猪流行性腹泻病毒nsp1、nsp5和N蛋白的重组腺病毒载体的构建及免疫原性比较

为研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)nsp1、nsp5和N蛋白的免疫原性,试验以复制缺陷型人腺病毒5型(AdMax系统)为载体,利用PEDV-GDgh毒株(登录号为MG983755),通过PCR方法扩增出GDgh毒株nsp1、nsp5、N基因,并将其连接到腺病毒穿梭载体上,构建重组穿梭质粒。将3个重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体共转染至HEK-293A细胞中获得第1代重组腺病毒,分别命名为rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N。用第1代3株重组腺病毒接种HEK-293A细胞,连续传代,通过RT-PCR和Western-blot方法鉴定第3代重组腺病毒,并采用Reed-Muench法计算病毒半数组织培养感染剂量(TCID_(50))。以3株重组腺病毒的第3代病毒液免疫小鼠,收集血清并检测特异性IgG抗体水平。结果表明:试验成功构建出带有nsp1、nsp5、N基因的重组穿梭质粒;分别用重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N感染正常HEK-293A细胞,可产生典型的细胞病变并观察到荧光信号;目的基因正常转录后得到的目的蛋白可正确表达;3株重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N的TCID_(50)依次为1×10^(-8.35)/mL、1×10^(-8.50)/mL、1×10^(-7.66)/mL;免疫小鼠后均可产生针对目的蛋白的特异性抗体。说明试验成功构建的3株正常表达目的蛋白的重组腺病毒均具有免疫原性。

2020—2021年我国部分地区猪流行性腹泻病毒S1、M和ORF3基因遗传进化分析

为了解2020—2021年我国部分地区猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)毒株变异及遗传进化情况,试验从多个地区的51家猪场采集340份疑似感染PEDV的猪小肠组织、粪便和肛拭子,提取病毒核酸后采用RT-PCR方法扩增S1、M和ORF3基因并测序,与GenBank中PEDV参考毒株进行比对分析,利用生物信息学软件构建遗传进化树,分析核苷酸序列同源性及氨基酸序列。结果表明:共获得57份PEDV阳性样品,来源于14家猪场,猪场阳性率为27.5%,并对从阳性猪场获得的14株毒株进行命名。与经典毒株CV777相比,14株PEDV毒株的S1、M和ORF3基因均出现不同程度的氨基酸突变。在14株毒株的S1基因中,Heyuan2021-7毒株位于G1-2分支,其余13株位于G2分支,14株毒株与参考毒株GD-A核苷酸序列的相似性较高,为89.3%~99.9%,存在多处氨基酸的缺失和插入。在M基因中,14株毒株位于G2分支且与参考毒株FR-001核苷酸序列的相似性为98.1%~99.7%,只存在氨基酸突变。在ORF3基因中,FC2021-1、GDzq2020-12、GDmm^(2)021-1和GDjm-DG-2021-12毒株位于G1-2分支,其余10株位于G2分支,14株毒株与参考毒株VN-JFP1013核苷酸序列的相似性为95.4%~99.3%,同源性较高,只存在氨基酸突变。说明2020—2021年我国部分地区流行的PEDV毒株有G1型和G2型毒株,其S1基因较M和ORF3基因突变程度更大,PEDV的流行情况相对复杂。

细菌脂多糖对猪圆环病毒2型在PK-15细胞中复制的影响

研究脂多糖(LPS)对PCV2在PK-15细胞复制的影响,并探究其内在机制。用不同来源的LPS刺激感染PCV2的PK-15细胞,实时荧光定量PCR检测不同时间点对病毒复制的影响,以及NF-κB信号通路相关分子表达水平,吸附试验验证LPS对PCV2感染过程的影响,用Pymol软件对PCV2衣壳蛋白与LPS进行分子对接。结果表明,LPS刺激PK-15细胞12 h抑制PCV2的复制,而刺激24 h和48 h促进PCV2的复制,LPS还可以抑制PCV2病毒的吸附过程。对LPS与PCV2的Cap蛋白进行结构功能预测,发现二者有多处结合位点,表明LPS可能通过与PCV2核衣壳蛋白直接作用抑制PCV2与受体结合影响病毒前期吸附过程。后期LPS通过激活TLR4/NF-κB信号通路,促进IFN-β的表达,使病毒复制滴度增加。说明LPS对PCV2的复制存在双重影响,总体上促进PCV2的复制。

