黄芪甲苷经由miR-125a-5p/NLRP1轴减轻椎间盘突出髓核细胞损伤

目的在白介素-1β(IL-1β)诱导退变的人髓核细胞中,探究黄芪甲苷对miR-125a-5p及其靶基因介导的信号通路的作用,揭示黄芪甲苷(astragaloside IV,AS-IV)对髓核细胞增殖、凋亡以及炎症反应的影响。方法实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-125a-5p和核苷酸寡聚化结构域(NOD)样受体蛋白1(nucleotide oligomerization domain(NOD)-like receptor protein 1,NLRP1)在椎间盘突出患者髓核组织中的表达,用IL-1β诱导髓核细胞退变,在20、50和80μg·mL^(-1)黄芪甲苷干预浓度下检测miR-125a-5p和NLRP1的表达,在IL-1β和80μg·mL^(-1)黄芪甲苷处理的髓核细胞中单独或共同转染miR-125a-5p模拟物和NLRP1过表达质粒,然后分别检测细胞增殖、凋亡和炎症因子分泌情况,蛋白质免疫印迹(Western blot)检测细胞中信号通路相关蛋白p56和p38的磷酸化水平。结果椎间盘突出(lumbar disc herniation,LDH)患者的髓核组织中miR-125a-5p表达下调,NLRP1表达上调。黄芪甲苷促进IL-1β处理的髓核细胞中miR-125a-5p表达,减少NLRP1表达以及p56和p38蛋白的磷酸化水平。黄芪甲苷促进髓核细胞增殖,减少凋亡和炎症反应。结论黄芪甲苷通过上调miR-125a-5p表达,抑制NLRP1的表达和NF-κB/MAPK信号通路,减少IL-1β诱导的髓核细胞损伤。

圣愈汤对IL-1β诱导的髓核细胞凋亡和炎症反应的影响及其机制研究

目的探讨圣愈汤对白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)处理髓核细胞凋亡及炎症反应的影响及其潜在作用机制。方法将25只雄性SD大鼠分别给予生理盐水,低、中、高剂量圣愈汤(9 g/kg、18 g/kg和36 g/kg)以及阳性药物(尼美舒利分散片,0.18 mg/kg)灌胃,连续给药14 d,收集血清。(1)分离培养原代髓核细胞,10 ng/ml的IL-1β处理构建髓核细胞退变模型。圣愈汤含药血清和阳性药物含药血清处理髓核细胞24 h,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活力,末端标记法(Terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)和比色法分别检测细胞凋亡和胱天蛋白酶3(caspase-3)活性,酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测IL-6和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)水平。免疫印迹法检测Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、核转录因子κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)。(2)将细胞分为对照组、模型组(经10 ng/ml的IL-1β处理)、圣愈汤含药血清高剂量组(经10 ng/ml的IL-1β和高剂量圣愈汤含药血清处理)、Kdo2脂质(KLA)组(经TLR4激动剂KLA、IL-1β和高剂量圣愈汤含药血清处理)。免疫印迹检测TLR4、NF-κB和cleaved caspase-3蛋白表达,免疫荧光检测TNF-α和IL-6表达。结果与对照组比较,模型组髓核细胞活力降低,髓核细胞凋亡率、Caspase-3活性以及TNF-α和IL-6水平升高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。模型组髓核细胞中TLR4和NF-κB蛋白水平均较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,各剂量圣愈汤含药血清组和阳性药物组髓核细胞活力升高,细胞凋亡率和Caspase-3活性降低,TNF-α和IL-6水平减少,TLR4与NF-κB蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.01)。KLA有效减弱圣愈汤含药血清对IL-1β处理髓核细胞TLR4、NF-κB、cleaved caspase-3、TNF-α和IL-1β蛋白表达的抑制作用,差异有统计学意义(P<0.01)。结论圣愈汤能够抑制退变髓核细胞凋亡和炎症反应,其作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路活化有关。

