牙鲆(Paralichthys olivaceus)抗缪勒氏管激素Ⅱ型受体基因(amhr2)表达特征分析及功能初探

抗缪勒氏管激素Ⅱ型受体(anti-Müllerian hormone receptorⅡ,Amhr2)是抗缪勒氏管激素(anti-Müllerian hormone,Amh)的特异受体。amhr2基因在鱼类性腺分化和发育中发挥重要作用,更决定了有的鱼种的性别,然而,相关功能研究较为有限。本研究旨在明晰amhr2在我国重要海水养殖鱼类—牙鲆(Paralichthys olivaceus)性腺分化和发育过程中的表达特征,并初步探究其功能。首先,克隆了牙鲆amhr2-CDS序列,共1536bp,编码511个氨基酸。系统发育分析显示牙鲆Amhr2近C端较为保守,与其他硬骨鱼类聚为一枝,并与上游sp1以及下游的prr13和PCBP2在基因组中共定位。蛋白结构分析显示,牙鲆Amhr2包含信号肽、跨膜结构域和保守的酪氨酸蛋白激酶结构域。进而,利用实时荧光定量PCR(q PCR)分析表明,牙鲆amhr2主要表达于性腺,且在精巢中的表达极显著高于卵巢(P<0.01),其在I-V期精巢中持续高表达,而在卵巢中仅在I期高表达,后显著下降(P<0.05)。性腺分化期基因的表达,是对雌核发育组(对照组,20±0.5℃,100%雌性)与雌核发育高温诱导组(HT组,28±0.5℃,100%雄性)鱼苗进行检测的,amhr2在对照组全长(totallength,TL)2cm的实验鱼性腺中表达最高,后逐渐下降;而HT组实验鱼性腺中的表达呈现先上升后下降的趋势,并在精巢开始分化的6cm TL时表达最高。利用Hela细胞进行亚细胞定位分析发现,Amhr2与其配体Amh均定位于细胞质。同时,通过原核表达重组牙鲆Amh,并用其孵育离体性腺组织,q PCR分析显示精巢中amhr2的表达没有显著变化,但卵巢中表达显著上升(P<0.05)。进一步通过双荧光素酶报告分析表明,Amh和Amhr2共转染能够显著抑制雌激素合成的关键芳香化酶基因cyp19a的表达(P<0.01)。综上所述,牙鲆amhr2主要表达于精巢,但在不同性腺发育时期表达不同,且其可能与Amh共同影响cyp19a的转录,对雄性表型形成的启动和性腺发育起作用。

斑马鱼早期胚胎血细胞分布特征

斑马鱼是研究动物发育生物学的模式生物,被用于研究血管血液疾病的机制及相关病理特征。为了解斑马鱼早期胚胎血液循环情况,本文收集斑马鱼受精卵并培育至孵化,在不同时间节点利用定量PCR分析血细胞、血管及血红蛋白相关基因的表达情况;同时,使用邻联茴香胺对血红蛋白进行染色,并对染色胚胎进行组织切片,利用解剖镜和显微镜进行观察和拍照;将基因表达与血红蛋白染色分布相对应分析斑马鱼早期胚胎不同时期血液系统发育情况。定量PCR结果显示受精后12 h,原始造血开始,受精后24 h,血管开始形成,72 h之前斑马鱼血液循环系统已基本发育完全;而通过染色观察有一定的滞后,在斑马鱼胚胎受精后30 h才可以观察到血红蛋白在卵黄囊中出现,受精后48 h可在心脏观察到红细胞,此时通过切片可以在躯干和体节中发现红细胞;通过切片还可以在72 h胚胎的脑部发现红细胞;受精后96 h斑马鱼胚胎血液循环基本发育成熟。本研究不仅仅从基因水平及蛋白水平对应描述了血管及血细胞(红细胞为主)的发育过程及分布特征,也为通过简单检测方法分析血液相关疾病的病理及毒理特征奠定了基础。

