血管生成抑制因子arresten基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 :构建血管生成抑制因子arresten基因的原核表达载体 ,并在大肠杆菌中进行表达。方法 :利用聚合酶链式反应 (PCR) ,由我们构建的重组质粒pGEM -Arr中扩增出arresten基因 ;采用基因重组技术 ,将该基因定向克隆于原核表达载体pRSET中 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,用IPTG诱导表达 ,并对表达产物行SDS -PAGE分析。结果 :酶切鉴定和DNA测序证实arresten基因正确地插入表达载体中。重组arresten在大肠杆菌中获得高效表达 ,其分子量约为 2 6kD ,表达量约占菌体总蛋白量的 30 %。结论 :Arresten基因原核表达载体的成功构建和重组arresten蛋白在大肠杆菌中的高效表达 。

阿托伐他汀对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响

目的:探讨新型降脂药阿托伐他汀对自体移植静脉内膜增生的影响。方法:将Wistar大鼠颈外静脉移植于腹主动脉,建立大鼠自体静脉移植模型,实验分为3组:假手术组、移植对照组和移植实验组。自术后第1 d起,对移植实验组大鼠经胃管灌注给予阿托伐他汀(5 mg.kg-1.d-1)处理。干预4周后取移植静脉组织标本,制备4μm厚组织切片,行病理组织学观察分析移植静脉内膜增生情况,行免疫组化染色分析新生内膜细胞SMα-actin和PCNA的表达情况。结果:移植对照组和实验组移植静脉内皮下层SMα-actin染色阳性平滑肌细胞大量增生,导致静脉内膜显著增厚,血管管腔明显狭窄。新生内膜定量分析显示移植实验组移植静脉内膜增生受到明显抑制,其新生内膜面积及新生内膜/中膜面积比均显著低于对照组(P<0.01);并且实验组移植静脉新生内膜细胞PCNA标记指数显著低于对照组(P<0.01)。结论:阿托伐他汀通过抑制新生内膜平滑肌细胞的增殖能有效抑制自体移植静脉内膜增生的发生发展,在防治血管重建术后再狭窄方面显示出良好的应用前景。

骨髓细胞参与移植物动脉硬化的作用研究

目的研究大鼠移植动脉新生内膜平滑肌细胞Sry基因的表达,探讨骨髓细胞在移植物动脉硬化中的作用。方法采集雄性Wistar大鼠的骨髓细胞,将其移植到经γ射线照射预处理的雌性Wistar大鼠体内,制备嵌合体大鼠;4周后建立大鼠腹主动脉移植慢性排斥反应模型,分为4组:雌性同系移植组、雌性异系移植组、雄性异系移植组、嵌合体异系移植组。术后8周,制备移植动脉组织标本进行病理组织学观察,分析移植动脉硬化情况;用抗平滑肌α-肌动蛋白(α-SMA)单抗进行SABC法免疫组化染色,检测移植动脉新生内膜细胞α-SMA的表达情况;采用显微切割技术收集移植动脉冰冻切片新生内膜平滑肌细胞,用PCR检测其Sry基因的表达,分析移植动脉新生内膜平滑肌细胞是否来源于骨髓细胞。结果异系移植组移植动脉新生内膜中α-SMA表达阳性平滑肌细胞大量增生,致动脉内膜显著增厚,血管管腔明显狭窄;动脉壁新生内膜面积及新生内膜/中膜面积比均显著高于同系移植组(P<0.01),而异系移植组之间差异无显著性意义(P>0.05)。PCR扩增显示,嵌合体异系移植组和雄性异系移植组一致,在相对分子量为225bp处均有一条特异性扩增条带,而雌性异系移植组则无相应的核酸扩增条带;结果提示移植物动脉新生内膜平滑肌细胞来源于骨髓细胞。结论在动脉移植慢性排斥反应中,骨髓细胞分化为血管新生内膜平滑肌细胞,参与移植物动脉硬化的发生和发展。