针刺联合穴位贴敷治疗风寒阻络型神经根型颈椎病的疗效观察

目的:观察针刺联合穴位贴敷治疗风寒阻络型神经根型颈椎病的临床疗效。方法:选择符合纳入标准的风寒阻络型神经根型颈椎病患者94例,依据随机数字表随机分为对照组和观察组,每组各47例,研究期间对照组脱落4例、观察组脱落1例。对照组口服塞来昔布,观察组给予针刺联合穴位贴敷,两组均治疗30 d。观察两组McGill疼痛量表、颈椎活动度(前后屈伸、左右弯屈、左右旋度数)、脊柱侧弯夹角、肌电-诱发电位(正中神经肌电波传导速度、尺神经肌电波传导速度、臂丛段诱发电位峰潜伏期、颈髓段诱发电位峰潜伏期),检测两组动脉血流指数[颈椎动脉阻力指数(VARI)、基底动脉平均血液流速(MBA-FV)、椎动脉的平均血液流速(MVA-FV)、椎基底动脉内径(VAD)]、血清炎性因子[白介素(IL)-1β、IL-4、巨噬细胞移动抑制因子(MMI)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]的水平。结果:观察组治疗后及随访3、6、12个月的总有效率分别为97.8%(45/46)、91.3%(42/46)、80.4%(37/46)、71.7%(33/46),高于对照组的83.7%(36/43)、72.1%(31/43)、51.2%(22/43)、39.5%(17/43)(均P<0.05)。与治疗前比较,两组McGill疼痛量表各维度积分和总积分降低(P<0.05),颈椎活动度、脊柱侧弯夹角增加(P<0.05);正中神经肌电波传导速度、尺神经肌电波传导速度加快(P<0.05),臂丛段诱发电位峰潜伏期、颈髓段诱发电位峰潜伏期缩短(P<0.05),VARI、TNF-α、MMI、IL-1β、IL-4水平降低(P<0.05),MBA-FV、MVA-FV、VAD水平增加(P<0.05);且与对照组治疗后比较,观察组上述指标均明显改善。结论:针刺联合穴位贴敷可明显缓解风寒阻络型神经根型颈椎病患者颈肩疼痛,提高颈椎功能,促进神经肌电波传导,增加椎动脉血流量,减轻机体炎性反应。

牛膝总皂苷调控Nampt/NAD/Sirt1轴诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化

背景:研究表明,骨髓间充质干细胞可向髓核样细胞分化,但分化机制尚不明确。目的:利用牛膝总皂苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化,并探讨Nampt/NAD/Sirt1轴在其中的作用。方法:取第3代SD大鼠骨髓间充质干细胞,随机分成4组:(1)骨髓间充质干细胞组;(2)骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷组;(3)骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷+烟酰胺单核苷酸组(烟酰胺单核苷酸为促NAD合成的外源性小分子物质);(4)骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷+FK866组(FK866为烟酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂)。连续诱导培养14d,阿尔新蓝染色法检测细胞内糖胺多糖含量,RT-PCR检测髓核样细胞相关基因COL2、Aggrecan、KRT19和PAX1 mRNA表达,Western blot检测COL2的蛋白表达,Sirt1测定试剂盒检测Sirt1活性,NAD^+/NADH试剂盒检测NAD+含量。结果与结论:(1)与骨髓间充质干细胞组相比,骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷组能够使糖胺多糖、髓核样细胞相关基因表达、COL2蛋白表达、Sirt1活性、NAD^+含量明显增加(P <0.05);(2)与骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷组相比,骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷+烟酰胺单核苷酸组糖胺多糖、髓核样细胞相关基因表达、COL2蛋白表达、Sirt1活性和NAD^+含量增加(P<0.05);相反,骨髓间充质干细胞+牛膝总皂苷+FK866组上述指标均降低(P <0.05);(3)结果表明,牛膝总皂苷可诱导大鼠骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化,Nampt/NAD/Sirt1轴在其中发挥促进作用。