猪外周血单个核细胞增殖反应影响条件的探讨

应用 Ｌ１６ （４５） 正交试验， 对影响猪 Ｐ Ｂ Ｍ Ｃ 增殖反应的几个因素， 包括培养时间、 Ｐ Ｈ Ａ 浓度、细胞浓度等三个因素四个水平进行了比较和探索。试验表明几个因素对 Ｐ Ｂ Ｍ Ｃ 的增殖反应均有显著的影响（ Ｐ＜ ００５） ， Ｐ Ｂ Ｍ Ｃ 增殖反应的 Ｍ Ｔ Ｔ 比色法的最佳反应条件组合为 Ｐ Ｂ Ｍ Ｃ 浓度为１ ×１０６／ｍｌ， 植物血凝素 Ｐ Ｈ Ａ 的浓度为１２５μｇ／ ｍｌ， 细胞培养时间为２４ 小时； 影响增殖反应的先后顺序为 Ｐ Ｂ Ｍ Ｃ 浓度、 Ｐ Ｈ Ａｐ 浓度及细胞培养时间。同时确定了最有利于 Ｐ Ｂ Ｍ Ｃ 增殖的犊牛血清浓度为１０ ％ 。

猪圆环病毒病(PCVD)研究进展

猪圆环病毒病是由猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)引起的一大类猪病的统称,该病对我国的养猪业造成了极大的危害。就猪圆环病毒病在病原学、流行病学、染毒症状及综合防控措施对其进行了阐述,以期为其后续研究提供参考。

用PCR检测鸡新城疫病毒的初步试验

用ＰＣＲ检测鸡新城疫病毒的初步试验宋长绪，刘福安（华南农业大学广州５１０６４２）鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）的检测在临床诊断和口岸检疫等方面具有重要意义。尤其是在口岸检疫中，要求准确而快速，因此目前常用的血凝（ＨＡ）和血凝抑制（ＨＩ）试验远不能满足这方面的...

猪圆环病毒2型GD株ORF2基因的序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR从本室鉴定分离的PCV2GD株的细胞培养物中扩增出ORF2基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-ORF2并对其测序,结果表明所克隆的ORF2基因与其他PCV2的ORF2基因核苷酸序列同源性在92.1%～99.9%之间,推导的氨基酸序列同源性在90.2%～99.5%之间。

猪圆环病毒2型GD株ORF2基因重组腺病毒的构建及其表达

根据PCV2 ORF2基因的序列设计两条引物从PCV2的PK15细胞培养物中扩增出ORF2基因(702 bp)。将此基因片段克隆入pMD 18_T载体,经酶切、测序鉴定筛选出重组质粒pMD_ORF2。将PCV2 ORF2基因克隆入pAdeasy腺病毒载体系统的穿梭质粒pAdTrack_CMV中,获得重组穿梭质粒pAdTrack_CMV_ORF2,将重组质粒与腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒pAdCMV_ORF2,然后用PacⅠ线性化后转染293细胞,在293细胞内包装出重组腺病毒。通过荧光显微镜观察、PCR检测和Western blot检测证明PCV2 ORF2基因在293细胞内获得表达,ORF2多肽具有良好的免疫原性。

NDV融合蛋白裂解位点基因的重组昆虫杆状病毒表达载体的构建与鉴定

将新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株和ＬａＳｏｔａＥ４株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因从本实验室构建的重组质粒ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ中用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ切出。将这２个毒株的Ｆｃ基因定向克隆入昆虫杆状病毒表达载体ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ位点之间，获得２个毒株的Ｆｃ基因克隆ｐＸ３Ｆ４６Ｆｃ和ｐＸ３ＬａＦｃ。重组质粒用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌⅠ、ＰｓｔⅠ酶切法、ＰＣＲ和核酸探针法进行了鉴定，证明插入的基因来自ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵ－ＣＬａＦｃ，插入的位置和方向都正确。这２个载体的构建为Ｆｃ基因在昆虫细胞系统的表达创造了条件。

新城疫病毒的分子生物学

本文首先简要介绍了ＮＤＶ的一般分子生物学特征；然后较详细地论述了Ｆ蛋白及其基因、ＨＮ蛋白及其基因、Ｍ蛋白及其基因的分子生物学特征，对这几个基因的结构和功能进行了较系统的讨论。

