双分子荧光互补技术(BiFC)分析玉米SSⅠ与PPDK1之间的蛋白互作

【目的】分析玉米胚乳可溶性淀粉合成酶(SSⅠ)与质体型糖酵解途径关键催化酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)的蛋白互作关系,揭示可能发生互作的亚细胞位置。【方法】采用酶切连接的方法构建326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1双分子荧光互补表达载体,转化农杆菌EHA105,瞬时浸染烟草叶片组织,激光共聚焦显微镜下观察SSⅠ和PPDK1相互作用产生的荧光信号。【结果】双酶切试验鉴定表明,326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1重组载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;双分子荧光互补试验中,可观测到SSⅠ和PP-DK1相互结合而产生的黄色荧光信号。【结论】证实SSⅠ和PPDK1能够在植物活体细胞内发生真实的蛋白互作。

抗虫抗除草剂转基因玉米HiII-NGc-1的遗传稳定性分析

目的基因和目标性状遗传稳定性是转基因植物新品种选育和产业化的重要前提。以进入农业部环境释放的抗虫抗除草剂双价转基因玉米Hi II-NGc-1为试验材料,采用PCR、RT-PCR和免疫试纸条技术检测转基因玉米连续3代目的基因cry NGc和bar整合及表达的遗传稳定性,采用心叶期除草剂草铵膦抗性鉴定和心叶期/穗期亚洲玉米螟抗性鉴定实验详细分析了目标性状的遗传稳定性。研究结果表明:Cry NGc和PAT蛋白在Hi II-NGc-1中连续3代遗传稳定,高世代稳定耐受正常5倍大田除草剂草铵膦使用浓度,心叶期和穗期高抗亚洲玉米螟性状稳定,具有潜在的产业化应用价值。转基因玉米Hi II-NGc-1目的基因和目标性状遗传稳定性的明确为开展下一步生物安全评价奠定了基础,对复合性状转基因抗虫抗除草剂玉米新品种的选育和产业化具有重要意义。

转cry1Ab/Gc基因玉米的不同转化事件Bt蛋白表达和抗虫性分析

分析不同转化体Bt蛋白表达量和评估其抗虫性,进而筛选优异转化事件是转基因玉米新品种培育研究中的重要环节.为分析转cry1Ab/Gc基因玉米中Bt蛋白表达特性与抗虫性的关系,筛选优秀转化事件,研究以三个转化事件HG-1、HG-2、HG-3为试验材料,利用ELISA检测、玉米螟生测等技术,在室内和田间详细分析心叶期和抽丝期玉米抗虫蛋白表达量,并评估抗虫性.研究结果表明,同一转化事件不同组织或器官Cry1Ab/Gc蛋白含量存在显著差异,均表现为叶>茎>根;不同时期叶片Cry1Ab/Gc蛋白含量存在显著差异,表现为抽丝期>心叶期;不同转化事件间,心叶期转化事件HG-1的叶片、抽丝期转化事件HG-1和HG-2的茎中Cry1Ab/Gc蛋白的含量明显高于其他材料.室内和田间亚洲玉米螟生测试验结果表明:不同转化事件抗虫性差异显著,转化事件HG-1在心叶期和抽丝期亚洲玉米螟抗性显著高于其他两个玉米转化事件,与该时期Cry1Ab/Gc蛋白高表达的试验结果一致.本研究结果证实不同玉米转化事件Bt蛋白表达量显著差异,心叶期和抽丝期Bt蛋白表达量与亚洲玉米螟抗性呈正相关,可以作为抗虫转基因玉米优秀转化体初步筛选的重要技术指标,具有可操作性强、技术稳定性好、节省时间等优势,为抗虫转基因玉米新品种培育研发提供数据参考.