赤芍总苷对脊髓损伤大鼠脊髓细胞凋亡的影响及机制

目的探讨赤芍总苷(TPG)对脊髓损伤(SCI)大鼠脊髓细胞凋亡的影响及机制。方法SD大鼠18只,随机分为对照组、SCI组与TPG组,每组6只。采用Allen法制备SCI大鼠模型。对照组大鼠切除椎板后,不予以脊髓打击直接缝合。TPG组在SCI模型建立成功后每24 h腹腔注射25 mg/kg TPG,SCI组和对照组腹腔注射同体积的生理盐水,共处理28 d。采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分法对大鼠进行行为学评分,流式细胞术检测脊髓细胞凋亡情况,Western blotting检测脊髓细胞凋亡蛋白cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表达。采用试剂盒检测脊髓组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)的含量。结果与对照组比较,SCI大鼠BBB评分明显降低,脊髓细胞凋亡率以及凋亡蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表达明显增高,脊髓组织中MDA、LDH含量升高,SOD含量降低(P<0.05)。与SCI组比较,TPG组大鼠BBB评分明显增高,脊髓细胞凋亡率以及凋亡蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表达明显降低,脊髓组织中MDA、LDH含量降低,SOD含量升高(P<0.05)。结论TPG对SCI大鼠脊髓细胞凋亡有抑制作用,其作用机制可能与TPG对氧化应激的调节有关。

miR146通过靶向Notch 1促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化

目的探讨miR146在骨髓间充质干细胞(BMSC)向髓核样细胞分化中的作用及其机制。方法从SD大鼠中分离培养BMSC,传至第3代用于本实验。以TGFβ1(转化生长因子-β1)诱导BMSC向髓核样细胞分化为模型。检测TGFβ1诱导BMSC后蛋白多糖(ACAN)、Ⅱ型胶原蛋白(COLⅡ)和SOX 9的蛋白及mRNA表达水平;RT-PCR检测miR146的表达水平。随后通过上调或下调miR146水平,检测ACAN、COLⅡ和SOX 9的蛋白及mRNA表达水平;双荧光素酶报告系统验证miR146的靶基因,并上调或下调miR146水平后检测靶基因的蛋白表达水平;过表达靶基因并检测其与miR146 mimic共转染对ACAN、COLⅡ和SOX 9表达的影响。最后,上调或下调靶基因后,检测miR146表达水平的变化。结果 TGFβ1诱导BMSC向髓核样细胞分化后ACAN、COLⅡ、SOX 9和miR146高表达。上调miR146后,ACAN、COLⅡ和SOX 9的表达升高;下调miR146后ACAN、COLⅡ和SOX 9的表达降低。双荧光素酶报告系统证实,Notch1是miR146的靶基因,miR146通过抑制Notch1的表达上调ACAN、COLⅡ和SOX 9的表达水平。上调Notch1后miR146表达下调,下调Notch1后miR146表达上调。结论 miR146通过靶向Notch1促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化,Notch1对miR146亦具有负向调控作用。

补骨脂素调控SKP2/PTHrP/SIRT1轴缓解炎症环境下髓核细胞退变的作用

目的探讨补骨脂素对白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的人髓核细胞(HNPCs)退变的影响及机制。方法体外培养HNPCs,用10 ng/ml IL-1β和50 ng/ml TNF-α诱导HNPCs 24 h使其发生退变,设置对照组、IL-1β+TNF-α组、补骨脂素(10 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L)组、补骨脂素(25 μmol/L)+S期激酶相关蛋白2(SKP2)干扰或过表达组、补骨脂素+甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)重组蛋白(100 nmol/L)组、补骨脂素+PTHrP重组蛋白(100 nmol/L)+沉默信号调节子1(SIRT1)激活剂SRT1720(1 μmol/L)组。采用流式细胞术检测髓核细胞凋亡情况;ELISA法检测髓核细胞中IL-6、基质金属蛋白酶3(MMP-3)和MMP-13的表达水平;DCFDA探针法检测髓核细胞中活性氧(ROS)的水平;Western blotting检测髓核细胞中SKP2、PTHrP、SIRT1、细胞外基质(ECM)相关蛋白[二型胶原蛋白(COL Ⅱ)和蛋白聚糖蛋白]的表达水平;蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)实验检测SKP2与PTHrP蛋白的相互作用;泛素化实验检测补骨脂素对SKP2介导的PTHrP泛素化水平的影响。结果补骨脂素以剂量依赖的方式抑制炎症环境下髓核细胞凋亡以及IL-6、MMP-3、MMP-13和ROS的生成(P<0.05或P<0.01),促进SKP2和ECM相关蛋白的表达(P<0.05)。与补骨脂素+杂乱干扰组比较,补骨脂素+SKP2干扰组SKP2和ECM相关蛋白的表达水平明显降低(P<0.05),髓核细胞凋亡率、IL-6、MMP-3、MMP-13和ROS水平明显增高(P<0.05或P<0.01)。Co-IP实验结果显示,SKP2与PTHrP蛋白存在相互作用。泛素化实验结果显示,与补骨脂素+空载体组比较,补骨脂素+SKP2过表达组PTHrP蛋白表达水平明显降低,SKP2蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。与补骨脂素组比较,补骨脂素+PTHrP重组蛋白组SIRT1和ECM相关蛋白表达水平明显降低(P<0.05),髓核细胞凋亡率、IL-6、MMP-3、MMP-13和ROS水平明显升高(P<0.05);与补骨脂素+PTHrP重组蛋白组比较,补骨脂素+PTHrP重组蛋白+SRT1720组PTHrP蛋白表达水平无明显变化(P>0.05),SIRT1和ECM相关蛋白表达水平明显升高(P<0.05),髓核细胞凋亡率、IL-6、MMP-3、MMP-13和ROS水平明显降低(P<0.05)。结论补骨脂素可通过促进SKP2介导的PTHrP泛素化降解而活化SIRT1,抑制炎症环境下髓核细胞的凋亡。

