金线莲化学成分的研究

目的:对金线莲(Anoectochilus roxburghii)的化学成分进行系统研究。方法:利用硅胶柱色谱、大孔吸附树脂柱色谱及Sephadex LH-20柱色谱进行分离纯化,通过理化常数和波谱分析技术进行结构鉴定。结果:分离得到了10个化合物,分别为:3(R)-β-D-吡喃葡萄糖氧基-丁酸(γ)内酯(Ⅰ),硬脂酸(Ⅱ),软脂酸(Ⅲ),β-谷甾醇(Ⅳ),琥珀酸(Ⅴ),对羟基苯甲醛(Ⅵ),胡萝卜苷(Ⅶ),4-β-D-吡喃葡萄糖氧基-丁酸甲酯(Ⅷ),对羟基桂皮酸(Ⅸ),邻苯二酚(Ⅹ)。结论:化合物Ⅰ、Ⅷ、Ⅹ为首次从该种植物中分离得到。

高效液相色谱法测定消炎止痒洗剂中黄芩苷的含量

目的建立消炎止痒洗剂中黄芩苷的含量测定方法。方法应用高效液相色谱(HPLC)法,采用AgilentHypersil ODS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)为流动相;检测波长为278 nm。结果黄芩苷进样量在0.037 5～0.750 7μg范围内与峰面积呈良好线性关系(r=1.000 0),平均加样回收率为99.44%(n=6),RSD=0.84%。结论该方法快速、准确、专属性强,可作为该制剂中黄芩苷的含量测定方法。

HPLC法测定肝宁丸中栀子苷的含量

目的:应用高效液相色谱法对肝宁丸中栀子苷进行含量测定。方法:选用依利特Hypersil C_(18)分析柱(150 mm×4.6 mm,5μm),乙腈-水(11:89)为流动相,检测波长为238 nm,流速1.0 ml·min^(-1)。结果:栀子苷在0.016 7～0.333 2 mg·ml^(-1)具有良好的线性关系,r=1.000 0,平均回收率为96.10%,RSD为0.96%。结论:本试验所确定的质量分析方法稳定可靠,可作为肝宁丸中栀子苷的含量测定方法。

高效液相色谱法同时测定人工牛黄甲硝唑胶囊中甲硝唑和胆红素含量

目的 建立同时测定人工牛黄甲硝唑胶囊中甲硝唑和胆红素含量的高效液相色谱法。方法 色谱柱为Hypersil BDS C18柱(200 mm×4.6 mm,5μm),流动相为1%醋酸水溶液-乙腈(梯度洗脱),流速为1 mL/min,检测波长分别为449 nm(胆红素)和320 nm(甲硝唑),柱温为30℃,进样量分别为10μL(甲硝唑)和5μL(胆红素)。结果 胆红素、甲硝唑质量浓度分别在1.98~13.85μg/mL和20.13~201.28μg/mL范围内与峰面积线性关系良好(r=0.999 9,n=7);定量限分别为0.10μg/mL和0.057μg/mL;精密度、稳定性、重复性试验结果的RSD均不超过1.0%;平均加样回收率分别为99.50%和99.76%,RSD分别为0.82%和0.48%(n=9)。结论 该方法专属性强、精密度好、准确性高、操作简便,可用于同时测定人工牛黄甲硝唑胶囊中甲硝唑和胆红素的含量。

虎尾轮根化学成分研究

目的研究虎尾轮(Uraria crinita)根的化学成分。方法采用硅胶、大孔树脂、Sephadex LH-20和ODS等色谱手段进行化学成分的分离纯化;依据理化性质、波谱数据和相关文献进行结构鉴定。结果分离并鉴定了14个化合物,分别为β-谷甾醇(β-sitosterol,1),硬脂酸(octadecanoic acid,2),软脂酸(palmitic acid,3),β-胡萝卜苷(β-daucosterol,4),(24R)-5α-豆甾-7,22(E)-二烯-3α-醇[(24R)-stigmast-7,22(E)-dien-3α-ol,5],2-(乙酰胺基)-苯甲酸甲酯[2-(acetylamino)benzoic acid,methyl ester,6],白桦脂醇(betulin,7),间羟基苯甲酸(m-hydroxybenzoic acid,8),5,7-二羟基-2'-甲氧基-3',4'-亚甲基二氧异黄酮(5,7-dihydroxy-2'-methoxy-3',4'-methylenedioxyisoflavanone,9),蔗糖(sucrose,10),槐二醇(sophoradiol,11),染料木素(genistein,12),染料木苷(genistin,13)和水飞蓟宾(silybin,14)。结论化合物5,6,7,8,9,10,11,13,14为首次从虎尾轮根中得到。