CryNGc蛋白在转基因玉米和大肠杆菌中表达的等同性研究

转基因玉米表达蛋白的身份鉴定和对玉米表达蛋白与大肠杆菌表达蛋白的等同性研究是进行蛋白安全性评价的重要前提。以人工合成的新型重组抗虫蛋白CryNGc为研究材料,通过密码子优化、cryNGc杀虫蛋白编码基因化学合成、原核表达载体构建、大肠杆菌表达条件优化等方法原核表达CryNGc蛋白。在此基础上,利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交分析和液相色谱-串联质谱鉴定技术对玉米转化体HiII-NGc-1和大肠杆菌表达的CryNGc重组蛋白进行了特性分析和一致性评价。研究结果表明,抗虫基因cryNGc在转基因玉米和大肠杆菌中表达的蛋白电泳迁移率、免疫活性和氨基酸组成具有一致性,证实玉米转化体HiII-NGc-1中产生的CryNGc蛋白的特性与理论预测相符,且与大肠杆菌表达的CryNGc蛋白实质等同。研究结果为进一步开展新型抗虫重组蛋白CryNGc玉米转化体的生物安全性评价提供了理论基础和数据支持。

玉米淀粉分支酶基因SBEⅡ b高效沉默表达载体的构建及转化表达

淀粉分支酶(starch branching enzyme,SBE)是淀粉合成的限速酶。为了进一步研究SBEⅡb沉默对玉米生长及直链淀粉合成的影响,克隆了玉米(Zea mays)淀粉分支酶SBEⅡb基因片段,构建了SBEⅡb的发卡结构表达载体p TFU-SBEⅡb hairpin,用农杆菌介导法将其导入玉米HiⅡ幼胚中,经除草剂筛选获得了194株转化再生植株,其中4株结实,获得转基因种子35粒。T1代植株经PCR及试纸条检测获得3株阳性材料,半定量RT-PCR结果得出SBEⅡb的表达量降低,推断出基因表达水平降低对直链淀粉的合成具有正效应。

玉米质体型AGPase小亚基和糖酵解关键酶PPDK1互作关系的研究

【目的】利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在烟草叶肉细胞中分析玉米ADP-葡萄糖焦磷酸化酶质体型小亚基(AGPase-bt2)与丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)之间的相互作用。【方法】构建326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-PPDK1双分子荧光表达载体,转化农杆菌EHA105,瞬时浸染烟草叶肉细胞,激光共聚焦显微镜下观察AGPase-bt2和PPDK1的相互作用。【结果】双酶切试验表明,326-CYCHA-AGPase-bt2、326-CYNEE-PPDK1载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;浸染烟草叶片后,AGPase-bt2和PPDK1在叶肉细胞中高效表达,出现BiFC荧光信号。【结论】AGPase-bt2和PPDK1在植物细胞内存在真实互作关系。

NaCl和Na_2CO_3胁迫下的高粱MAPKs基因家族表达模式

通过在全基因组水平上进行NaCl和Na2CO3胁迫下高粱MAPKs基因表达模式的研究,探索高粱MAPKs基因在胁迫条件下参与信号传导的机理.结果表明,从高粱基因组中鉴定出16个MAPKs基因,命名为SbMPKs.这些SbMPKs在NaCl和Na2CO3胁迫下的表达模式明显不同,表明中性盐胁迫诱导的信号响应不同于碱性盐.在NaCl胁迫下,除了SbMPK13的表达量在12 h时达到最大值外,所有高粱MAPKs基因在24 h内表达持续上调;在Na2CO3胁迫下,只有SbMPK3,SbMPK10和SbMPK13表达上调,表明这3个基因可能与高粱碱性盐胁迫应答反应有关.系统发育分析表明,SbMPK13属于C组MAPKs基因,并且与水稻中受脱落酸(ABA)和盐胁迫诱导表达的OsMAPK2亲缘关系较近,进一步证实了SbMPK13可能是参与高粱盐胁迫应答的重要调控基因.

