苏云金芽孢杆菌cry1I基因沉默的研究

分析了苏云金芽孢杆菌(Bt)cry1和cry1Ⅰ基因的保守区,在cry1类基因的下游和cry1Ⅰ基因的上游设计了一对通用引物,用于检测cry1Ⅰ与cry1类基因的连锁现象,从鉴定的142株Bt分离株中,PCR扩增发现71株出现约1.4kb的阳性带,说明这一现象广泛存在于Bt菌株中,在此基础上用pGEM-T Easy载体克隆了菌株Bt07和J8中的连锁序列,序列分析表明,Bt07中是cry1Ⅰ基因与cry1Db基因连锁,间隔区为504bp;J8中是cry1Ⅰa基因与cry1Ac基因连锁,间隔区为506bp.进一步比较间隔区序列,同源性达93.7％,同时含有多个原核生物终止序列,且未发现启动子序列,揭示了这两个菌株中cry1Ⅰ基因沉默的成因。

对鞘翅目害虫高毒力Bt基因cry3Aa7的分离克隆及表达研究

从国内分离的对鞘翅目叶甲科害虫高毒力的Bt菌株中克隆了 3.0kbcry3Aa基因大片段 ,完成了该片段的亚克隆和全序列测定。该基因编码区为 1932bps,编码的蛋白质由 6 4 4个氨基酸残基组成 ,分子量 73.1ku ,等电点为 pH5 .16 5 ,为弱酸性蛋白。该蛋白中Ser、Leu、Thr含量最高 ,分别为 8.2 2 %、8.0 7%和 7.76 %。通过穿梭载体将该基因导入Bt无晶体突变株中 ,获得工程菌Biot2 0 5。cry3Aa7基因在其中能正常表达 ,并形成扁方形晶体。工程菌Biot2 0 5对榆蓝叶甲 (Pyrrhaltaaenescens)校正死亡率为 86 .2 1%。该基因序列已在EMBL、GenBank中登记 ,并被国际Bt δ 内毒素基因命名委员会正式命名为cry3Aa7。

枯草芽孢杆菌Bs-916的抑菌活性及其抑菌物质初探

为了揭示从土壤中分离出的拮抗菌—枯草芽孢杆菌Bs-916的抑菌作用和抑菌机理,采用管蝶法、平板涂抹法及孢子盟发法测定了Bs-916及其代谢液对水稻纹枯病菌、蚕豆枯萎病菌等8种病原菌的抑菌活性,结果表明其对供试的大多数病原菌均具有较强的抑菌活性,如Bs-916及其代谢液对水稻纹枯病菌的抑制率分别为95.4%和70.7%,对水稻稻曲病菌的抑制率均为100%。为了探索Bs-916胞外物质的种类及特性,分别采用丙酮沉淀、PEG沉淀、等电点沉淀和超微浓缩等方法从Bs-916代谢液中获得了沉淀物或截留物,它们均具有抑菌活性。沉淀物经蛋白酶K处理后,活性减弱,说明Bs-916胞外抗菌物质具有蛋白质的性质。

苏云金芽孢杆菌B-Pr-88菌株中cry2Ab4基因的表达和杀虫活性研究

以我室自行分离的对鳞翅目夜蛾科害虫具有高毒力的Bt菌株B-Pr-88为材料,用PCR-RFLP方法从其质粒DNA文库中筛选到含cry2Ab基因的一个阳性克隆pZF858,序列测定发现,该片段含有cry2Ab全长基因,开放读码框为1902bps,编码由633个氨基酸组成的70.7kD蛋白,氨基酸同源性与已公布的cry2Ab基因同源性均为99.8%,经Bt基因国际命名委员会正式命名为cry2Ab4。根据cry2Ab4基因开放阅读框架(ORF)两端序列,设计合成一对特异引物L2ab5和L2ab3,PCR扩增获得cry2Ab4完整ORF,与大肠杆菌表达载体pET-21b连接,构建了重组表达质粒pET-2Ab4,质粒导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳证实该基因表达了60kD的蛋白,生物测定表明,Cry2Ab4对棉铃虫和大豆食心虫具有高毒力,同时对小菜蛾和二化螟有一定的杀虫活性,而对亚洲玉米螟和甜菜夜蛾没有杀虫活性。