移植动脉新生内膜平滑肌细胞来源于受体骨髓细胞的实验依据

目的:研究大鼠移植动脉新生内膜平滑肌细胞Sry基因表达,探讨移植物动脉硬化新生内膜平滑肌细胞的来源。方法:将雄性Wistar大鼠骨髓细胞移植到雌性大鼠体内,制备嵌合体大鼠;4周后建立大鼠腹主动脉移植慢性排斥反应模型,分为4组:雌性同系移植组、雌性异系移植组、雄性异系移植组、嵌合体异系移植组。移植术后8周,取移植动脉组织标本,进行病理组织学观察与免疫组化染色,分析移植动脉新生内膜增生及新生内膜细胞α-SMA的表达;采用显微切割技术收集新生内膜平滑肌细胞,用PCR扩增方法检测细胞Sry基因表达,分析新生内膜平滑肌细胞与受体骨髓细胞的关系。结果:异系移植组移植动脉新生内膜中α-SMA表达阳性平滑肌细胞大量增生,致动脉内膜显著增厚,动脉壁新生内膜面积及新生内膜/中膜面积比均显著高于同系移植组(P<0.01)。PCR分析显示,嵌合体异系移植组和雄性异系移植组一致,在约225bp处均有1条特异性扩增条带,而雌性异系移植组则无相应的核酸扩增条带。结论:受体骨髓细胞作为移植物血管新生内膜平滑肌细胞的来源,参与移植物动脉硬化发生和发展。

同源异形盒基因与肿瘤

同源异形盒基因是一类特殊的转录调节因子 ,其表达蛋白通过序列特异性DNA结合活性 ,调控胚胎的发育和分化。近年来研究发现 ,同源异形盒基因异常表达与肿瘤的发生和发展密切相关。现综述有关同源异形盒基因在肿瘤发生。

血管生成抑制因子arresten抑制huvec细胞增殖和迁移的实验研究

目的探讨arresten对人脐静脉内皮细胞huvec增殖和迁移的影响,了解其抑制血管生成的途径。方法采用MTT比色法,观察不同浓度的arresten对huvec细胞增殖的影响,Transwell小室检测arresten对huvec细胞迁移的影响。结果MTT比色法显示,arresten对huvec细胞增殖具有抑制作用,随着浓度的增加,arresten对huvec细胞增殖抑制作用也增强,但当其浓度增加到800μg·L-1后其增殖抑制率不再提高;arresten浓度为0、400μg·L-1及800μg·L-1时迁移至Transwell小室膜下的huvec细胞数分别为105±8、77±9、53±6(0·05>P>0·01)。结论arresten能够抑制hu-vec细胞的增殖和迁移,这可能是其抑制血管生成的途径之一。

Survivin蛋白和mRNA在胆管癌中的表达和意义

目的检测胆管癌和癌旁胆管组织中Survivin蛋白和mRNA的表达,探讨其在胆管癌发生发展中的作用。方法应用免疫组化SP法检测48例胆管癌和其中30例癌旁胆管组织中Survivin蛋白的表达,同时应用RT-PCR技术检测这些组织标本中Survivin mRNA的表达,并与临床病理资料进行相关性分析。结果48例胆管癌组织中,Survivin蛋白阳性表达率为79.2%(38/48),在癌旁胆管组织中Survivin蛋白阳性表达率6.7%(2/30),两者比较差异有显著性意义(P<0.05)。48例胆管癌组织中,有30例Survivin mRNA的表达高于配对正常组织,胆管癌组织中Survivin mR-NA的表达水平(2.18±1.21)明显高于正常对照组织(1.01±1.03)(P<0.05)。临床病理资料的相关性分析显示,胆管癌组织中Survivin蛋白和mRNA的表达分布与临床病理特征无相关性。结论Survivin基因转录和蛋白表达可能参与胆管癌的发生发展过程,检测Survivin表达可能有助于阐明胆管癌的发生机制。

57例肝脏少见良性占位病变的回顾性分析

目的分析肝脏少见良性占位病变的病历资料,探讨诊断经验。方法回顾性分析华中科技大学同济医学院附属协和医院肝胆外科近十年经术后病理证实的57例肝脏少见良性占位病变的临床资料。结果多数患者无明显的既往史,无或者轻度具有临床症状和实验室指标异常,24例有典型影像学表现,但只有6例肝局灶性结节增生患者得到了正确的术前诊断。结论部分肝脏少见良性病变在CT和MR动态扫描下具有特征性影像学表现,遵循诊治流程,完善常规检查,掌握疾病特点,可提高术前确诊率。

