丙肝病毒融合抗原基因导入烟草叶绿体及转化株同质化的研究

植物生物反应器的研究已成为当前基因工程领域的一个新生长点。本实验用 PCR方法 ,从丙型肝炎病毒 c DNA文库中克隆了非结构 NS3区基因片段及核心抗原 C区基因片段 ,并在两段基因间加入连接肽 SPGS的密码子序列 ,构建成融合抗原基因 NS3- C。将该融合基因转入烟草叶绿体转化及表达载体中 ,通过基因枪转化法得到转基因植株。对 NS3- C融合基因转化植株进行 PCR及 Southern杂交试验分析 ,证明外源基因已整合到烟草叶绿体基因组中 ;对转化植株的 Southern杂交试验还表明 ,通过不断地分化筛选培养 。

烟草叶绿体16S启动子的克隆改造及转基因植株的获得

设计引物并克隆了烟草叶绿体16SrDNA基因的启动子,并在其下游加入了rbcL基因的SD序列,以使该启动子能有效翻译外源基因;进一步以aadA基因作为外源基因,以psbA基因的3’序列为终止子,构建成aadA基因表达盒;将此表达盒插入烟草叶绿体同源片段trnK-psbA-trnH中,构建成烟草叶绿体转化及表达载体P16T.用基因枪微弹轰击转化法,将该载体导人野生型大烟草叶绿体中,建立了烟草叶绿体遗传转化体系,转化频率为0.5株/枪.对转化植株进行PCR及遗传杂交实验分析,证明外源基因已在烟草叶绿体中稳定整合并遵循母系遗传规律.

人A33基因5′调控区的组织特异性表达元件

在对人A33基因 5′调控区初步研究的基础上 ,进一步采用体外足迹法、电泳迁移率变更分析(EMSA)和定点突变等实验对A33启动子的 - 10 4～ + 2 5bp区域进行了重点研究 .在A33启动子的- 10 4～ + 2 5bp区域内存在两个转录正调控元件 ,它们分别位于转录起始位点上游 - 86～ - 6 8区(A)和 - 40～ - 19区 (B) .通过对转录因子数据库的查找 ,发现A区与转录因子GKLF (gut enrichedKr櫣ｐｐｅｌ likefactor)的结合位点吻合 ,而B区则没有找到与之相应的转录因子 .EMSA实验表明 ,A区与核蛋白的结合存在组织特异性 ,而B区的结合则无组织特异性 .推测A区所包含的顺式调控元件很可能是决定A33基因组织特异性表达的关键元件 .根据B区所处的位置和富含AT来分析 ,它极有可能是和通用转录因子及RNA聚合酶结合的区域 .A和B两个区域的点突变都可使A33启动子的活性丧失 85

苏云金芽孢杆菌(Bt)晶体毒蛋白基因在烟草叶绿体中的表达

将全长３．５ｋｂ的Ｂｔ基因３'端缺失，得到长为２．１ｋｂ、１．８ｋｂ的基因。分别将这３个长度 （１．８ｋｂ２．１ｋｂ、３．５ｋｂ）的基因置于水稻叶绿体ｐｓｂＡ基因的启动于和终止子调控之下，并与选择 标记基因ａａｄＡ（编码氨基糖苷－３'－腺苷酸转移酶，具壮观霉素抗性）表达盒相连５以烟草叶绿 体基因ｔｒｎＨ－ｐｓｂＡ－ｔｒｎＫ为同源片段，构建成叶绿体转化载体ｐＢＴ３、ｐＢＴ８和ｐＢＴ２２。用基因枪 把Ｂｔ基因导入烟草叶绿体中，以壮观霉素筛选，获得转化再生植株。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｗｅｓｔｅｒｎ检测 分析证明Ｂｔ基因已整合进入烟草叶绿体基因组中并得到表达。且子代呈现壮观霉素抗性，即 外源基因得到稳定的遗传。利用转基因植株叶片对棉铃虫进行杀虫实验，有些转化植株表现 出较强的抗虫性。总体上来说，转Ｂｔ全长基因的烟草植株，其杀虫效果最好，其余两种差异不 大。首次报道将Ｂｔ基因成功转入高等植物叶绿体并获得表达。

