DNA损伤生物学反应中ATM对p21^(WAF1/CIP1)蛋白的直接磷酸化

毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白 (mutatedinataxiatelangiectasia ,ATM)是直接感受DNA双链断裂损伤并起始诸多DNA损伤信号反应通路的主开关分子 .已有研究发现 ,DNA损伤生物学反应中 ,ATM可通过磷酸化活化p5 3,继而转录活化细胞周期检查点蛋白p2 1WAF1 CIP1的表达 ,而对于ATM是否直接参与p2 1WAF1 CIP1的早期活化迄今尚无实验证明 .通过免疫共沉淀反应 ,检测到细胞电离辐射 (ionizingradiation ,IR)反应早期ATM与p2 1WAF1 CIP1蛋白存在相互作用 .将p2 1WAF1 CIP1蛋白编码基因全长克隆入原核表达载体pGEX4T 2 ,经诱导表达及亲和层析纯化获取GST p2 1融合蛋白作为磷酸化底物 .体外磷酸化实验检测证明 ,IR活化的ATM具磷酸化p2 1WAF1 CIP1蛋白的功能 ,并且此磷酸化功能可被PI3K家族特异性抑制剂Wortmannin所抑制 .结果揭示了IR后ATM可通过直接磷酸化p2 1WAF1 CIP1蛋白 ,在IR致DNA损伤生物学反应早期调控p2 1WAF1

DNA双链断裂损伤反应及它的医学意义

DNA损伤应激反应是维持基因组稳定性的基石.细胞在长期进化中形成了由损伤监视、周期调控、损伤修复、凋亡诱导等在内的自稳平衡机制.一方面,借助感应、识别并启动精细而复杂的修复机制修复损伤;另一方面,通过DNA损伤应激活化的细胞周期检查点机制,延迟或阻断细胞周期进程,为损伤修复提供时间,使细胞能安全进入新一轮细胞周期;损伤无法修复时则诱导细胞凋亡.DNA双链断裂(double strand breaks,DSBs)是真核基因组后果最严重的损伤类型之一,其修复不利,同肿瘤等人类疾病的发生发展密切相关.新进展揭示:DSBs损伤反应信号分子ATM-Chk2-p53、H2AX等的组成性活化,是肿瘤形成早期所激活的细胞内可诱导的抗癌屏障,其信号网络的精确、精细调控在基因组稳定性维持中发挥重要作用.此外,HIV病毒整合进入宿主细胞基因组的过程也依赖于宿主细胞中ATM介导的DSBs损伤反应信号转导;ATM特异性的小分子抑制剂在抗HIV感染中显示重要的功能意义.文中重点讨论调控DSBs损伤应激反应信号网络的主要研究进展,及其在肿瘤发生、发展及抗HIV感染中的新医学意义.

TSA诱导MOLT-4细胞中p21^(WAF1/Cip-1)表达的功能机制研究

为了研究去乙酰化酶抑制剂TSA诱导MOLT-4细胞周期阻滞和凋亡反应中p21WAFl/Cip-1的表达及其功能, 以组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理急性淋巴细胞白血病细胞系MOLT-4,流式细胞仪和细胞吖啶橙染色、瑞士染 色检测细胞周期和凋亡,Western检测p21p21WAFl/Cip-1的表达。结果表明:组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可有效的诱导 MOLT-4细胞发生G2／M阻滞和凋亡,并且呈现明显的剂量效应关系和时间效应关系;在此周期阻滞与凋亡反应过 程中,p21WAFl/Cip-1蛋白的表达水平在周期阻滞前快速增高,而在凋亡早期开始下降。p21WAFl/Cip-1分子在细胞中的表 达规律与TSA诱导的细胞G2／M阻滞和凋亡反应间存在明显的剂量效应关系和时间效应关系;蛋白酶体抑制剂 MG-132提升p21WAFl/Cip-1分子在细胞中的表达可以增进细胞的G2／M阻滞反应而延缓凋亡。结论:蛋白酶体途径参 与TSA诱导的MOLT-4细胞周期阻滞向凋亡转换过程中p21WAFl/Cip-1分子的降解调控;p21WAFl/Cip-1在TSA诱导的 MOLT-4细胞G2／M阻滞和凋亡反应中起着重要调节作用。