山东近海褐牙鲆自然与养殖群体生化遗传结构及其遗传变异的比较分析

山东近海褐牙鲆自然群体活样本共 79尾 ,分别于 1 996年 5月、1 997年 1月和 1 998年 4月采自青岛近海 ;养殖群体活样本 5 2尾于 1 997年 1 2月采自山东荣成寻山养鱼场。采用水平淀粉胶和垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳方法及 3种缓冲系统 (TC、EBT和TG)分别对自然和养殖群体的 1 5种同工酶进行生化遗传分析。结果表明 ,山东近海牙鲆自然群体的多态基因座位比例 ( 31 .0 % )和群体平均杂合度 ( 0 .0 80 2 )都明显高于养殖群体 ( 2 4 .1 % ,0 .0 788) ;在自然群体的 9个多态基因座位、养殖群体的 7个多态基因座位中 ,除了Cat(P <0 .0 5 )和Idhp - 1(P <0 .0 5 ,养殖群体中 )有显著差异、Ldh -C(P <0 .0 1 )完全偏离Hardy -Weinberg定律外 。

山东近海牙鲆同工酶的生化遗传分析

1996年5月，1997年1月、12月和1998年4月在山东青岛和荣成近海采集了131尾活牙鲆共710个生化样品，采用水平淀粉胶和垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，对牙鲆的25种同工酶进行了分析。结果检测出了LDH、MDH、MEP、IDHP、G3PDH、AK、CK、ACP、PGM、SDH、ADH、CATSOD、GDH和GPI等15种同工酶在牙鲆眼睛、肌肉、心脏、肝脏、胸鳍和肾脏等6种组织或器官中的表达情况。对牙鲆15种同工酶进行了生化遗传分析，获得了基本酶谱。比种同工酶共记录出29个基因座位，其中9个基因座位Ldh-A、Ldh-C、Idhp-1、Acp-1、Pgm、Sdh、Adh、Cat和Gdh为多态，其多态座位比例为31．03％。

牙鲆同质雌核发育人工诱导研究

采用紫外线照射对牙鲆(Paralichthys olivaceus)精子遗传物质进行完全灭活,灭活精子与牙鲆卵子授精获得雌核发育单倍体受精卵,再通过冷休克或静水压法对其进行倍性恢复,成功诱导出同质雌核发育牙鲆。牙鲆精子遗传灭活的最适紫外照射剂量为3.6×10^(-3)J/mm^2(照射时间为180s);(15±0.2)℃水温下冷休克法诱导的最适条件为受精后85min,0～2℃水温处理45min;静水压法的最适诱导参数为受精后85min,600kg/cm^2压力处理6min,诱导效率静水压法明显高于冷休克法。两种方法诱导组胚胎发育较对照组在原肠期前都有明显滞后现象,开口前同质雌核发育仔鱼比异质雌核发育仔鱼存活率低,但二者全长生长无显著差异(P<0.05)。这些结果为牙鲆纯系建立及其应用提供了重要依据。

漠斑牙鲆养殖群体RAPD遗传多样性的初步分析

利用RAPD技术对由美国引进的漠斑牙鲆（Paralichthys lethostigma）齐殖子一代群体的遗传多样性进行了研究。实验用漠斑牙鲆鱼苗于2004年10月取自山东莱州大华水产有限公司，共24尾，全长平均为16．6mm±1．99mm。活体取其肌肉，用高盐法柚提获得总DNA，琼脂糖电泳检测，Beckman DU-6100型紫外分光光度仪定量后用随机引物进行PCR扩增，从25个随机引物中筛选出11个用于群体遗传学分析，共获得77条清晰重复性高的DNA片段，大小在100～2000bp之间，多态谱带比例和群体平均杂合度分别为66．23％和0．3526。

夏牙鲆(♂)与牙鲆(♀)人工杂交的细胞遗传学初步研究

于2004年11～12月在青岛薛家岛养鱼场采用夏牙鲆(Paralichthysdentatus)的精子与牙鲆(Paralichthysolivaceus)的卵子实施了多次人工杂交实验,并进行了父本母本鱼类个体、子代的染色体制片观察和细胞中DNA相对含量的流式细胞仪检测。结果表明,夏牙鲆染色体数为48,核型为2n=48t、臂数NF=48;子代的染色体数和核型与父母本的一样,也为2n=48t;子代的细胞中DNA的相对含量也表明其为二倍体。因此,可以明确其为杂交的后代,而不是雌核发育。

