-CRY1质粒增加AngⅡ诱导VSMCs收缩型标志物的表达(P<0.05),减弱合成型标志物YAP1的表达(P<0.05)及抑制VSMCs的增殖(P<0.05)。结论生物钟蛋白CRY1抑制AngⅡ诱导的小鼠主动脉VSMCs表型蛋白标志物变化和增殖,该过程可能与Hippo-YAP信号通路有关。