蛋白酶体抑制剂MG132诱导HL-60细胞凋亡前G_2/M期阻滞及机制

背景和目的:蛋白酶体(proteasome)抑制剂能够诱导多种肿瘤细胞凋亡,是一种潜在的有应用前景的抗肿瘤剂。本研究旨在探讨蛋白酶体抑制剂MG132(Z-Leu-Leu-Leu-CHO)诱导白血病细胞HL-60凋亡和G2/M期阻滞的机制。方法:采用荧光显微镜观察、流式细胞术和免疫印迹研究测定MG132诱导HL-60细胞凋亡和周期阻滞及机制。结果:2μmol/L的MG132能够有效地诱导HL-60细胞凋亡,用药后24h就显现有细胞凋亡;在MG132诱导HL-60细胞凋亡出现之前有一个明显的G2/M期阻滞,加MG132后12h时G2/M期时相百分比为63.42±2.02;24h时加MG132组细胞凋亡为16.67±1.48,与对照组G2/M期时相百分比为7.29±3.01及细胞凋亡为0相比,两者之间有显著性差别(P<0.01);咖啡因CAF能够减少MG132诱导HL-60细胞出现的G2/M期阻滞,同时也减少凋亡细胞的比例;细胞周期检查点的负调控因子p21waf/cip1蛋白在加MG132处理后3h有明显的表达,但并未能检测到p53和p27蛋白。结论:MG132诱导HL-60细胞凋亡之前有一个明显的G2/M期阻滞,p21蛋白表达明显上调提示:是p21waf/cip1而不是p53或其同源蛋白参与了其中的调控。

抑制端粒酶催化亚基的表达促进Survivin蛋白的降解

背景与目的:研究表明,在肿瘤细胞中端粒酶催化亚基(hum antelom erase reverse transcriptase,hTERT)与存活素(Survivin)的表达具有相关性,本研究拟探索肿瘤细胞中hTERT与Survivin在功能上是否存在相互调控作用。方法:采用反义核酸分别抑制survivin与hTERT在H eLa S3细胞中的表达,端粒重复扩增法检测细胞中端粒酶活性的变化,并分别采用W estern印迹与RT-PCR分析细胞中Survivin蛋白水平与m RNA水平的变化,M TT法检测H eLa S3细胞的增殖变化。结果:采用反义核酸抑制H eLa S3细胞中survivin的表达对端粒酶的活性没有影响,但是采用反义核酸No.14抑制hTERT的表达可以显著降低细胞中Survivin蛋白水平,而m RNA水平未受影响。而且当反义核酸No.14的浓度在200～1000nm ol/L范围内时,Survivin蛋白水平的下降与反义寡核苷酸的浓度呈正相关,这种下降可以被泛素化蛋白酶抑制剂lactacystin和M G132所抑制。此外,在H eLa S3细胞中同时抑制hTERT与survivin的表达可以协同性地抑制细胞增殖。结论:抑制H eLa S3细胞中hTERT的表达可以促使Survivin蛋白通过泛素蛋白酶体途径降解。