天山假狼毒化学成分及抗菌活性研究

目的研究瑞香科植物天山假狼毒Stelleropsis tianschanica(Pobed)的化学成分及抗菌活性。方法采用柱色谱的分离方法对天山假狼毒的95%乙醇提取物进行分离纯化,利用核磁共振NMR、高分辨质谱等方法,结合理化鉴定化合物结构。采用滤纸片法对不同浓度的单体化合物的抗菌活性进行筛选。结果从天山假狼毒中分离鉴定11个化合物,分别为:(E)-11-methoxy-11-oxoundec-2-enoic acid(1)、Methyl-(E)-9-oxooctadec-10-enoate(2)、3-Hydroxyphthalimide(3)、Dimethyl hexadecanedioate(4)、Octadecane-1,18-dimethylester(5)、壬二酸氢甲酯(6)、正十六烷酸(7)、bothrioclinin(8)、Daphnolon(9)、β-谷甾醇(10)、芝麻素(11)。化合物7(128μg/ml)对金黄色葡萄球菌有一定抑制活性,抑菌圈大小为8.65 mm。化合物9(128μg/ml和64μg/ml)对鲍曼不动杆菌有抑制活性,抑菌圈大小分别为12.65 mm和8.05 mm。结论化合物1~9为首次从天山假狼毒中分离得到;其中化合物1~3的碳谱数据为首次报道。化合物7和化合物9均表现出一定的抗菌活性。

SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)体外相对效力双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的建立SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)体外相对效力的双抗体夹心ELISA检测方法,并进行验证。方法采用细胞融合技术制备SARS-CoV-2单克隆抗体,以其作为包被抗体,SARS-CoV-2多克隆抗体作为检测抗体建立用于检测SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)体外相对效力的双抗体夹心ELISA法,并验证方法的线性范围、专属性、精密性、耐用性。采用建立的方法检测20批SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)的体外相对效力,并与相应体内效力结果进行相关性分析。结果筛选出单克隆抗体20D8用于方法的建立,纯化后效价可达105,蛋白浓度为2.69 mg/mL。SARS-CoV-2灭活疫苗参考品浓度在3.2~200 WU/mL范围内,与A_(450/630)呈良好的线性关系,线性方程为:y=0.8468 x-1.483,R2为0.9919;建立的方法可特异性检测SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞),与其他疫苗均无交叉反应;重复性验证CV为9.91%,中间精密性验证CV为11.03%;SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)供试品于37℃解吸附22、24、26 h的体外相对效力CV为8.59%,36、37、38℃解吸附24 h的体外相对效力CV为6.62%。20批SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)体外相对效力与体内效力检测结果呈正相关性(r=0.7,P<0.05)。结论建立的双抗体夹心ELISA检测方法法具有良好的专属性、精密性及耐受性,且操作方便,可用于SARS-CoV-2灭活疫苗(Vero细胞)体外相对效力的检测和质量控制。