羊草几丁质酶ClassⅡ基因的克隆、生物信息学分析及原核表达

根据已报道的羊草几丁质酶基因的EST序列,利用RACE技术,从100mmol/L Na2CO3胁迫的羊草叶片中克隆得到羊草几丁质酶基因cDNA序列全长(GenBank登录号为GQ397277),命名为LcChi2基因。经序列测定和生物信息学分析,结果表明该序列开放阅读框为771bp,编码256个氨基酸,为Ⅱ类几丁质酶,属于19家族,分子量约为27.4kDa,预测等电点为8.67,与小麦(Triticum aestivum)、大麦(Hordeum vulgare)、黑麦(Secale cereale)和水稻(Oryza sativa)等植物的几丁质酶具有高度的同源性,序列相似性分别为96.5%、96.5%、95.2%和80.5%,推测LcChi2蛋白与其他几丁质酶执行相似的功能。在大肠杆菌中进行了原核表达,为后期植物转化的验证准备多克隆抗体。本研究所获得的信息为今后对羊草几丁质酶基因功能的进一步研究奠定了基础。

分子改造cryNAc基因的转基因水稻创制及其功能评价

利用蛋白质工程技术对Cry蛋白进行改造是创制新Bt蛋白的主要途径之一。Cry蛋白改造涉及结构域交换、定点突变、蛋白截断等多种方法。利用结构域交换、密码子优化方法对Bt基因进行合理化设计改造,获得新型Bt蛋白编码基因cry NAc,进一步利用农杆菌介导法转入吉林省水稻主栽品种吉粳88中,并开展了转基因后代的分子鉴定和抗虫性功能评价相关研究工作。分子检测结果表明cry NAc基因成功整合进入吉粳88基因组中,且稳定表达;Cry NAc蛋白在各个发育时期根、茎、叶中的表达存在显著差异,灌浆期水稻叶片中蛋白表达量最高(2 959.73 ng/g),分蘖期茎中蛋白表达量最低(150.9 ng/g);田间接虫试验表明cry NAc转基因水稻抗二化螟的能力显著。上述结果表明cry NAc基因可作为新的cry基因用于作物遗传改良。

羊草LVAP1基因的克隆及生物信息学分析

克隆羊草VHA-c基因并预测其编码蛋白质结构和功能.由羊草总RNA经RACE克隆获得VHA-c基因cDNA,采用生物信息学方法预测蛋白结构和功能.获得羊草VHA-c基因cDNA,命名为LVAP1基因(GenBank登录号为GQ397276),LVAP1基因开放阅读框为498 bp,编码165个氨基酸,有4个α-螺旋跨膜结构域,在第4个结构域上含有一个高度保守的G lu142残基,推测它是质子的结合位点.进化树分析显示,羊草LVAP1蛋白与小麦、碱蓬和冰叶日中花等植物的VHA-c蛋白具有高度的同源性,推测LVAP1亚基与其他VHA-c亚基执行相似的功能.

一种新型几丁质酶基因LcChi2在转基因水稻中的功能分析

LcChi2是从羊草中克隆获得的一种新型几丁质酶基因,生物信息学分析表明该基因表达一个Ⅱ类几丁质酶,属于19家族。在双子叶模式植物烟草中过表达该基因表现为抗真菌病害的生物学功能提高,然而在单子叶植物中是否具有抗病功能至今未知。以吉林省主栽水稻品种吉粳88为供试材料,构建了含LcChi2基因和除草剂筛选标记Bar基因的双价植物表达载体,利用农杆菌介导的遗传转化方法成功获得LcChi2和Bar基因过表达的转基因水稻。T_1代转基因水稻的PCR、RT-PCR和几丁质酶活性检测结果表明LcChi2基因已成功整合到水稻基因组中,并且表达产物表现出较高的外源几丁质酶活性;稻瘟病活体接种实验结果证明该基因显著提高了水稻的抗病性;抗除草剂鉴定结果表明获得的转基因水稻新材料同时具有除草剂抗性。研究结果证明LcChi2基因可有效提高单子叶植物的抗病性,该基因在利用现代生物技术开展抗病作物遗传改良方面具有重要的应用价值。

玉米COBRA基因家族分析及重要成员ZmCOBL03基因编辑

利用生物信息学的方法分析玉米COBRA家族10个成员的序列特征、与其他物种的进化关系和组织特异性表达模式。结果表明,10个COBRA家族基因都含有CCVS保守结构域,并且均定位于细胞膜上。系统进化分析结果显示,该家族可以分为2个亚族,每个亚族内的基因具有相似的基因结构和理化性质。以ZmCOBL03为候选基因开展基因编辑,采用双靶标位点的设计思路,利用农杆菌介导的玉米遗传转化技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术,成功获得ZmCOBL03基因靶向突变的玉米株系。表型分析证实,ZmCOBL03基因突变后严重影响了玉米的正常发育,表现为植株极端矮化且生殖生长受到抑制,证实ZmCOBL03基因在植物细胞壁纤维素合成中发挥重要作用。