亚细胞蛋白质组学技术分析MG132诱导HL-60细胞G_2/M期阻滞的分子机制

背景与目的:蛋白酶体抑制剂能够诱导多种肿瘤细胞凋亡,是一种有应用前景的抗肿瘤制剂。本研究通过对蛋白酶体抑制剂——MG132诱导G2/M期阻滞的HL-60细胞核蛋白进行蛋白质组学分析,探索参与HL-60细胞G2/M期阻滞调控的相关蛋白。方法:流式细胞术分析MG132处理的HL-60细胞周期,选取合适的时间点,提取细胞核,光镜和Westernblot检测细胞核纯度,裂解制样,通过二维电泳和MALDI-TOF-TOF串联质谱分析,鉴定表达显著差异的细胞核蛋白。结果:HL-60细胞在被2.5μmol/LMG132诱导凋亡之前8h,有明显的G2/M期阻滞发生;提取阻滞发生时和阻滞发生前的HL-60细胞核蛋白,二维电泳分析获得23个差异表达的蛋白点,质谱鉴定了8个核蛋白。结论:质谱鉴定的eIF5A、mRNA前体剪接因子等蛋白可能参与HL-60细胞的G2/M周期阻滞调控,为研究蛋白酶体抑制剂诱导白血病细胞周期阻滞及凋亡的分子机制提供了一些线索。

人外周血活化淋巴细胞survivin基因的转录激活和表达相关的信号转导通路研究

Survivin是与细胞增殖和细胞凋亡调控密切相关的重要功能蛋白质 ,也是肿瘤临床诊断的分子标志物及治疗研究的理想靶标 .由于发现人外周血活化淋巴细胞存在Survivin蛋白的显著表达 ,故以植物血凝素 (PHA)和IL 2共刺激培养的正常人外周血单个核细胞为实验材料 ,采用RT PCR、蛋白质印迹以及细胞周期分析等实验方法 ,观察淋巴细胞活化与Survivin蛋白表达之间的相互关系 ,并利用 3种激酶抑制剂探索了淋巴细胞活化所致Survivin蛋白表达相关的信号转导通路 .实验结果表明 :人外周血单个核细胞在刺激培养 36h前后出现survivin基因的明显转录激活和蛋白质的起始表达 ,表达产物的水平随培养时间的延长而增加 ,且具有明显的细胞周期和周期时相依赖性 .JAK2的抑制剂AG4 90阻断细胞周期的运行 ,且强烈抑制survivin基因的转录激活和蛋白质表达 ,PI3K和MEK的抑制剂Wortmannin和PD980 5 9也有一定程度的抑制作用 .所得实验结论是 :survivin基因的转录激活和蛋白质表达与淋巴细胞活化相关联 ,代表细胞处在增殖状态 .JAK2介导的JAK STAT信号通路是淋巴细胞活化 ,Survivin蛋白表达必需和最重要的信号转导通路 ,PI3K和MEK介导的信号通路也具有一定的影响作用 .

蛋白质体外磷酸化方法的建立

蛋白质的磷酸化与去磷酸化调节方式在细胞信号传递过程中占有极其重要的位置 .建立鉴定蛋白质磷酸化的可靠方法具有重要意义 .毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白 (ataxia telangiectasiamutated ,ATM)是直接感受DNA双链断裂损伤 ,并起始诸多DNA损伤信号反应通路的主开关分子 .电离辐射 (IR)细胞学反应中 ,ATM激酶可通过磷酸化活化 p5 3蛋白 ,原核表达 p5 3融合蛋白 ,免疫沉淀IR活化的野生型ATM蛋白 ,进行蛋白质的体外磷酸化反应 .实验验证了ATM对 p5 3蛋白的磷酸化作用 .这一方法的建立可为研究细胞信号转导途径中蛋白激酶对底物的磷酸化作用及筛查激酶底物提供标准化的技术手段 .

