2005-2019年江苏省小肠结肠耶尔森菌的病原学和遗传学特征研究

目的了解2005-2019年江苏省分离的小肠结肠耶尔森菌的病原学和遗传学特征。方法对江苏省食源性疾病腹泻病人以及猪、狗、牛、羊、家禽、苍蝇和食品中分离得到的110株小肠结肠炎耶尔森菌进行毒力基因、生物血清型和耐药性分析,并在全基因组测序的基础上进行多位点序列分型(MLST)和核心基因组多位点序列分型(cgMLST)分析。结果110株小肠结肠炎耶尔森菌包括致病性菌株27株(24.5%),非致病性菌株83株(75.5%)。各种来源的菌株中,非致病性菌株占比均较高,其中93.8%的病人来源菌株(15/16)为非致病性菌株。致病性菌株的生物血清型主要为3/O∶3型(26/27,96.3%);非致病性菌株鉴定出了6种不同的生物血清型(不包含未知血清型),主要为1A/O∶8型(23/83,27.7%)和1A/O∶5型(14/83,16.9%)。110株菌对19种抗生素的敏感率达到80%以上。全基因组分析结果显示,致病性菌株均为ST135型,而非致病性菌株型别较为多样和分散。HierCC聚类分析将所有菌株聚类为3簇,致病性菌株单独成簇,病人来源菌株在各簇中均有分布。结论腹泻病人来源的小肠结肠耶尔森菌以非致病性菌株为主。相较于致病性菌株,非致病性菌株表现出了更为丰富的表观多样性和遗传多样性,应加强此类菌株的监测,警惕其感染人的风险。

江苏省23例猴痘病例病毒基因组特征分析

目的分析2023年6月至9月江苏省23例猴痘病例病毒全基因组序列并研究其分子进化特征。方法收集猴痘病例口咽拭子、痘疱液、痘疱渗出物拭子等样本,以实时定量PCR进行病毒核酸检测,利用扩增子测序技术捕获猴痘样本中病毒全基因组,通过MiniSeq高通量测序仪进行二代测序,对序列进行病毒进化和变异分析。结果23份样本的平均测序深度907.30×~11578.58×,基因组覆盖度(测序深度≥10×)95.50%~99.94%。系统发育分析显示,病毒均属于MPXVⅡb C.1(2023)谱系,与来自同时期日本、韩国、葡萄牙和中国的序列同属一个分支,并分布于3个聚类簇中。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNPs)分析共发现60个SNPs,包含59处碱基替换和1处碱基缺失,其中非同义突变26个,分别影响宿主免疫调控、膜蛋白和病毒转录调控功能。26个非同义突变中有25个SNPs为载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽样(APOBEC3-like)突变,且23份样本中的6个共享突变均为APOBEC3-like突变。样本23010与23011只有C177833T一个突变位点的区别,且C76450T和G80405A位点均只在这两个样本中出现。结论江苏省2023年6月至9月23例猴痘病毒均为Ⅱb进化分支C.1(2023)谱系,病毒来源为多个源头输入,应持续开展猴痘病毒全基因组监测和研究,密切关注病毒来源和在本地传播后的变异进化方式。

液相芯片技术在诊断江苏省首例人禽流感病例中的应用

[目的]对2007年12月江苏省发生的一例不明原因肺炎病例进行液相芯片检测,探讨该技术在不明原因肺炎诊断中的作用。[方法]采集病例的呼吸道标本,利用液相芯片方法对呼吸道重要致病体进行核酸检测。[结果]呼吸道标本甲型流感病毒,H5及N1亚型禽流感病毒特异性核酸均为阳性。[结论]应用液相芯片技术,可快速确定该不明原因肺炎病例为高致病性禽流感(H5N1)感染,为及时防控和治疗提供依据。