饲喂玉米秸秆的白星花金龟幼虫肠道细菌多样性

【目的】分析比较饲喂玉米Zea mays L.秸秆的白星花金龟Protaetia brevitarsis幼虫中肠、后肠中细菌群落结构,挖掘肠道细菌在白星花金龟消化秸秆中的功能。【方法】分别提取健康白星花金龟3龄幼虫10个样品(5个中肠内含物、5个后肠内含物)肠道细菌总DNA,利用Illumina HiSeq技术对白星花金龟幼虫中肠和后肠细菌的16S rDNA V4区序列进行测序,统计样品操作分类单元(operational taxonomic units,OTUs)数量,分析物种丰度、α多样性和β多样性,并将细菌群落信息映射到KEGG基因组数据库,进行细菌群落功能挖掘。【结果】共获得白星花金龟3龄幼虫肠道细菌1 062 897高质量reads,聚类为2 441个OTUs,总共注释到27个门,51个纲,77目,168科,326属。在属的分类阶元上,中肠中以假单胞菌属Pseudomonas为最优势属,后肠中以脱硫弧菌属Desulfovibrio为最优势属。α多样性分析表明,后肠群落多样性更丰富;β多样性分析结果显示,后肠微生物群落更稳定。细菌群落功能分析结果显示,中肠、后肠细菌群落都含有降解秸秆相关的酶系,其中,中肠降解木质素相关的通路更丰富,后肠降解纤维素的酶更多。【结论】采用Illumina HiSeq测序技术明确了饲喂玉米秸秆的白星花金龟幼虫中肠、后肠细菌群落结构与特点,进一步发现了肠道细菌在白星花金龟秸秆消化过程中发挥的作用,相关研究结果将为白星花金龟消化秸秆的机制深入研究提供参考,为我国秸秆资源化利用提供新思路。

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3A的研究

根据已知vip3A基因序列设计一对特异性引物VIP3／VIP5，对218株Bt菌株进行PCR鉴定，有51株含有vip3A类基因，其中12株为不同亚种的标准菌株，有4株标准菌株不含有该基因。从Bt C9菌株中分离克隆了vip—C9基因，并插入表达载体pET—21b，转化大肠杆菌BL21，诱导表达出分子量88．6kDa的可溶性蛋白，表达产物对甜菜夜蛾和棉铃虫具有较高的杀虫活性，LC50分别为0．42ng／mg和25．95ng／mg，对小菜蛾活性较低。构建了缺失蛋白Vip—C9—N(N端去除39个氨基酸组成的信号肽序列)，杀虫活性测定结果表明其对甜菜夜蛾的活性显著降低，说明N端39个氨基酸对甜菜夜蛾的活性是必需的。

铜绿丽金龟的室内人工饲养

对室内饲养铜绿丽金龟AnomalacorpulentaMotschulsky的方法和主要影响因子进行了研究。结果表明:室内饲养的铜绿丽金龟种群完成一个世代平均为272·3天,3龄幼虫期比田间种群缩短了103·8天。在饲养过程中,幼虫的生长容易受到土壤湿度、食料、病原微生物的影响。卵的孵化率为86·0%,1龄、2龄和3龄幼虫的存活率分别为82·0%、76·0%和60·0%。10和15日龄幼虫在含有马铃薯的土壤中饲养14天后的死亡率分别为8·8%±1·6%和4·0%±1·6%,明显低于初孵幼虫及5日龄幼虫的死亡率,可以作为生物测定的最佳供试幼虫。紫外线处理的壤土和沙壤土中铜绿丽金龟幼虫可以正常生长,死亡率较低。