牛膝提取物对大鼠骨髓间充质干细胞向髓核样细胞增殖与分化的影响

目的研究牛膝提取物对大鼠骨髓间充质干细胞向髓核样细胞增殖与分化的影响。方法分离培养原代大鼠骨髓间充质干细胞后,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分成对照组和牛膝提取物组(10、30、50μg/mL)。培养14 d后,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,阿利新蓝法检测葡糖胺聚糖含有量,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)、免疫印迹(Western blot)检测细胞中Sox-9、Ⅱ型胶原(ColⅡ)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)水平。SIRT1抑制剂(尼克酰胺)处理细胞,MTT法检测细胞增殖,RT-PCR和免疫蛋白印迹检测SIRT1、Sox-9水平。结果骨髓间充质干细胞表面CD90和CD44呈阳性表达,而CD45和CD34呈阴性表达。与对照组比较,牛膝提取物可显著促进骨髓间充质干细胞细胞增殖,抑制细胞凋亡,上调细胞葡糖胺聚糖含有量及Sox-9、ColⅡ、Aggrecan水平,以上差异均有统计学意义(P <0. 05),并呈剂量依赖效应。另外,尼克酰胺可抑制牛膝提取物诱导的骨髓间充质干细胞细胞增殖和Sox-9表达升高。结论牛膝提取物可通过上调SIRT1水平来促进骨髓间充质干细胞向髓核样细胞增殖与分化。

重组腺相关病毒介导的BMP13和SOX9共转染促进骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化

目的观察骨形态发生蛋白13(bone morphogenetic protein 13,BMP13)和性别决定区Y框蛋白9(sex determining region Y box protein 9,SOX9)基因共转染对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向类髓核细胞分化的影响。方法通过腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)将目的基因导入BMSCs中;细胞分为4组:对照组、AAV-SOX9组、AAV-BMP13组和共转染组(AAV-SOX9+AAV-BMP13);应用实时荧光定量PCR技术检测mRNA表达水平;Western blot法检测蛋白表达水平;糖胺聚糖检测试剂盒检测糖胺聚糖的合成水平;MTT法检测细胞增殖。结果共转染组BMP13和SOX9的表达水平明显高于AAV-SOX9组、AAV-BMP13组和对照组(P<0.05);共转染组的糖胺聚糖合成水平、角蛋白19(keratin 19,KRT19)及蛋白聚糖(Aggrecan)和Ⅱ型胶原蛋白(typeⅡcollagen,Col2a1)的表达水平明显高于AAV-SOX9组、AAV-BMP13组和对照组(P<0.05);另外,AAV-SOX9和AAV-BMP13及共转染组的细胞增殖活性明显高于对照组(P<0.05),但AAV-SOX9组和AAV-BMP13组与共转染组的增殖活性相比差异无显著性(P>0.05)。结论 BMP13和SOX9双基因转染的BMSCs向类髓核细胞分化的能力明显高于单基因转染组,为椎间盘突出疾病的细胞治疗提供理论依据和参考。