星斑川鲽(Platichthys stellatus)养殖群体的RAPD分析

利用RAPD技术对星斑川鲽养殖群体的遗传多样性进行了研究。将实验用星斑川鲽养殖群体的活鱼苗解剖，取其肌肉，高盐法抽提获得总DNA，质量鉴定和浓度测定后用随机引物进行PCR扩增，从20个随机引物中筛选出18个用于群体遗传学分析，共扩增出133条带，谱带大小为100～2000bp，大多数谱带分布在250～1000bp。多态谱带数为83，每个引物扩增谱带数为1～14条，平均为7条。多态谱带比例为62．41％，Shannon的信息指数和Nei的多样性指数分别为0．21和0．3166。

漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)养殖群体微卫星座位遗传多态性的分析

为了解漠斑牙鲆群体的遗传背景，并为漠斑牙鲆人工养殖业健康和可持续发展提供理论依据，利用筛选获得的10对微卫星引物对漠斑牙鲆（Paralichthys lethostigma）养殖群体进行了群体遗传学分析。该群体等位基因平均数为4．0，平均杂合度为0．597 7。各多态座位的有效等位基因数则为1．7～4．1，多态座位杂合度的观察值为0．2917～O．9583，无偏倚期望值范围为0．4053～O．7553，Hardy-Weinberg遗传偏离指数为－0．4517～0．3466。每个座位上的多态信息含量为0．353-0．746，个体识别率为0．176～0．559，非父排除率为0．405～0．755，其累积个体识别率和非父排除率均达到0．9999和0．9937，这些座位均属中识别力以上的遗传标记，可以应用于今后的漠斑牙鲆的遗传育种（如雌核发育等）研究。

美国红鱼(Sciaenops ocellatus)的核型研究

1996年 12月对养殖的美国红鱼采用注射秋水仙碱方法 ,取其肾脏直接进行染色体制片 ,镜检得 :美国红鱼染色体数目为 4 8条 ,全部是端部着丝点染色体 ,其核型公式是 2 n=4 8t,臂数 NF=4 8。

黑鲷三倍体人工诱导的初步研究

三倍体鱼类,因具有不育性、生长快、抗病力强和饲养管理容易等优点,所以国内外水产科学工作者对其进行了广泛的研究,并取得了一定的成功和效益。在国内,虽然淡水鱼这方面的工作较多也较深入,但海水鱼三倍体人工诱导还尚未见到报道。本文系于1989年3—6月对黑鲷进行人工诱导三倍体的初步研究。

三倍体牙鲆的核型证明

于1990，1993—1994年以捕自青岛近海的牙鲆亲鱼，采用冷休克法（0－4℃）进行多倍体的人工诱导实验，以期掌握牙鲆细胞遗传学特征和研究遗传育种方法。通过实验得到了三倍体牙鲆并进行培育。在原肠胚期采用空气干燥法、Giemsa染色获得正常二倍体、三倍体的染色体制片。镜检得，牙鲆二倍体染色体以2n=48，均为端部着丝点染色体，核型为24t，其管数NF=48；三倍体的染色体3n=72，也都为端部着丝点染色体，其臂数NF=72，并依据二倍体的枝型得出了三倍体的核型图。

黑鲷三倍体的人工诱导研究

分别于1989年3—6月、1990年3—5月在天津和青岛两地采用冷、热休克法对黑鲷进行三倍体的人工诱导研究。结果表明,冷休克法诱导三倍体的效果好于热休克法,其最适诱导条件为卵子在受精后5min,温度为3—4℃的海水中处理10—20min,三倍体诱导率最高可达50.35％;正交试验证明,三倍体率受冷、热休克法的三因素影响程度的顺序由大到小依次为,处理时间、处理时刻、处理温度;黑鲷染色体数目:2n=48,3n=72,它们的染色体组型也同时获得。