手足口病病原液相芯片检测方法的建立

目的:建立检测手足口病病原的液相芯片方法。方法:设计、合成并修饰基因特异性引物和寡核苷酸探针,将寡核苷酸探针和荧光编码微球进行偶联,制备液相芯片;将样本核酸多重PCR扩增产物与液相芯片进行杂交,并通过液相芯片检测仪读取检测结果。结果:同时检测多种肠道病毒(EV),肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CAV16)的病毒核酸最低检出量均为1pg,检测特异性高。与参照方法相比,EV、EV71、CAV16的检测灵敏度分别为:91.4%、92.9%、100.0%,检测特异度分别为100.0%、97.1%、98.2%,检测准确度分别为:100.0%、96.3%、87.5%。结论:构建的检测手足口病病原的液相芯片方法,具有高通量、灵敏度高、特异性强和检测时间短等优点,为手足口病的快速诊断奠定了基础。

细胞周期素与膀胱癌关系的研究进展

细胞周期素是细胞周期调节的重要因子,和膀胱肿瘤的发生发展密切相关。细胞周期素的表达对判断肿瘤的生物学特征、预后有重要的意义,针对细胞周期素的特异抑制剂有望为膀胱癌的防治提供新的策略。

SOS/Umu试验及其应用

SOS Umu试验 (又称umu试验 )是 80年代中期发展起来的检测环境诱变物的短期筛选试验 ,它是基于DNA损伤物诱导SOS反应而表达umuC基因的基础上建立起来的。该方法具有快速、敏感、廉价等优点 ,因而被广泛应用于遗传毒理学研究、酶代动力学分析、环境监测与质量评估以及药效学评价和新药筛选等方面。本文对其实验原理。

20例人感染新型布尼亚病毒病的临床和流行病学特征分析

目的分析人感染新型布尼亚病毒病的临床特点和流行病学特征,为制定预防控制措施提供依据。方法采用统一的诊断标准和流行病学个案调查表对病例进行调查。结果 2010年江苏省境内报告的33例疑似病例中有20例确诊人感染新型布尼亚病毒病,病死率为30%。临床表现主要为发热(100%)、乏力(80%)、畏寒和呕吐(60%);血常规检查有血小板计数减少(100%)和白细胞计数减少(90%);病例多来自丘陵地区,以男性、中老年、农民为主,发病时间呈两个高峰,分别为6～7月和9～10月,部分病例发病前有明确的蜱叮咬史。结论 SFTS病例发病初期临床症状不典型,发病有地域特征,散发病例多见,但不排除人与人传播的可能。

单管高灵敏度等温扩增技术快速检测甲型H1N1流感病毒

建立了单管逆转录环介导等温扩增法(RT-LAMP)快速检测甲型H1N1流感病毒的方法。针对甲型H1N1流感病毒的M基因和HA基因的保守区,设计了两组特异性引物,分别用于筛选甲型流感病毒及鉴定甲型H1N1流感病毒。对反应体系中的关键因素进行优化,反应结果可直接通过浊度或者SYBR GreenⅠ荧光进行判定。本方法最低可检测到10拷贝/管的甲型H1N1流感病毒。为验证方法的可行性,对30例临床样本进行了检测,与美国疾病控制与预防中心(CDC)的TaqMan方法进行对比,检测的灵敏度和特异性分别为92%和100%。本方法实现了单管快速检测甲型H1N1流感病毒,为甲型H1N1流感病毒的现场检测提供了新方法。

2008-2009年江苏省肠道病毒71型分子流行病学研究

目的探讨2008-2009年江苏省肠道病毒71型（EV71）分离株的病毒基因特征。方法选取18份EV71分离株,用一对特异引物进行VP1全基因核苷酸序列扩增,在ABI3130型自动测序仪上测序,序列结果用DNA Star和MEGA4软件进行分析,并与各型参考株进行比较。结果 18株病毒与安徽省阜阳市和山东省临沂市分离的C4a基因型参考株最为相近,核苷酸同源性在96.3%~99.6%之间,氨基酸同源性在99.0%~99.7%之间;而与A、B基因型参考株比较差异较大,核苷酸同源性只在81.8%~84.4%之间,氨基酸同源性在94.3%~97.0%之间;说明本文的18株病毒均属于EV71型C4a基因型。结论 2008-2009年江苏省分离的18株EV71可能与安徽省和山东省分离的EV71有相同的起源,均属于C4a亚型;目前C4a亚型病毒在中国大陆可能有较广泛的分布和传播。