HeLa细胞中Skp2的表达调控p21WAFCIP1稳定性

泛素 蛋白酶体抑制剂MG 132处理的HeLa和SaoS 2细胞中 ,低表达的p2 1WAF CIP1受泛素 蛋白酶体通路调控 .为探讨肿瘤细胞中高表达的E3连接酶底物结合亚基 Skp2和低表达的p2 1WAF CIP1之间的关系 ,在HeLa细胞中转染Skp2的反义寡核苷酸后 ,p2 1表达水平明显升高 .同时 ,相对于转染空载体和Skp2ΔF(Skp2的F box缺失突变体 )的真核表达载体 ,转染全长Skp2的HeLa细胞中 ,p2 1表达水平显著下降 ,说明肿瘤细胞中Skp2调节p2 1的稳定性 ,并且这种调控作用依赖于Skp2蛋白中的F box结构 .免疫荧光结果表明 ,Skp2和p2 1共定位于细胞核 ,这为两者间的相互作用提供了前提 ;体内相互免疫共沉淀结果表明 ,p2 1和其它SCFSkp2 的底物一样与Skp2直接结合 ,并且它们之间的结合区不在F box结构域 ,这一结果在体外的GST

Skp2参与HeLa细胞G_2/M周期检查点的调控

具癌基因特性的Skp2在大多数肿瘤组织和肿瘤细胞中异常高表达,它作为SCFSkp2复合物的底物识别亚基调控p27KIP蛋白的稳定性而促进细胞G1/S期转换.为进一步明确Skp2与G2/M周期检查点的关系,在HeLa细胞中过表达Skp2以及通过反义寡核苷酸抑制Skp2表达.结果发现:Skp2能促进细胞周期运转,表现为S期细胞增多和G2/M期细胞减少,其中F-box结构域具有重要的功能意义;反义寡核苷酸抑制Skp2表达后,HeLa细胞发生显著的G2/M期阻滞;MTT检测结果表明,400nmol/L的Skp2的反义寡核苷酸能明显抑制HeLa细胞的增殖活性;Western印迹结果表明,HeLa细胞中Skp2可能通过负调控p21WAF的稳定性来参与G2/M检查点调控,这在用放线菌素D处理HeLa细胞的实验中得到验证.这些结果初步揭示了Skp2参与HeLa细胞G2/M周期检查点调控的分子机制.

DNA损伤反应中细胞周期检查点蛋白p27^(Kip1)表达及其调控机制

为了研究DNA损伤反应中p2 7Kip1的表达及其调控机制 ,应用免疫印迹的实验结果表明 :10Gy 60 Coγ射线照射后 3h ,HeLa细胞中p2 7Kip1蛋白水平开始下降并持续到 2 4h ,进而失去它对CDKs的抑制功能 .Northern印迹结果显示 ,电离辐射 (IR)对p2 7Kip1mRNA表达水平无明显影响 ,说明电离辐射诱导p2 7Kip1表达水平的降低主要与蛋白质降解相关 ,但其具体的调控机制还不清楚 .已知在G1—S期p2 7Kip1蛋白的降低主要依赖细胞周期蛋白E Cdk2激酶将其磷酸化后的泛素化蛋白酶体途径 (ubiquitin proteasomepathway) .酶动力学研究结果揭示 :电离辐射后细胞周期蛋白E Cdk2激酶活性增高 ,12h细胞周期蛋白E Cdk2激酶活性达到最大 .当在照前用细胞周期蛋白E Cdk2抑制剂olomoucine (10 μmol L)抑制细胞周期蛋白E Cdk2激酶活性时 ,p2 7Kip1蛋白表达水平增加 .此外 ,还观察到电离辐射可诱导p2 7Kip1泛素化水平的增高 ,而在使用蛋白酶体抑制剂MG 132 (5 μmol L)处理HeLa细胞后 ,可抑制辐射诱导p2 7Kip1蛋白水平的下调 .研究结果提示 :泛素化蛋白酶体途径参与了辐射诱导P2 7Kip1蛋白表达下调的降解机制 .