PCR-RFLP筛选DNA文库克隆Bt cry基因的研究

Bt菌株C0 0 2对水稻二化螟、甜菜夜蛾具有高毒力 ,PCR RFLP鉴定含有cry1Aa、cry2Ab、cry1Ca和未知杀虫蛋白基因cryX等 ,其中cry1Ca位于染色体DNA 6～ 9kb的EcoRI片段。染色体和质粒DNA分别经EcoRI完全酶切和Sau3AI部分酶切、电泳回收 6～ 9kb片段。E .coli Bt穿梭载体pHT315分别与目的DNA连接、转化大肠杆菌感受态细胞后获得了相应的DNA文库。约 5 0个转化子合为一个转化子池 ,采用PCR RFLP方法快速检测 ,分别从约 2 0 0 0质粒DNA文库转化子和 4 0 0个染色体文库转化子中筛选获得了cry1Aa、cry2Ab、cry1Ca和未知基因cryX的阳性克隆 ,相应命名为pHT 1Aa、pHT 1Ca、pHT 2Ab和pHT X。限制酶切分析表明 ,含有cry1Aa、cry1Ca和cry2Ab基因的克隆片段均含有相应基因的保守物理图谱。进一步将这些质粒分别导入Bt无晶体突变株CryB-,SDS PAGE分析表明 ,只有cry1Ca表达了约 130ku杀虫晶体蛋白。初步杀虫生测结果显示 ,cry1Ca对甜菜夜蛾具有高毒力 ,7d校正死亡率为 10 0 %。

对小地老虎具有杀虫毒力的苏云金芽孢杆菌菌株的分离及鉴定

从我国3种典型植被覆盖的6个地区的土壤样品分离得到了348株苏云金芽孢杆菌菌株,采用杀虫活性测定方法从中获得了32株对小地老虎具有高毒力的菌株。利用PCR-RFLP鉴定体系和SDS-PAGE蛋白分析法,研究了这32株苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白基因类型和晶体蛋白表达情况,对小菜蛾、二化螟、棉铃虫的杀虫活性测定也证明了苏云金芽孢杆菌cry基因类型、表达蛋白及杀虫活性间的相关性。

ARDRA方法在荧光假单胞菌分离鉴定中的应用

【目的】探索荧光假单胞菌的分类方法,分离筛选拮抗性较强的荧光假单胞菌。【方法】利用紫外下产生荧光的特性,采用梯度稀释及鞭毛染色的方法,对采自云南、海南、山东和新疆的488份植物根际土壤进行分离筛选,分离菌株进行ARDRA分析,采用室内平板对峙法筛选对植物病原真菌具有较强拮抗作用的菌株,并对其进行生理生化分析和分子鉴定。【结果】分离筛选到102株紫外下产生荧光的杆状单极生鞭毛菌株。ARDRA分析产生荧光假单胞菌类型、恶臭假单胞菌类型以及一个未知的谱带类型。以油菜立枯病菌作为靶标菌,筛选到25株具有拮抗作用的菌株,其中TC222产生的抑菌圈最大,进一步的生测结果表明该菌株对9种重要的植物病原真菌如番茄灰霉病菌等具有很强的拮抗活性。TC222的16SrDNA核苷酸序列与荧光假单胞菌PfO-1同源性达到99%,其最终鉴定为荧光假单胞菌。【结论】ARDRA方法在分子水平上为荧光假单胞菌的分离鉴定探索了一条新途径;TC222菌株具有拮抗多种植物病原真菌的能力,显示了良好的应用前景。

苏云金芽孢杆菌cry基因芯片检测方法的研究

建立了一种不经PCR扩增而直接应用寡核苷酸芯片从苏云金芽孢杆菌总DNA中检测cry基因的方法。对探针长度、浓度、总DNA含量、标记方法以及灵敏度等条件进行了研究。结果表明,用高浓度Klenow酶随机标记高浓度的总DNA与寡核苷酸探针(40～50mer、40μmol·L-1)杂交可用于检测Bt菌株中含有的cry基因;不同长度探针之间对杂交信号的影响存在显著性差异(P<0.01),而不同浓度的探针之间没有显著性差异。此方法的其它条件为杂交温度42℃、时间3h;检测的样品总DNA的灵敏度约为2.5μg;标记产物杂交用量(0.625～20μg)的对数值与信号值的对数值之间存在明显的线性关系(r2=0.985～0.989)。

31株苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因型鉴定及表达产物研究

利用已建立的苏云金芽孢杆菌cry基因的PCR RFLP鉴定体系 ,鉴定了 31株Bt菌株的cry基因类型 ,并进行了SDS PAGE分析和杀虫生物活性测定。研究表明 :2 5株含cry1基因 ,表达蛋白 1 30～ 1 50kD ;其中 1 6株含有对鞘翅目和鳞翅目害虫皆有活性的cry1I基因 ,其表达蛋白为 81kD ;1 5株同时含有cry1和cry2基因 ( 1 3株表达蛋白约为 60kD) ;1 0株含有未知待定基因 ;6株不含所鉴定的cry基因 (其中 2株有表达产物 )。室内生物测定表明 :cry1、cry2基因表达的菌株对鳞翅目害虫具有高杀虫活性 ,7株对舞毒蛾和膜翅目———杨叶蜂幼虫具有较高杀虫活性 ;含有cry1Aa、cry1Ac、cry2或cry1Ab、cry1Ac、cry2基因组合的菌株对棉铃虫幼虫均显示杀虫活性 ,其中 6、1 2、30号菌株毒力最强。不含上述cry基因的菌株均无杀虫活性。以上结果证明 ,通过cry基因类型鉴定和表达产物的SDS PAGE分析可以预测菌株的杀虫活性。