瘤内注射pSTbAT-脂质体复合物对裸鼠移植瘤抑制效应的实验研究

目的:构建血管生成抑制因子arresten基 因的真核表达载体,并观察瘤内注射质粒DNA 脂质 体复合物对裸鼠移植瘤生长的影响。方法:利用 PCR方法,由重组质粒pGEM Arr中扩增出基因;将 该基因定向克隆于真核表达载体中。20只裸鼠皮 下注射HepG 2细胞,成瘤后以成功构建的质粒 DNA 脂质体复合物瘤内注射,治疗后采用免疫组化 方法检测肿瘤血管密度,并利用arresten基因瘤内注 射的方法对抑制肿瘤的效果进行分析。结果:我们 成功构建arresten基因真核表达载体(pSTbAT)。实 验组肿瘤生长速度较对照组慢(实验组平均15.3个 阳性血管/10个视野,对照组平均112.5个阳性血 管/10个视野)。结论:瘤内注射arresten基因质粒 DNA复合物能抑制裸鼠移植瘤的血管生成,并能抑 制移植瘤的生长。

鱼油脂肪乳在肝胆管恶性肿瘤术后病人肠外营养中的价值

目的:研究添加鱼油脂肪乳对肝胆管恶性肿瘤术后病人肝功能恢复和营养状况的评价。方法:肝胆管恶性肿瘤切除术后病人32例,随机分为对照组和研究组,两组病人均接受等氮、等热量PN支持,研究组加用鱼油脂肪乳。比较手术前后两组病人血清蛋白质、血糖、胆红素、转氨酶和碱性磷酸酶水平和感染并发症的发生率。结果:经术后连续7 d的治疗,研究组病人血清蛋白质和胆红素水平明显改善,与对照组比有显著性差异(P<0.05),感染并发症亦明显少于对照组。结论:肝胆管恶性肿瘤术后病人应用鱼油脂肪乳,有利于营养状况和肝功能的恢复。

瞬时转染Arresten基因对血管内皮细胞迁移的影响

目的研究瞬时转染Arresten基因对血管内皮细胞迁移的影响,并为后续动物实验探索最佳体内转染DNA-脂质体比例。方法以不同比例之质粒DNA-Lipofectamine 2000转染肝癌细胞系HepG-2细胞,瞬时转染经RT-PCR证实目的基因已转入细胞内48 h后收集上清,上清液与血管内皮细胞以划痕法共培养,计算迁移率。结果不同比例转染细胞的上清液均可抑制内皮细胞的迁移,以DNA-脂质体比例1:1,抑制率最高。结论瞬时转染Arresten基因可抑制血管内皮细胞的迁移, 并为后续动物实验奠一定的基础。

Arresten抑制HUVEC细胞增殖和管腔形成的实验研究

目的:探讨血管生成抑制因子arresten对人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖和体外血管腔形成的影响,了解其抑制血管生成的途径。方法:采用MTT比色法,观察不同浓度的arresten对HUVEC细胞增殖的影响;Matrigel胶体外管腔形成试验检测arresten对HUVEC细胞形成血管的影响。结果:MTT比色法显示,arresten对HUVEC细胞增殖具有抑制作用,随着浓度的增加,arresten对HUVEC细胞增殖抑制作用也增强,但当其浓度增加到800 ng/mL后其增殖抑制率不再提高; arresten浓度为0、400及800 ng/mL时,HUVEC细胞形成的血管腔数分别为17±2、9±1及5±1。结论:Arresten能够抑制HUVEC细胞的增殖,并抑制HUVEC细胞形成血管腔。

人arresten基因转染对自体移植静脉内膜增生的影响

目的探讨体内转染arresten基因对自体移植静脉内膜增生的影响。方法建立大鼠自体静脉移植模型。血管吻合术前,用脂质体介导重组质粒pSecTag2-AT(Ⅰ组),空载体pSecTag2转染(Ⅱ组)移植血管,等体积脂质体溶液处理移植血管(空白对照组,Ⅲ组)。各组动物均于4周后切取移植血管,RT-PCR检测移植血管中arresten mRNA的表达;常规HE,Verhoeff弹力纤维染色;计算机图象分析检测移植静脉血管内膜及中膜面积、厚度;免疫组化检测移植血管内膜α-SMA及PCNA的表达;West-ern blot检测TGF-β1蛋白的表达。结果Ⅰ组转染的移植静脉中有目的基因mRNA的表达,而Ⅱ、Ⅲ组无Ⅰ组内膜、中膜面积小均于Ⅱ组和Ⅲ组,差异有显著性(P<0.05)。而内膜面积/中膜面积3组间无统计学差异(P>0.05);Ⅰ组内膜厚度小于Ⅱ组和Ⅲ组,组间比较有统计学差异(P<0.01);α-SMA染色表明增生内膜中的细胞是血管平滑肌细胞;PCNA阳性细胞数及表达指数Ⅰ组均低于Ⅱ组和Ⅲ组(P<0.05);Ⅰ组TGF-β1蛋白的表达明显低于Ⅱ组和Ⅲ组。结论移植血管转染arresten基因,可有效抑制自体移植静脉内膜的增生,在防治血管移植术后再狭窄方面显示出良好的临床应用前景。