人外周血活化淋巴细胞中Survivin蛋白表达的分子机制研究

目的:探讨活化淋巴细胞中Survivin蛋白诱导表达的信号转导通路、分子级联反应和生物效应,揭示Survivin蛋白表达调控的分子机制。方法:用PHA和rhIL-2刺激培养人外周血单个核细胞,附加JAK抑制剂—AG490的处理,以Western blot检测Survivin和相关蛋白的表达;以流式细胞术(FCM)分析细胞周期和细胞分裂增殖。结果:刺激培养的细胞按照时序先后出现的分子和细胞学反应为:Stat3和Stat5磷酸化→CyclinD3、CyclinE蛋白水平上调→细胞进入S期及Survivin蛋白起始表达→细胞有丝分裂及Survivin蛋白表达水平增加。AG490对于上述反应均呈现明显的抑制作用,但对周期抑制蛋白P21和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平没有影响。结论:Survivin蛋白的表达依赖JAK-Stat信号转导通路的早期活化,通过上调CyclinD3和CyclinE周期蛋白水平,启动细胞周期的运行,诱导Survivin蛋白的周期时相依赖性表达,参与细胞有丝分裂与增殖。

辐射诱导Gadd45基因表达作为生物剂量计的实验室评估

为了考察电离辐照后人外周血中Gadd45基因表达的个体差异,评价Gadd45作为基因表达辐射生物剂量计的实用性,采集了27个健康人外周血进行60Co照射,提取白细胞mRNA,以β-actin作为内对照基因,建立了相对标准曲线法实时定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)方法,并以此方法探索辐照后Gadd45表达的剂量-效应关系。结果表明,0～2.5Gy剂量范围内,Gadd45的mRNA表达水平随照射剂量增加而上调,通过拟合建立了0～2.5Gy剂量范围内,Gadd45/β-actin相对表达量与照射剂量间的剂量-效应直线方程(y=0.216+0.258x,p<0.001,R2=0.650)。发现Gadd45 mRNA表达水平在个体间存在一定差异,应用该剂量-效应直线方程,可以对0～2.5Gy照射剂量范围内的血液照射剂量作相对估算。

电离辐射反应中PML调控CXCR4的表达

目的：观察电离辐射反应中，肺癌细胞中受辐射感应分子早幼粒细胞白血病蛋白（PML）表达影响的信号分子，探讨PML是否参与调控辐射诱导的肿瘤转移过程。方法本实验采用特异性靶向PML的siRNA构建PML敲低表达细胞模型，钴-60辐照，而后用康成公司的基因表达谱芯片检测获得差异表达基因，经聚类分析挖掘与细胞间通讯、肿瘤转移有重要相关性的基因，进一步用反转录实时定量多聚酶链反应法（RT-qPCR）和蛋白质免疫印记法（WB）进行验证。结果应用基因表达谱芯片比较检测电离辐射反应中受PML影响的基因，筛选获得在非小细胞肺癌侵袭转移中发挥重要作用的C-X-C细胞因子受体4（CXCR4）在PML敲低表达的非小细胞肺癌A549细胞中表达显著上调；RT-qPCR和WB进一步在mRNA和蛋白水平验证PML敲低细胞中CXCR4的表达增高。结论在肺癌侵袭转移中发挥重要功能的CXCR4基因的表达受辐射感应分子PML的调控。

SAHA对p53野生型及敲低的肿瘤细胞体外抑制效应

目的研究组蛋白去乙酰化酶抑制药SAHA对p53敲低的细胞株HeLa-E3以及其p53野生型的对照细胞HeLa的作用。方法体外加入不同浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制药SAHA,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,台盼蓝计数细胞死亡率。结果SAHA显著抑制HeLa和HeLa-E3细胞的增殖,增殖抑制作用具时间、剂量相关性,且HeLa细胞比p53敲低的HeLa-E3细胞对SAHA更为敏感。SAHA作用24h后HeLa细胞出现G2/M阻滞和细胞死亡率的显著增高。结论肿瘤细胞中的p53状态影响组蛋白去乙酰化酶抑制药SAHA对其的杀伤及增殖抑制作用。