经皮椎间孔镜微创技术联合术后中医药辨证治疗腰椎间盘突出症90例

目的:经皮椎间孔镜微创技术联合术后中医药辨证治疗腰椎间盘突出症的临床疗效。方法:将90例腰椎间盘突出症手术患者应用经皮椎间孔镜微创技术联合术后中医药辨证治疗。结果:本组90例患者均得到很好的6～18个月的随访,平均11月,均按照Macnab标准,优78例,良10例,可2例,优良率达97.8%,住院时间4～10d,平均7d。结论:经皮椎间孔镜微创技术联合术后中医药辨证治疗腰椎间盘突出症疗效确切,值得推广。

中西医结合治疗膝关节骨性关节炎56例

目的:观察西药局部封闭联合中药内服外敷治疗早中期膝关节骨性关节炎的效果。方法:56例采用西药局部封闭加中药内服外敷治疗,4周为一疗程,3个疗程后观察。结果:总有效率94.64%,治疗前后关节功能评分比较有显著性差异(P<0.01或P<0.05)。治疗期间未发现明显毒副作用。结论:西药局部封闭联合中药内服外敷对早中期膝骨性关节炎的治疗安全有效。

LCP钛板结合MIPPO治疗胫骨远端骨折

随着骨折内固定理论和技术研究的日益深入，AO的骨折治疗原则也发生了改变，提出BO概念，强调恢复临近关节的解剖关系，对于骨干骨折要求维持长度，防止旋转和成角，既尽可能保护软组织血运，又要达到稳定的固定。近年来，笔者采用LCP钛板结合MIPPO治疗胫骨远端骨折48例，取得较好效果。现报告如下：

中药热敷结合骶管封闭治疗轻中度腰椎间盘突出症

目的:观察中药热敷结合骶管封闭治疗轻中度腰椎间盘突出症的临床疗效。方法:78例患者给予中药热敷结合骶管封闭治疗。治疗后3周进行疗效分析。结果:治愈30例(38.46%),有效40例(51.28%),无效8例(10.26%),总有效率为89.74%。结论:中药热敷结合骶管封闭治疗轻中度腰椎间盘突出疗效显著。

当归对大鼠椎间盘髓核细胞自噬及氧化应激损伤的作用及机制研究

目的 :探讨当归降低椎间盘髓核细胞自噬及氧化应激损伤的作用及其机制。方法 :从大鼠椎间盘中分离并培养SD大鼠原代髓核细胞,用不同浓度(0.1mg/ml、1mg/ml、5mg/ml)的当归注射液干预第3代细胞,噻唑蓝(methyl thiazolete trazolium,MTT)法检测适当的当归浓度。将原代髓核细胞随机分成3组:A组(对照组)、B组(H2O2组)和C组(当归+H2O2)组。A组用生理盐水处理24h,不进行H2O2刺激,B组用400μmol/L H2O2分别刺激0.5h、1.5h和3h,C组用适当浓度当归注射液预处理24h后,400μmol/L H2O2分别刺激0.5h、1.5h和3h。流式细胞术检测各组细胞不同时间的凋亡率,western blot检测凋亡相关蛋白细胞色素C、Bcl-2和Bax及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62、p-AKT、p-m TOR和p-p70S6K的表达。结果:与其他浓度当归处理组比较,1mg/ml当归注射液可显著增加细胞存活(P<0.05)。与A组相比,B组细胞凋亡率随着时间的延长逐渐增加,细胞色素C的表达增加(P<0.05),Bcl-2/Bax的比例减小(P<0.05),LC3-Ⅱ/Ⅰ的比例增加(P<0.05),p62、p-AKT、p-m TOR和p-p70S6K的表达降低(P<0.05);与B组相比,C组中细胞凋亡率和细胞色素C、p62、p-AKT、p-m TOR和pp70S6K的表达均降低(P<0.05),Bcl-2/Bax和LC3-Ⅱ/Ⅰ的比例升高(P<0.05)。结论 :1mg/ml当归注射液能够抑制大鼠髓核细胞凋亡,这可能与线粒体凋亡通路被阻断相关;1mg/ml当归能促进其髓核细胞自噬,这可能与AKT/m TOR信号通路被抑制相关。