腔上囊病病毒VP2基因重组腺病毒的构建

采用RT-PCR方法扩增腔上囊病病毒(IBDV)VP2 基因,亚克隆到 pAdlox转移载体,与野生型腺病毒ψ5一起共转染Cre8细胞,将IBDV-VP2基因在5型腺病毒中进行表达。结果,获得了含有腔上囊病病毒 VP2 基因的重组腺病毒 Adv VP2,感染重组腺病毒的细胞经 Western blotting检测,得到了1个约37 ku的VP2多肽,而感染空载体病毒的细胞及对照细胞则无此蛋白条带。证实,成功构建了表达IBDV VP2基因的重组腺病毒。

全群普免PRRS活疫苗的效果研究

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)在我国规模化猪场的传播与蔓延愈演愈烈,给养猪企业、尤其是给种猪场带来了难以估算的损失。其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒,主要引起母猪繁殖障碍和各日龄猪呼吸疾病。

PCR的基本原理及在兽医科学中的应用

ＰＣＲ的基本原理及在兽医科学中的应用宋长绪，杜伟贤（广东省农科院兽医研究所广州５１０６４０）聚合酶链式反应（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃ－ｔｉｏｎ，ＰＣＲ）是１９８５年Ｓａｉｋｉ等建立的，是以一段双链ＤＮＡ为模板，一对引物为引导，在四种脱氧...

血小板对体外培养的猪PBMC增殖反应和IL－2分泌的影响

本实验通过采取１０头猪的血液，经３０次实验探讨了自体和异体血小板（ＰＬ）对体外培养的猪外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）增殖反应和ＩＬ一２分泌的影响。证明了ＰＬ对猪ＰＢＭＣ的增殖反应和ＩＬ一２分泌均有增强作用。同时也比较了ＰＬ和红细胞（ＲＢＣ）对淋巴细胞的活化作用。并初步探讨了ＰＬ对淋巴细胞激活作用的机制。

猪瘟抗体致敏绵羊红细胞自凝现象的消除及其在反向间接血凝中的应用

1962年 Segre 即用反向间接血凝试验(RIA)诊断猪瘟病毒,但 RIA 推广应用发展很慢,除了其难以标准化、各批制剂结果差异较大外,一个很重要的原因是猪瘟抗体致敏绵羊红细胞(SRBC)容易发生自凝,不仅影响试验结果,而且使一些人对其特异性表示怀疑。本研究对猪瘟抗体致敏 SRBC 出现自凝的一些条件进行了一些探讨;对不同种动物血清在消除这种自凝方面进行了较系统的研究;将这种不同血清处理过的自凝致敏 SRBC 试用于 RIA 试验并与非自凝致敏 SRBC 的 RIA 试验进行了比较,现报告如下:一、材料与方法1.SRBC 采自健康成年公绵羊,以阿氏液抗凝和保存,以生理盐水洗涤三次后使用。2.正常兔、豚鼠、猪。

猪圆环病毒2型引发的疾病与防控

猪圆环病毒病（PCVD）或猪圆环病毒相关性疾病（PCVAD）是由猪圆环病毒2型（PCV2）引起的一大类猪病的统称。PCVD包括种猪的繁殖障碍、产房小猪的拉稀、断奶小猪的多系统衰竭综合征（PMWS）、生长肥育猪的皮炎肾病综合征（PDNS）等。

畜禽疫苗研究现状名词诠释及分类

畜禽疫苗研究现状名词诠释及分类宋长绪，杜伟贤（广东省农业科学院兽医研究所广州５１０６４０）在现代集约化畜牧业中，传染病的预防占有特别重要的地位。对传染病的预防目前最主要最有效的手段是疫苗接种。现在所使用的疫苗可以归纳为三大类，其一是以活的病毒或细菌通...

猪生殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的PRRSV保守基因序列设计合成了引物和探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。同时用建立的检测方法对组织病料进行了检测,并与常规RT-PCR做了对比。结果显示,所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法灵敏度可达5.0×100拷贝/μL,比常规RT-PCR灵敏度高100倍。用该方法对东莞、增城、湛江等地的猪血清和多种组织样品进行了检测。结果,该方法与常规RT-PCR检测方法的阳性符合率为100%。用该方法对3份不同的组织样品进行了重复检测,结果表明,该方法具有良好的重复性,可满足当前PRRS的诊断需要。

猪圆环病毒2型套式PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank登录的猪圆环病毒 2型 (PCV2 )的全基因组序列 ,设计了 2对引物 ,建立了检测PCV2的套式PCR方法。对该方法用序列分析、酶切等方法进行了鉴定。同时用该套式PCR方法对华南地区 2 87个猪场的 15 6 0份样品进行了检测 ,结果 ,983份为PCV2阳性 ,阳性率为6 3%。