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Ba3活性区的研究

通过对Cry1Ba3蛋白序列的分析,以及与已知Cry蛋白比较,设计了6对特异性引物,通过PCR扩增获得6种不同长度的cry1Ba3基因片段。将这些基因片段克隆到pET-21b载体上,导入大肠杆菌BL21中进行诱导表达,最终得到6种不同长度的Cry1Ba3蛋白片段。采用浸叶法检测这些蛋白片段对小菜蛾的杀虫活性,研究结果表明含有第1～685位和含有第22～655位氨基酸的蛋白片段对小菜蛾的毒性,与全长Cry1Ba3蛋白相比,没有改变;含有第54～655位氨基酸的蛋白片段对小菜蛾的毒力明显降低;而含有第22～627位和含有第85～655位氨基酸的蛋白片段完全丧失了对小菜蛾的活性。上述结果表明Cry1Ba3蛋白对小菜蛾的活性区在第22～655位氨基酸之间。

我国不同森林立地带土壤中苏云金芽孢杆菌cry基因资源研究

利用PCR RFLP鉴定体系和SDS PAGE表达蛋白的分析方法,分析了来自我国不同森林立地带(寒温带、中温带、暖温带、北亚热带、中亚热带、南亚热带、高原亚热带、热带)自然保护区森林土壤中分离的72株苏云金芽孢杆菌的cry1、cry2、cry3、cry4、cry5、cry8、cry9、cry10、cry11、cry1I杀虫晶体蛋白基因类型,表达蛋白和杀虫活性的生物测定。研究表明:同时含有cry1、cry2、cry1I3类基因的有21株菌,6株菌含有cry1、cry2类基因,4株菌含有cry1和cry1I基因,只含有cry1基因的有1株,cry2基因的4株,36株菌不含所鉴定的10类基因。同时证明:绝大多数含有cry1基因的菌株表达了130kD蛋白,含有cry2基因的菌株表达了60kD的蛋白。对不同农、林害虫棉铃虫、杨扇舟蛾、舞毒蛾、马尾松毛虫、黄粉甲、榆兰叶甲、落叶松叶蜂等幼虫的杀虫活性进行了生物测定。进一步证明了苏云金芽孢杆菌cry基因,表达蛋白及杀虫活性三者的相关性。为生产和科研提供了生物治虫、抗虫育种新的苏云金芽孢杆菌cry基因资源。

转cry1Ah基因玉米对根际土壤微生物群落结构的影响

采用传统的平板计数法分析根际土壤可培养细菌、真菌和放线菌数量;同时用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)和BIOLOG方法,对转cry1Ah基因抗虫玉米根部土壤微生物群落结构进行了研究。结果表明,在玉米的整个生长过程中,根部可培养的微生物随时间变化有一定的消长,但同一时间内转基因玉米与非转基因玉米二者根部可培养细菌、真菌和放线菌的数量差异不显著。同时变性梯度凝胶电泳的结果显示,在玉米的整个生长期内,根部土壤细菌群落多样性指数为2.40～2.70,群落分布均匀度指数为0.96～0.99;根部土壤真菌群落多样性指数为2.17～2.48,群落分布均匀度指数为0.95～0.99;转基因玉米和常规玉米根部土壤细菌和真菌的群落结构变化差异并不显著。BIOLOG结果显示,微生物群落的孔平均颜色变化率值、Shannon指数、Simpson指数和McIntosh指数与对照相比无显著差异。以上结果说明cry1Ah基因的导入并没有对玉米根际土壤群落结构产生显著影响。