我国海水鱼类染色体操作研究与应用进展

染色体操作技术包括雌核发育及多倍体人工诱导等,可快速纯化性状,获得单性群体、生长快和不育/低育个体,是现代遗传育种和遗传改良的重要技术途径,近年来其应用也越来越广泛。其快速纯化、低育及生物安全的特点在基因编辑、借腹怀胎等前沿技术的研究与应用中也极具价值。本文在简述鱼类染色体操作概念和诱导原理基础上,系统介绍了我国海水鱼类雌核发育、多倍体的人工诱导和生物学机制,及其在遗传育种中的研究进展与生产实践等,以期为染色体操作在海水鱼类新种创制、生物技术中的研究与应用提供参考。

中国海洋生物增殖放流现状与建议

近海生物种群的衰退和资源量下降，使人们对水产品日益增加的需求远远得不到满足。增殖放流可以有效地增加渔业产量，并且修复渔业生态环境，已成为许多国家常用的资源修复方法之一。增殖放流是一项复杂的系统工程，但是国内有关增殖放流的相关基础研究较少，很多增殖放流工作带有较大盲目性。本文综述了目前中国海洋生物增殖放流的基本状况，分析了增殖放流的生态和遗传学风险，同时总结了中国渔业增殖放流存在的问题，并提出相应的建议。以期为中国增殖放流工作的高效开展、放流技术的改进以及渔业资源的可持续利用提供参考。

山东近海牙鲆(Paralichthys olivaceus)自然和养殖群体10个微卫星基因座位的遗传多态性分析

采用微卫星遗传标记技术对山东近海牙鲆自然群体和养殖群体的遗传多样性进行了研究。实验所用牙鲆于 2 0 0 3年 5月分别采自山东近海和青岛胶南养鱼场 ,各 2 0尾 ,取全血或肌肉组织 ,以酚 仿抽提方法提取基因组DNA ,利用筛选获得的 1 0对微卫星引物进行PCR扩增 ,反应产物经 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、EB显色 ,用ImageMaster1DElite(Version3 0 1 )软件分析电泳结果 ,并计算了相应的遗传学参数。结果表明 ,在自然和养殖群体中 ,1 0个基因座位的等位基因平均数 (a)分别为 6 7和 6 1 ,每个基因座位有效等位基因数 (ae)分别为1 8— 6 8和 2 5— 6 7,群体平均杂合度 (H)分别为 0 81 2 0和 0 731 0 ;两个群体间的遗传相似性系数、遗传距离和基因分化系数为 0 85 5 8、0 1 5 5 7和 0 0 5 5 8;自然群体内每个座位上的多态信息含量 (PIC)为 0 5 9— 0 84、个体识别率 (DP)为 0 5 4— 0 86、非父排除率 (PPE)为 0 41— 0 72 ,其累积个体识别率和非父排除率均达到 0 9999,表明所选座位属中高识别力的遗传标记 ,可以将它们应用于今后牙鲆雌核发育群体的遗传变异分析以及进一步的遗传育种的研究中。

中国近海带鱼种群生化遗传结构及其鉴别的研究

用淀粉胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析了中国近海带鱼（Ｔｒｉｃｈｉｕｒｕｓ）９个取样群体４７２尾鱼的１１种同工酶．并对它们进行了生化遗传分析，共记录出２４个基因座位．各取样群体遗传相似度和遗传距离的计算表明，中国近海的带鱼不是过去认为的一个种、３～５个种群，而是存在３个不同的种８个种群．

梭鱼仔鱼耳石日轮形成及自然种群日龄的鉴定

梭鱼实验种群样本,系于1987年5月,从山东大沽河口搜集的亲鱼经人工授精后孵出的仔鱼在实验室培育取得;自然种群样本,于同年同地区采集。对于实验种群耳石生长轮形成的周期性进行了研究。结果表明,实验种群培育天数(D)与耳石生长轮数(N)之间的关系以回归式N=D-1.89表达之;根据实验种群耳石轮纹形成的周期性规律,鉴定了自然种群的日龄,表明二者具相似的周期性规律;协方差分析表明,梭鱼早期阶段的生长,自然种群比实验种群快。