黄芪甲苷通过SIRT1/PGC-1α通路促进退变的髓核细胞增殖

目的探究黄芪甲苷对退变髓核细胞功能的影响及其作用机制。方法原代培养正常与退变髓核细胞并观察,免疫组化检测细胞中胶原蛋白Ⅱ(collagenⅡ)的表达;分别采用20、40、60、80μg/mL的黄芪甲苷处理细胞,通过CCK-8和MTT试剂盒检测细胞活力和增殖,流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blotting检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax和沉默信息调节因子2同源蛋白1(SIRT1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子-1(PGC-1α)的表达及其乙酰化和磷酸化水平;比色法检测丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)、β-galactosidase和三磷酸腺苷(ATP)的含量。结果与正常髓核细胞相比,退变髓核组织中坏死细胞更多,且collagenⅡ表达降低;细胞经不同浓度黄芪甲苷处理后,40μg/mL黄芪甲苷不仅能显著提高退变髓核细胞活力,促进细胞增殖并抑制其凋亡,而且能上调细胞中SIRT1、PGC-1α的蛋白表达和PGC-1α磷酸化水平,下调PGC-1α乙酰化水平,增加SOD和ATP含量,降低MDA和β-galactosidase含量。结论黄芪甲苷可能通过激活SIRT1/PGC-1α信号通路促进髓核细胞的增殖和存活。

芍药苷对大鼠脊髓损伤的神经保护机制

目的研究芍药苷对大鼠脊髓损伤(SCI)的神经保护机制。方法将大鼠随机分成对照组(假手术)、模型组(Allen’s打击法制备SCI模型)、治疗组1(术后每天腹腔注射芍药苷30 mg/kg)、治疗组2(芍药苷60 mg/kg),每组16只。手术当天为第1天,分别在第0、1、4、7、14天时采用BBB评分法对大鼠后肢运动功能进行测试。第4天和第14天每组分别处死8只大鼠,q PCR检测受损脊髓中TLR4和NF-κB p65 m RNA的表达;酶联免疫吸附实验测定检测受损脊髓中白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达;Western blot检测TLR4、NF-κB p65、诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、环氧酶2(COX-2)、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达。结果与对照组相比,模型组BBB评分明显降低(P<0.05);与模型组相比,治疗组评分升高(P<0.05),且治疗组2中评分较高。在第4天时,与对照组相比,模型组中TLR4、NF-κB p65、IL-1β、IL-6、TNF-α、i NOS、COX-2和Caspase-3的表达均增加(P<0.05),Bcl-2的表达降低(P<0.05);与模型组相比,治疗组中TLR4、NF-κB p65、IL-1β、IL-6、TNF-α、i NOS、COX-2和Caspase-3的表达均降低(P<0.05),Bcl-2的表达升高(P<0.05),这些变化均呈现剂量依赖性。第14天时,IL-1β、i NOS、COX-2、Caspase-3和Bcl-2的变化趋势与第4天时相同,但是各组中TLR4、NF-κB p65、IL-6和TNF-α表达均变化不大。结论芍药苷在大鼠脊髓损伤中的神经保护功能可能与TLR4/NF-κB信号通路介导的抗炎和抗凋亡作用相关。

血管内皮生长因子与转化生长因子的协同作用诱导兔骨髓间充质干细胞分化

目的研究血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和转化生长因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的协同作用对兔骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影响及其可能机制。方法将细胞分为4组:对照组、腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)-VEGF组、AAV-TGF-β1组和VEGF+TGF-β1组。穿刺法抽取兔骨髓液,分离培养原代BMSCs,分别构建AAV-VEGF和AAV-TGF-β1腺病毒载体转染BMSCs,Western blot检测各组细胞中VEGF、TGF-β1的蛋白表达。流式细胞术检测细胞凋亡情况,CCK8法检测细胞增殖能力,Western blot检测髓核细胞标志SOX-9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达,以及P38MAPK信号通路相关蛋白P38、MAPKAPK2和HSP27的表达。加入P38MAPK的特异阻滞剂SB203580预处理BMSCs,检测VEGF和TGF-β1对BMSCs增殖、凋亡、分化及相关蛋白表达的影响。结果 VEGF和TGF-β1可通过调节P38MAPK信号通路抑制BMSCs凋亡,促进BMSCs增殖,并向类髓核细胞分化,且在其协同作用下效果显著。抑制P38MAPK信号通路可反转VEGF和TGF-β1对BMSCs增殖分化能力的促进作用。结论 VEGF和TGF-β1的协同作用能增强BMSCs增殖和分化的能力,提高胶原蛋白和蛋白聚糖等细胞外基质的表达,从而促进退变椎间盘的修复和再生。