苏云金芽胞杆菌cry2Ad基因的克隆及其表达产物的活性分析

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)SBT2是我国新分离出的一株野生菌株。扫描电镜显示该菌株产生双锥体形晶体。琼脂糖凝胶电泳发现其质粒图谱含有5个条带。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示此菌株产生130kD晶体蛋白。利用PCR-RFLP法进行杀虫基因类型鉴定,发现其含有cry1Aa、cry1Da、cry1Hb、cry1Jb、cry1Ka、cry1Ib、基因。Cry2Ad蛋白的活性至今未见研究报道,本研究克隆和测序了该基因。并对其进行了表达。生物活性测定结果表明其表达产物对舞毒蛾(Lymant-ria dispar)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、小菜蛾(Plutella xylostella)有低活性;对大猿叶甲(Colaphellus bowringi)无活性。

转Bt cry1Ah/cry1Ie双价基因抗虫玉米的研究

构建了含有人工改造的抗虫基因Bt cry1Ah、cry1Ie和耐除草剂基因2mG2-epsps的植物表达载体pMUHUESGM,利用基因枪法将表达盒片段转化玉米愈伤组织,以2mG2-epsps基因为筛选标记基因,经草甘膦异丙胺盐筛选获得24株T0代再生植株,其中PCR检测阳性植株有20株。T0和T1代植株的分子检测结果证明了外源基因已经整合到玉米基因组中并能够稳定遗传和表达,转基因株系在田间生物活性检测中表现出较好的抗虫性,这为培育抗虫玉米新品种提供了参考,同时本研究中采用了基因枪片段转化法,提高了转基因的生物安全性。

Cry1Ba3、Cry1Ia8蛋白对Cry1Ac抗性小菜蛾的杀虫活性研究

利用2种苏云金芽胞杆菌原毒素Cry1Ba3、Cry1Ia8及其组合,分别对Cry1Ac抗性种群小菜蛾幼虫进行生物活性测定。结果表明Cry1Ba3、Cry1Ia8对2种目标试虫均有高毒力,LC50分别为0.2175、0.6706μg/mL;Cry1Ba3毒力3倍于Cry1Ia8。2种蛋白混配的结果也表现出高毒力,LC50为0.4375μg/mL,没有显著的协同增效作用,也不存在拮抗。敏感与抗性小菜蛾种群生测结果统计分析比较,结果表明这2种蛋白及其组合与Cry1Ac并无交互抗性。

咪唑乙烟酸降解菌的分离、鉴定及降解特性研究

采用高压富集方法,从生产咪唑乙烟酸农药厂排污口污泥中分离得到1株咪唑乙烟酸高效降解菌P14,根据菌株形态、生理生化特性及16S rDNA分析,鉴定该菌株为哈夫尼希瓦氏菌Shewanella hafniensis。初步研究了其在不同条件下对咪唑乙烟酸的降解性能。结果表明:在以咪唑乙烟酸为唯一碳源的无机盐培养基中,当咪唑乙烟酸初始质量浓度为100mg/L、培养温度为30℃、pH值6.0、接种量7%时,菌株P14对咪唑乙烟酸的降解效果最佳,3d内的降解率可达92%,因而可以此作为菌株P14降解咪唑乙烟酸的最佳条件。外加不同碳源时,P14菌株对咪唑乙烟酸的降解率呈现不同程度下降,其中柠檬酸钠对P14菌株降解效果影响较小。

苏云金芽孢杆菌cry1Ab13基因的克隆及表达研究

BtC0 0 5是我国自行分离的对多种害虫具有毒杀作用的苏云金芽孢杆菌 ,经PCR RFLP系统鉴定 ,它含有cry1Ab基因。Southernblot结果显示 :PstI酶切C0 0 5质粒所得的 8 5kb长的DNA片段为cry1Ab基因的阳性杂交带。以pUCP1 9为载体 ,克隆了该片段并证明其含有cry1Ab基因。对其进行亚克隆和测序 ,结果表明该基因编码区为 3 4 6 8bp ,其编码的蛋白含1 1 5 5个氨基酸 ,分子量为 1 3 0 6kD ,等电点为pH4 845。该基因已在GenBank基因库中注册 ,Accessionnumber为AF2 5 4 6 4 0 ,并为国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Ab1 3。将cry1Ab1 3基因在Bt无晶体突变株cryB- 中表达 ,蛋白质电泳结果表明在 1 3 0kD处有表达带 ,并证明CryAb对小菜蛾有较高的杀虫活性。