不同物种启动子结构特征比较

比较基因组分析表明植物比低等生物和动物含有更多的编码基因。研究人员猜测这主要由于植物基因组中编码转录因子等调控蛋白的基因数量多于动物导致的,意味着植物的转录调控机理可能更加复杂。本研究,针对拟南芥、大肠杆菌以及人类的全基因组启动子序列开展了DNA自由势能分布,弯折度,单核苷酸组成分布及碱基偏差等特征的计算分析比较,期望从启动子结构差异特征分析结果中找到支持上述假说的实验证据。研究结果表明:三个物种的启动子具有转录起始位点(TSS)附近热稳定性最差,弯折度强的共性特征。拟南芥和人类一样在TSS上游(-25bp)具有相似的能量降落峰,而大肠杆菌的最大降低峰出现位置与真核生物不同,约在-10 bp和-35 bp区域。研究还发现拟南芥启动子区域自由势能,可弯折度,核苷酸的分布趋势与人类和大肠杆菌相比具有显著的差异特征。拟南芥TSS上游和下游区域能量和弯折度的变化范围最大,并且具有独特的GC偏好分布特征。我们的研究结果从计算生物学角度上阐明启动子结构差异是导致物种间转录因子识别机制不同的重要原因之一,实验数据进一步支持植物启动子转录调控机制比动物更加复杂的研究推论。

植物Dof转录因子的结构特点及功能研究进展

Dof(DNA binding with one finger)蛋白是植物中特有的转录因子,其N-末端具含保守锌指结构的Dof结构域,能够识别AAAG序列;Dof转录因子能够发挥多种功能,主要是由于其具有多变的C-末端,它是Dof蛋白的特异转录调控结构域。在植物中,Dof转录因子的功能主要与维管发育、叶片极性、保卫细胞特异基因的调控、碳氮代谢、种子发育和萌发、光响应及光周期调控的开花和花粉发育、次生代谢物合成、防御反应、生长素响应等生理过程有关。将这些进程归纳为组织分化、种子发育和代谢调节三个方面,通过对植物Dof转录因子的结构特点及功能进行分析,为Dof转录因子的深入研究提供参考。

抑制ZmCol3基因表达调控玉米开花期

采用ZmCol3基因RNAi载体构建、农杆菌介导玉米遗传转化、转基因材料开花期表型鉴定等研究方法,评估抑制ZmCol3基因表达对玉米开花期的影响。转基因玉米基因组PCR结果证实,人工合成RNAi片段已成功整合到玉米基因组中。qRT-PCR结果表明,在不同转基因玉米株系中ZmCol3基因表达受到不同程度的抑制。温室转基因玉米开花期相关性状调查结果表明,抑制ZmCol3表达,可以将玉米抽雄、散粉和吐丝时间提前2~3 d。研究结果证实,ZmCol3具有调控开花期的生物学功能,抑制该基因表达进而缩短玉米开花期可以作为行之有效的方法应用到玉米熟期改良研究中。

分子改造Cry蛋白基因的转基因玉米创制及其抗虫功能评价

利用结构域交换和密码子优化方法对苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫晶体蛋白Cry1Ab进行合理化设计改造,获得新型Bt蛋白编码基因cry FLIa。利用农杆菌介导法将该基因转入玉米Hi II中,对转基因后代开展分子鉴定和抗性评价等相关工作。结果表明,cryFLIa基因已整合进玉米基因组中,连续3代自交材料检测显示,转基因玉米目标基因正常表达并稳定遗传;蛋白在植株叶片中发育各时期的表达各异,在灌浆期蛋白表达量较高(471.883 ng/g)。室内生测和田间人工接虫试验表明,转cryFLIa基因玉米具有抗亚洲玉米螟的能力。