四环素联合桂枝加葛根汤对髓核细胞增殖和相关因子表达的影响

目的:探讨四环素(TET)联合桂枝加葛根汤(CK)对髓核细胞增殖和蛋白聚糖(aggrecan)、Ⅱ型胶原蛋白(typeⅡcollagen,Col2a)、基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)表达的影响。方法:体外分离培养8周龄健康雄性SD大鼠髓核细胞并进行鉴定。然后用药物处理分离成功的髓核细胞:TET组分别应用不同浓度(5,10,15,20,25μg/ml)的TET处理,CK组分别应用低、中、高剂量TET处理,TET+CK组应用20μg/ml TET和中剂量CK处理,对照组不添加药物。采用CCK8方法检测不同药物处理组细胞增殖活力;实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测TET+CK组髓核细胞的aggrecan、Col2a、i NOS和MMP-13的mRNA表达量,免疫印迹(Western blot)检测Aggrecan、Col2a、i NOS和MMP-13的蛋白表达量。利用pc DNA3.1-CMV(+)构建重组质粒pc DNA3.1-i NOS,转染组用pc DNA3.1-i NOS转染髓核细胞,应用20μg/ml TET和中剂量CK处理,空载体组用空载体(pc DNA3.1)转染细胞,应用20μg/ml TET和中剂量CK处理,对照组不添加药物且不转染,应用q RT-PCR检测各组i NOS和MMP-13的mRNA表达量,Western blot检测各组i NOS和MMP-13的蛋白表达量。结果:分离培养的髓核细胞Col2a和Aggrecan免疫组织化学染色阳性细胞比例分别为96%和98%。不同浓度TET或CK处理髓核细胞后细胞活力与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。20μg/ml TET和中剂量CK联合作用后髓核细胞的活力、Aggrecan和Col2a的mRNA和蛋白表达量均较对照组显著性升高(P<0.05),i NOS、MMP-13的mRNA和蛋白表达量较对照组显著性下降(P<0.05)。转染pc DNA3.1-i NOS重组质粒后髓核细胞i NOS和MMP-13的m NRA和蛋白表达与对照组和空载体组均显著性升高(P<0.05)。结论:TET联合CK可促进髓核细胞增殖,增加髓核细胞Aggrecan和Col2a mRNA和蛋白的表达,同时可以通过抑制i NOS减少MMP-13 mRNA和蛋白的表达量,为药物预防和治疗椎间盘退变提供了理论依据。

microRNA-204抑制强直性脊柱炎成纤维细胞成骨分化

目的探讨microRNA-204(miR-204)在强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)成纤维细胞中的表达及其对BMP-2和TGF-β1诱导的成骨分化的功能及其可能的作用机制。方法收集5例骨AS和5例非AS的髋关节囊组织;采用原代细胞培养方法分离培养成纤维细胞;细胞实验分为4组,分别为正常对照组、AS对照组、AS+miRNA-NC组和AS+miR-204组;除了正常对照组和AS对照组外,AS+miRNA-NC组、AS+miR-204组的培养基中分别加入7 ng/ml的BMP-2和5 ng/ml的TGF-β1;miRNA-NC和miR-204 mimics采用脂质体Lipofectamine 2000进行转染;实时荧光定量PCR法检测miR-204、I型胶原(collagen type I,Col I)、骨钙素(osteopontin,OPN)和核心结合蛋白因子2(Runx2)mRNA的表达水平;Western blot法检测Runx2蛋白表达水平;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)试剂盒检测ALP活性;双荧光素酶报告基因检测miR-204与Runx2的靶向调控关系。结果 miR-204在AS来源的成纤维细胞及BMP-2和TGF-β1处理的细胞中表达降低。过表达miR-204可以显著抑制BMP-2和TGF-β1诱导的ALP活性增高,ColⅠ和OPN的表达水平上升。另外,miR-204可以靶向调控Runx2,并且抑制Runx2的表达水平。结论 miR-204与AS成纤维细胞成骨分化密切相关,其可以通过靶向调控Runx2的表达来调节成纤维细胞的骨化,为AS的治疗提供潜在的治疗靶点。