乳头状甲状腺癌基因PTC1对ATM细胞定位和功能的影响

背景与目的:ret基因重排活化与乳头状甲状腺癌密切相关,但它致癌的分子机制还不清楚,本文将通过研究DNA双链断裂(double-strandbreaks,DSBs)感应分子毛细血管扩张共济失调症突变蛋白ATM(mutatedinataxiatelangiectasia)与原癌基因Ret重排活化蛋白PTC1的相互作用,探讨ret重排致癌的分子机制。方法:以抗ATM抗体免疫沉淀的ATM为激酶,抗HA抗体免疫沉淀的PTC1的TK结构域为底物,进行体外磷酸化,检测ATM对ret-TK结构域的磷酸化作用;分别分离COS7细胞胞浆和胞核蛋白,研究PTC1过表达对ATM-LZPR定位的影响;用磷酸化p53抗体检测PTC1过表达对p53磷酸化水平的影响;流式细胞术分析PTC1过表达对细胞周期的影响。结果:体外磷酸化实验证明TK可以被ATM体外磷酸化;Western印迹检测发现单独表达LZPR时其在胞浆、胞核均有表达,而PTC1与LZPR共表达后,LZPR结构域仅在胞浆表达;用磷酸化p53抗体检测发现过表达PTC1抑制了ATM对p53的磷酸化作用,引起细胞G1/S期周期阻滞。结论:PTC1可能通过使ATM滞留于胞浆,干扰ATM对p53的磷酸化及其对细胞下游靶基因的转录活化功能,从而使细胞周期检查点机制失控。

ZS—1型转速仪的研制

本文介绍了该转速仪的用途、特点、技术指标、工作原理和主要部分的功能,以及利用单片机提高仪器性能的情况。

临床应用外周静脉置入中心静脉导管与头皮针的对比观察

目的临床观察经外周静脉置入中心静脉导管与头皮针在静脉输液中穿刺换针总频次及并发症。方法 240例患者,随机分甲组和乙组,甲组用头皮钢针,乙组用外周静脉置入中心静脉导管(PICC)。结果甲组120例病人共穿刺688次,平均每人穿刺5次;乙组120例共穿刺128次,多数病人穿刺一针。静脉炎:甲组有67例(55.8％),乙组有11例(0.9％),病人发生不同程度的外周静脉炎,甲组静脉炎明显高于乙组(P=0.001)。结论甲组病人穿刺换针频次明显多于乙组,静脉炎发生率也高于乙组(多与针头和药物刺激有关)。乙组病人输液时活动方便,导管保留时间长,明显优于甲组。

DNA损伤诱导的长链非编码RNA-UCA1促进HeLa细胞增殖

尿路上皮癌抗原1(UCA1)是一种长链非编码RNA,在多种肿瘤内高表达.然而,其在宫颈癌细胞和组织中的表达报告颇不一致,且功能尚未确定.本文探索UCA1在宫颈癌He La细胞中的生物学功能.实时定量PCR(qRT-PCR)结果显示,UCA1、p21和p53 mRNA在阿霉素(doxorubicin,DOX)或γ射线照射的He La细胞中表达上调;相反,敲减p53表达则可抑制DOX诱导的UCA1上调.表明DNA损伤诱导的UCA1可能与p53有关.转染结合CCK8检测He La细胞增殖活力结果显示,与对照比较,过表达UCA1促进He La细胞增殖,干扰UCA1表达则减缓细胞增殖.此外,流式细胞术结果显示,过表达UCA1导致阿霉素诱导的凋亡率下降;siRNA抑制UCA1表达后引起细胞G2/M期比例上升,S期下降,且阿霉素诱导的细胞凋亡率上升.上述结果说明,DNA损伤诱导的UCA1可促进He La细胞增殖,减少细胞凋亡.然而,是否DNA损伤诱导的UCA1上调依赖p53尚需进一步实验证明.