丙肝病毒融合抗原基因NS_3-C定点整合入衣藻叶绿体基因组的研究

用ＰＣＲ 方法从丙型肝炎病毒（ＨＣＶ） ｃＤＮＡ 文库中克隆了两段ＤＮＡ 片段，即ＨＣＶ 基因组非结构ＮＳ３区抗原基因（约０．７ ｋｂ）和核心抗原Ｃ区抗原基因（约０．６ ｋｂ）的ｃＤＮＡ 片段。在两段ｃＤＮＡ 间加入连接肽Ｓｅｒ－ Ｐｒｏ－ Ｇｌｙ－ Ｓｅｒ 的密码子序列，构建成融合抗原基因ＮＳ３－ Ｃ。将该融合基因与衣藻叶绿体基因ａｔｐＡ 的启动子和ｒｂｃＬ 基因的３′末端连接，得到丙肝病毒融合抗原基因ＮＳ３－ Ｃ表达盒，再将该表达盒与选择标记基因ａａｄＡ 表达盒和衣藻叶绿体基因组同源片段连接，构建成衣藻叶绿体转化载体ｐＳＳ６。基因枪法转化衣藻叶绿体，经壮观霉素筛选获得转化再生的单藻落，对转基因衣藻的ＰＣＲ 和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交分析表明，融合抗原基因ＮＳ３－ Ｃ已整合到衣藻叶绿体基因组中。

除草剂抗性基因bar导入烟草叶绿体

将编码Phosphinothricin acetyltransferase的bar基因与水稻叶绿体psbA基因的启动子和终止子构建成表达盒,连同烟草叶绿体基因组同源片段rpl2-trnH-psbA和trnK-ORF509A以及选择标记基因aadA一起构建成烟草叶绿体转化载体pTZBA.基因枪法转化烟草叶片,经壮观霉素筛选获得转化再生植株.分别以1.0kb的叶绿体同源片段trnK-ORF509A和0.6kb的bar基因为探针,对转基因烟草叶绿体DNA进行Southern杂交检测,证明外源基因已整合入烟草叶绿体基因组中.抗性试验表明,转基因植株具备除草剂(PPT)抗性.

人肠组织特异抗原A33基因5′调控区的克隆及其功能分析

用基因组步行法 (genomewalker)克隆了人A33抗原基因的 5′调控区 94 0bp片段 ,并用PCR法鉴定了这一克隆的正确性 .将该序列提交GenBank ,登录号为AF2 0 0 6 2 6 .用引物延伸法 (primerex tension)确定了A33基因的转录起始位点 ,发现该位点位于一个TATA盒下游 10个碱基处 .以增强型绿色荧光蛋白为报告基因构建了不同长度的A33启动子 5′缺失载体 ,用脂质体介导的方法将这些载体转染LoVo、HeLa、2 93等细胞 ,比较了EGFP的表达水平 .研究发现 ,A33启动子上主要转录调控元件以及与组织特异性表达相关的转录调控元件位于A33启动子的 - 10 4～ + 2

烟草叶绿体转化载体的构建及转基因植株的获得

选择烟草叶绿体基因组同源片段rp12-trnH-psbA和trnK-ORF509A,及aadA抗壮观霉素基因,构建烟草叶绿体转化载体pTRZ。制备pTRZ DNA金粉子弹,通过基因枪轰击烟草幼苗叶片,经壮观霉素筛选获得了愈伤组织和转化再生植株。对烟草叶绿体转化植株进行PCR和Southern分析,结果证明其中No.13、16、23为整入了外源aadA的叶绿体转基因植株,同时其子代呈现壮观霉素抗性,aadA基因得到稳定遗传。

转基因植物生产动物疫苗的研究及应用

转基因植物生产动物疫苗的研究及应用范国昌１，２山松１钱凯先２沈桂芳１（１．中国农业科学院生物技术研究中心，北京１０００８１）（２．浙江大学生物科学与技术系，杭州３１００２７）ＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｎＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＰｌａｎ...

未折叠蛋白反应──细胞内信号传导新途径

真核细胞中，当未折叠的蛋白在内质网上增多的时候，一系列内质网居民蛋白基因的转录也随之增加，这称为未折叠蛋白反应（ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ， ＵＰＲ）。在酵母细胞中未折叠蛋白的感受器是Ｉｒｅｌｐ蛋白，它能检测到未折叠蛋白的聚集，并将信号传递到细胞核内，诱导ＵＰＲ特异转录因子Ｈａｃｌｐ ｍＲＮＡ的剪接成熟。成熟的 Ｈａｃ１ｐ蛋白能通过与 ＵＰＲ元件（ＵＰＲ－ｅｌｅｍｅｎｔ）的结合诱导含有这一元件的基因转录，从而启动 ＵＰＲ。在 ＵＰＲ信号传递途径中，磷酸化的 Ｉｒｅ１Ｐ与 Ｇｃｎ５／Ａｄａ复合物可通过解开染色体促进Ｈａｃ１ｐ活性的发挥；而Ｐｔｃ２ｐ能通过使Ｉｒｅｌｐ去磷酸化而反向调节ＵＰＲ。目前发现ＵＰＲ与磷脂生物合成存在交叉的共同途径，人类中也存在Ｉｒｅｌｐ的类似物。