人Arresten基因的真核表达及其对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

目的:真核表达人Arresten蛋白,并研究其对体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和迁移的影响。方法:用脂质体介导,将含有人Arresten基因的重组质粒pSecTag2-AT转染COS-7细胞;应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染细胞目的基因mRNA表达;收集转染48h后上清液,浓缩后Westernblotting分析检测目的蛋白的表达。用转染细胞上清液处理平滑肌细胞后,CCK-8法检测细胞增殖;Transwell小室法检测细胞迁移。结果:RT-PCR结果显示转染Arresten基因的COS-7细胞基因组中存在有目的基因特异性片段(449 bp),表明基因转染成功;Western blotting结果表明转染细胞上清液中有目的蛋白表达。细胞体外增殖分析显示Arresten蛋白可显著抑制血管平滑肌细胞的增殖作用(F=40.154,P<0.01);Transwell小室法检测显示经对照细胞,载体DNA转染及重组质粒转染的COS-7细胞培养上清液处理的平滑肌细胞迁移数为(28.70±3.97)个、(26.10±4.53)个、(14.00±3.33)个(F=38.915,P<0.01)。结论:真核表达的人Arresten蛋白能有效抑制体外培养的血管平滑肌细胞的增殖和迁移。

大鼠主动脉内皮细胞和平滑肌细胞的原代培养及生物学特性比较

目的培养大鼠主动脉平滑肌细胞和内皮细胞,细胞纯化与鉴定,比较生物学特性的差异。方法采用血管环贴壁法培养动脉内皮细胞,组织块贴壁法培养动脉平滑肌细胞,并采用有限稀释法挑选内皮细胞单克隆,免疫细胞荧光鉴定二者的特异性标志,相差显微镜观察二者单个细胞及细胞群体在形态上的差异性,CCK-8试剂盒检测细胞的增殖,比较二者对胰酶消化,粘附,冻存后复苏的情况。结果血管环贴壁法成功培养血管内皮细胞,组织块培养法成功培养出血管平滑肌细胞,内皮细胞能够形成单克隆集落,培养的细胞均表达相应的特异性标志,内皮细胞增殖速度和平滑肌细胞有差异,内皮细胞对胰酶的耐受性较差,内皮细胞粘附所需时间短,对冻存后的耐受性较好。结论组织块贴壁法适合内皮细胞和平滑肌细胞的培养,有限稀释法能够纯化原代培养的内皮细胞,大鼠主动脉平滑肌细胞和内皮细胞在细胞形态、增殖、粘附、对胰酶的反应、冻存后复苏均存在差异。

乌司他丁抑制肝切除术后高迁移率族蛋白1的释放及对肝功能的保护作用

目的观察乌司他丁(ulinastatin,UTI)对肝切除术后患者血浆高迁移率族蛋白1(Hiigh mobility group box-1 protein,HMGB1)水平的影响及其对肝功能的保护作用。方法121例患者随机分为:对照组(58例)和乌司他丁组(63例),分别于术前1天和肝切除术后1,3,5,7天采用酶联免疫吸附法检测血浆高迁移率族蛋白1活性,采用全自动生化分析仪检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)水平。结果乌司他丁治疗组ALT、AST、HMGB1活性下降速度明显快于对照组(P<0.05);乌司他丁对TBIL的影响明显滞后于ALT和AST的变化,但是下降速度仍然快于对照组(P<0.05)。结论乌司他丁可能抑制HMGB1释放,对肝切除术患者肝功能具有保护作用。