新型高抗玉米螟虫、耐除草剂转基因玉米和非转基因玉米营养成分的比较分析

转基因食品与亲本之间的营养成分差异是衡量转基因食品安全性的重要指标之一。本研究在前期获得复合性状抗虫耐除草剂转基因玉米HiII-NGc-a的基础上,对含有目标基因cry1Ab/Gc、bar的转基因玉米种子和其亲本非转基因玉米的营养成分进行分析,包括水分、脂肪、灰分、粗纤维、蛋白质、氨基酸、脂肪酸、矿物质、维生素和抗营养因子。结果表明,转基因玉米与非转基因玉米营养成分相似,大多数营养成分的测定结果都在正常参考范围内,该转基因玉米和非转基因玉米在营养成分上具有实质等同性。

改造Cry1Ac蛋白C端对转基因水稻抗二化螟虫的影响

二化螟虫的泛滥严重影响水稻的产量,cry1Ac基因是目前世界上应用最广泛和最高效的抗虫基因之一,但二化螟虫通过进化会逐渐对其产生抗性。通过改变蛋白结构来构建新的Cry蛋白是解决这一问题的有效途径之一。为分析改造Cry1Ac蛋白C端能否对转基因作物抗虫性产生影响,本研究采用Cry1Ja蛋白的C端替换Cry1Ac蛋白的C端,重组获得CryFLAc蛋白。将cry1Ac基因和编码CryFLAc蛋白的cryFLAc基因分别构建到pTF101.1-ubi植物表达载体上,利用农杆菌介导方法转化到吉林省水稻品种吉粳88中;采用PCR、RT-PCR、免疫检测试纸条检测的方法确定cry1Ac、cryFLAc基因整合和表达情况;通过室内和田间抗虫性测试评价CryFLAc和Cry1Ac蛋白对T1代转基因水稻抗虫性的影响。研究发现:cry1Ac、cryFLAc基因均成功整合到水稻基因组中,并稳定表达;转cryFLAc基因水稻抗二化螟水平达到抗性级别,转cry1Ac基因水稻达到高抗级别;转cry1Ac基因水稻二化螟抗性高于转cryFLAc基因水稻。结果表明:Cry1Ja蛋白的C端替换Cry1Ac蛋白的C端不会提高转基因水稻的抗虫性。上述研究为人工设计合理化改造Cry蛋白提供了新的理论依据。

一种可视化快速筛选转基因玉米的方法研究

利用可视化表型分析快速筛选转基因后代可以有效提高遗传转化和基因功能的验证效率。本文研究一种高效、低成本的筛选转基因玉米的新方法,该方法利用愈伤组织和糊粉层特异性表达启动子Ltp2和可视化红色荧光蛋白编码基因DsRed构建植物表达载体pCAMBIA3300-DsRed,通过农杆菌介导法侵染玉米HiII幼胚,诱导出分子检测为阳性的红色愈伤组织,肉眼可视化筛选使得组培筛选更加直观,缩减了筛选时间。T_(0)代玉米子粒中呈现出阳性的红色种子和阴性的白色种子,肉眼快速分离鉴定转基因后代材料,极大地减少了分子检测工作量,降低后续基因功能验证的研究成本。

转AtGA2ox1基因玉米自交系和杂交种的耐旱性分析

AtGA2ox1基因是调控赤霉素代谢的关键基因。以3个AtGA2ox1基因转化体回交转育玉米自交系和配制的杂交组合为研究材料,系统开展玉米自交系和杂交种的耐旱性分析。结果表明,3个转化体在回交转育过程中,多世代间遗传稳定。苗期不同转化体玉米在干旱胁迫24 d后复水仍能正常生长;对照材料胁迫后叶片卷曲至萎蔫,复水后无法恢复生长。通过对丙二醛、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等生理生化指标的跟踪监测发现,干旱胁迫条件下转基因玉米的MDA含量低于对照约20%;超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性高于对照20%,降低玉米细胞膜氧化损伤来增强转基因玉米耐旱胁迫能力,与玉米耐旱表型一致。成熟期干旱条件下,对照玉米果穗变小,穗长变短,穗重减轻。转基因杂交种的粒重和百粒重显著高于对照,其中杂交种NKYGA09*X923-1百粒重高于对照杂交种21.21%,表现出潜在的育种价值。