论法治对科学发展及构建和谐社会的保障作用

本文从贯彻落实科学发展观和构建社会主义和谐社会之间的关系入手,得出二者之间存在互为表里、互为因果的辩证关系。又对法治的含义和功能进行了分析,论证了法治的目的与贯彻落实科学发展观和构建社会主义和谐社会所欲追求的终极目标是一致的,并具有保障性的作用。

以组蛋白去乙酰化酶为靶标的抗癌药物研发进展

基因表达的精确控制是细胞增殖分化和器官正常生长和发育的基础。基因转录和激活程序依赖于组蛋白乙酰化酶(histone acetylase,HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)的协同作用。当HDAC过度表达并被转录因子募集,就会导致特定基因的不正常抑制,从而导致癌症及其他疾病。目前以HDAC作为抗癌靶点的研究方兴未艾,现综述HDAC类似蛋白(HDLP)的晶体结构和当前存在的HDAC抑制剂的作用机制、结构种类、研发状况和构效关系,以及新的HDAC抑制剂CS055的研发策略。

新型抗肿瘤组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺的合成

目的:合成西达本胺{N-(2-氨基-5-氟苯基)-4-[N-(吡啶-3-丙烯酰)氨甲基]苯甲酰胺}。方法:以吡啶甲醛为起始原料,通过Knoevenagel反应,制得吡啶丙烯酸,然后以N,N’-碳酰二咪唑(CDI)为催化剂,通过2步酰化反应,合成目标产物。结果:目标产物的产率为29%。结论:本法条件温和,操作简便,适合工业化生产。

以PPAR为靶标的抗2型糖尿病药物研发策略

近年来发现2型糖尿病与过氧化物酶增殖体活化受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)存在着密切的联系,该受体也因此成为设计抗2型糖尿病药物的主要靶标。目前,有很多针对PPAR所设计的化合物处于临床研究阶段,现介绍这方面的进展,并阐述开发抗2型糖尿病药物所面临的困难及相应的策略。

新型胰岛素增敏剂西格列羧的合成

目的:合成新的胰岛素增敏剂西格列羧[(2S)-2-[2-(4-氟苯甲酰)苯胺]-3-{[4-(2-咔唑-9-基)-乙氧基]苯基}丙酸]。方法:以4-氟苯甲酰环己酮、L-酪氨酸甲酯、1,2-二澳乙烷以及卡巴唑为原料,经3步反应合成目标化合物。结果:原料易得,反应条件温和,总收率达10.8％。结论:该方法合成路线短,操作简便,反应可控性好,适合于工业生产。

PDGFR-β抑制剂细胞筛选模型的构建及应用

目的建立针对以血小板衍生生长因子受体-β(plate-let-derived growth factor receptor-β,PDGFR-β)为靶标的特异及灵敏的细胞模型体系,用于酪氨酸激酶受体(receptor tyro-sine kinase,RTK)抑制剂的筛选和研究。方法构建人的PDGFR-β真核表达载体pcDNA3.1-PDGFR-β,将其转染至NIH 3T3细胞,获得稳定转染的细胞克隆,并对其进行功能学鉴定及应用;应用瞬时转染PDGFR-β的HeLa细胞,建立PDGF依赖性的受体磷酸化细胞模型。结果在无血清培养条件下,稳定转染人PDGFR-β的NIH 3T3细胞获得了PDGF依赖性的细胞增殖特征;HeLa细胞经瞬时转染PDG-FR-β后,可以检测出明显的PDGF依赖性的受体酪氨酸磷酸化。通过应用已知PDGFR-β抑制剂及自行合成化合物,确证了以上细胞模型具有机制针对性特征。结论所构建并确证的细胞模型具有特异性和灵敏性,适用于较高通量的PDGFR-β和其它RTK抑制化合物的体外筛选与研究。