新型冠状病毒核蛋白抗原含量ELISA检测方法的建立及验证

目的制备抗重症急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)多克隆抗体和抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N蛋白)单克隆抗体,建立针对SARS-CoV-2 N蛋白抗原含量ELISA检测方法,并对该方法进行验证。方法将SARS-CoV-2灭活病毒纯化抗原免疫日本大耳白兔制备兔多克隆抗体;免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术制备杂交瘤细胞株,经蚀斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)和间接ELISA法筛选获得抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体。采用过碘酸钠氧化法对单克隆抗体5E11进行标记,偶联HRP分子,用方阵滴定法对包被抗体(50~800 ng/孔)和酶标抗体(1∶500~1∶8000)的工作浓度进行优化,建立SARS-CoV-2 N蛋白抗原含量ELISA检测方法,确定方法线性范围和最低检测限,并对其准确度、精密度、耐用性、特异性进行验证。用建立的方法检测3批SARS-CoV-2灭活疫苗工艺过程阶段样品中N蛋白抗原含量。结果选择高效价的SARS-CoV-2兔抗血清纯化后的多克隆抗体作为包被抗体,特异性强的单克隆抗体5E11作为酶标抗体,包被抗体最佳工作浓度为100 ng/孔,酶标抗体最佳工作浓度为1∶1000,建立了针对SARS-CoV-2 N蛋白抗原含量ELISA检测方法。该方法在1.6~200 WU/mL范围内,抗原含量与对应的A450/A630呈良好的线性关系,R2>0.99,最低检出限为1.6 WU/mL;高、中、低(100、50、25 WU/mL)浓度SARS-CoV-2内部参考品检测均值回收率分别为104.33%、101.33%和98.67%,CV分别为7.06%、7.47%和12.39%;重复性验证CV为8.54%,中间精密度验证CV为8.37%;耐用性验证回收率在88%~112%之间;该方法可特异性识别SARS-CoV-2全病毒Virion、重组N蛋白,与其他抗原均无交叉反应。结论成功建立了SARS-CoV-2 N蛋白抗原含量ELISA检测方法,该方法具有良好的线性相关性,准确度、精密度、特异性良好,可用于SARS-CoV-2灭活疫苗中N蛋白抗原含量的检测。

基于杆状病毒表达系统制备的诺如病毒GⅡ.17型病毒样颗粒体液免疫原性研究

目的初步评价基于杆状病毒表达系统制备的诺如病毒(Norovirus,No V)GⅡ.17型病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)的免疫原性。方法制备并纯化No V GⅡ.17 VLPs,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophroesis,SDS-PAGE)、免疫印迹法(Western blot)、透射电镜和粒径检测方法对其进行鉴定。GⅡ.17型VLPs采用肌内免疫途径,免疫Balb/C小鼠。研究Al(OH)_(3)佐剂组4个免疫剂量(0.4、2、10、50μg)及不使用佐剂组3个剂量(0.4、2、10μg)的免疫应答。另外,设PBS、PBS加佐剂2个对照组。将每组的5只SPF级雌性健康Balb/c小鼠(6~8周龄)分别于0、3周进行初次免疫和加强免疫。于免疫前(第0天),初次免疫后3周(第21天),加强免疫后1周(第28天)、3周(第42天)分别眼眶采血。采用ELISA检测VLP-特异性Ig G抗体,组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)受体-VLPs结合阻断试验检测50%阻断滴度(50%of block‐ing titer,BT_(50))。组间特异性Ig G抗体水平和BT_(50)水平进行对数转换后,采用Two-way ANOVA法进行统计学处理。结果成功制备No V GⅡ.17 VLPs。经SDS-PAGE检测,No V GⅡ.17 VLPs纯度为95%,Western blot分析可见特异性条带,经透射电镜和粒径分析颗粒形态完整,粒径均一。2针肌内免疫后,疫苗不同剂量组(0.4、2、10μg)产生VLP-特异性Ig G抗体水平分别为4222、67559、135118;BT_(50)抗体水平分别为12.5、57.4、174.1,Al(OH)_(3)作为佐剂的不同剂量组(0.4、2、10μg)产生VLP-特异性Ig G抗体水平分别为12800、117627、409600;BT_(50)抗体水平分别为19.0、100.0、229.7,抗体水平明显高于无佐剂组(P均<0.05)。结论Al(OH)_(3)佐剂具有显著的免疫增强作用,肌内注射作为免疫途径,2针免疫,剂量高于2μg可产生较高的抗体Ig G和BT_(50)水平。应用含铝佐剂的GⅡ.17型VLPs免疫小鼠,诱生了较好的HBGA受体结合阻断抗体,可作为诺如病毒疫苗的组分抗原。