人arresten因子对内皮细胞与LOVO细胞黏附的抑制

目的:观察人arresten因子对人脐静脉内皮细胞HUVEC与LOVO细胞黏附的影响,探讨与之相关的黏附分子表达的变化。方法:半定量RT-PCR检测arresten对人脐静脉内皮细胞表达血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)mrRNA的影响,Western-hlot检测VCAM-1蛋白表达的变化。孟加拉玫瑰红活细胞染色法观察arresten因子对内皮细胞与LOVO细胞黏附的影响。结果:RT-PCR及Western-blot结果表明VCAM-1在HUVEC细胞中高表达,但经过arresten因子处理的HUVEC细胞,其VCAM-1在mRNA水平及蛋白水平的表达均显著下降(P< 0．05)。孟加拉玫瑰红活细胞染色法显示arresten能抑制HUVEC细胞与LOVO细胞的黏附。结论:arresten因子通过降低内皮细胞VCAM-1的表达抑制内皮细胞与肿瘤细胞的黏附,这可能是其抑制肿瘤转移的一种途径。

阿托伐他汀对移植动脉慢性排斥反应的抑制作用及机制

目的:研究阿托伐他汀(atorvastatin)对大鼠移植动脉慢性排斥的抑制作用及机制。方法:建立大鼠腹主动脉移植慢性排斥反应模型,分为3组:异系移植对照组、异系移植治疗组和同系移植组,60d后对移植动脉行病理组织学检测,观察移植动脉内膜增生程度;并行免疫组织化学染色(SP法),检测移植动脉增殖细胞核抗原(PCNA)和平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况,行硝酸还原酶比色法测定移植动脉组织NO的含量。结果:异系移植治疗组血管内膜增厚程度(11.60%±2.40%)显著低于异系移植对照组(34.60%±6.40%,P<0.05),高于同系移植组(1.15%±0.65%,P<0.05);PCNA在异系移植治疗组(4.80%±0.80%)表达明显低于异系移植对照组(18.40%±1.80%,P<0.05),高于同系移植组(1.20%±0.40%,P<0.05)。结论:阿托伐他汀可抑制大鼠移植动脉慢性排斥反应,PCNA基因表达的下调可能是阿托伐他汀抑制移植动脉慢性排斥反应的机制之一。

阿托伐他汀对移植动脉硬化抑制作用的实验研究

目的研究阿托伐他汀(atorvastatin)对大鼠移植动脉硬化的抑制作用。方法建立大鼠腹主动脉移植模型。动物分为3组:(1)异系移植对照组;(2)异系移植实验组;(3)同系移植对照组。6 0 d后对移植动脉行病理组织学检测,观察移植动脉内膜增生程度,并行免疫组织化学染色(SP法)检测移植动脉增殖细胞核抗原(PCNA)和平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况。结果异系移植实验组血管内膜增厚程度显著低于异系移植对照组,(1),(2),(3)组移植动脉内膜增厚面积比分别为(3 5.2 0±6.3 5)%,(1 2.4 0±2.6 5)%,(1.2±1.1 0)%,差异均有统计学意义(P<0.05)。PCNA在异系移植实验组表达明显低于异系移植对照组和高于同系移植对照组,(1),(2),(3)组分别为(1 7.2 0±1.6 5)%,(5.4 0±0.8 0)%,(1.1 0±0.2 5)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论阿托伐他汀可抑制大鼠移植动脉硬化,PCNA基因表达的下调可能是阿托伐他汀抑制移植动脉硬化的机制之一。

Arresten对人脐静脉内皮细胞增殖的影响及其作用机制

背景与目的:Arresten是近年发现的血管生成抑制因子,它能抑制裸鼠移植瘤的生长和转移。本文探讨arresten对人脐静脉内皮细胞huvec增殖的影响及其相关机制。方法:应用MTT法测试细胞的生长曲线,检测不同浓度的arresten对huvec细胞增殖的影响,流式细胞仪检测arresten对huvec细胞凋亡的影响,半定量RT-PCR及W estern-b lot分别检测人脐静脉内皮细胞的VEGF在mRNA水平及蛋白水平的表达。结果:MTT比色法显示,ar-resten对huvec细胞增殖具有抑制作用并呈浓度依赖性,但当其浓度增加到800ng/L后其增殖抑制率不再提高,而此浓度时huvec细胞的凋亡率达到峰值的59%;经过arresten处理,huvec细胞的VEGF在mRNA及蛋白水平的表达量均显著下降。结论:arresten通过降低huvec细胞的VEGF表达抑制huvec细胞增殖并促进huvec细胞凋亡。