新疆克拉玛依地区蜱媒病原体的调查

目的调查新疆克拉玛依地区蜱种类及其携带病原体。方法于克拉玛依市不同区采集游离蜱和寄生蜱,鉴定蜱种类,利用荧光定量PCR或套氏PCR/半套氏PCR检测发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒、斑点热群立克次体、克里米亚-刚果出血热病毒、蜱传脑炎病毒、巴贝斯虫/泰勒虫、贝氏立克次体、查菲埃立克次体、恙虫病东方体和伯氏疏螺旋体等9种病原体。结果共采集蜱683只,分3属3种,其中亚东璃眼蜱数量(n=362)最多,其次为银盾革蜱(n=311)、图兰扇头蜱(n=10)。银盾革蜱中斑点热群立克次体的阳性率为3.2%(10/311),巴贝斯虫的阳性率为1.0%(3/311);亚东璃眼蜱中巴贝斯虫的阳性率为0.8%(3/362),泰勒虫阳性率为0.3%(1/362);其他病原体检测结果均呈阴性。PCR扩增阳性基因序列分析显示银盾革蜱携斑点热群立克次体阳性与劳氏立克次体最相关,银盾革蜱和亚东璃眼蜱携带驽巴贝斯虫。结论新疆克拉玛依地区优势蜱为亚东璃眼蜱和银盾革蜱,银盾革蜱携带劳氏立克次体,银盾革蜱和亚东璃眼蜱携带驽巴贝斯虫,提示该地区存在斑点热、巴贝斯虫病的自然疫源地,因此有必要加强对这些蜱携疾病的防控。

2012年江苏部分地区动物中发热伴血小板减少综合征病毒携带状况调查

目的了解江苏部分地区动物中发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）携带状况,探讨其可能的传播媒介和自然宿主。方法 2012年3月-12月在江苏省发现发热伴血小板减少综合征病例的7个市/县,采集鼠、牛、羊、刺猬、鸟类和蜱等动物标本,提取总核酸后,应用实时荧光RT-PCR法对标本进行布尼亚病毒S基因核酸的检测,阳性标本采用Vero细胞进行病毒分离。结果采集761只（管）动物,43只（管）检出SFTSV核酸阳性,阳性率为5.65%。采集3 728份标本,阳性49份,阳性率为1.31%。鼠的病毒携带率最高（6.84%）,蜱标本阳性率最高（4.94%）。除蜱标本外的3 647份标本中检出阳性45份,阳性率为1.23%,不同器官阳性率分别为淋巴结（50.00%）、血清（2.34%）、脾（1.64%）、心（1.64%）、肝（1.28%）、肺（1.09%）、脑（0.94%）、肾（0.73%）、血块（0.41%）。5月标本阳性率最高（4.01%）。从1份羊血清及其体表1份蜱标本中各分离出1株SFTSV病毒。结论鼠、牛、羊和蜱均可携带SFTSV,可能是其自然宿主或传播媒介。

高通量测序H7N9禽流感病毒基因组模板制备方法的优化及应用

目的:建立一种较优的高通量测序H7N9禽流感病毒基因组模板制备方法,用于H7N9禽流感病毒基因组监测。方法:分别以6碱基随机引物反转录生成单链cDNA,合成双链cDNA;流感病毒通用反转录引物U12反转录生成单链cDNA,6碱基随机引物合成双链cDNA;U12引物反转录生成单链cDNA,通用流感病毒全基因扩增引物混合物生成双链cDNA制备高通量测序模板、构建测序文库、测序并分析数据,比较3种方法对高通量测序效率的影响,并与传统Sanger测序方法比较其测序的准确性,选择其中较优的方法用于高通量测序。结果:以U12引物反转录cDNA,通用流感病毒全基因扩增引物混合物生成双链cDNA制备的高通量测序模板,在测序族生成数、覆盖率、单核苷酸多态性及读长等方面均优于另外两种方法。结论:本研究建立的H7N9禽流感病毒基因组模板制备方法用于高通量测序具有准确性高,周期短,成本相对较低,可同时检测多个样本等特点,可用于大规模H7N9禽流感病毒基因组监测。

应用蛋白组学方法筛选和鉴定乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白

前S1蛋白(PreS1)在乙型肝炎病毒与宿主的相互作用中起至关重要的作用.为筛选乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白,进一步探讨其在病毒感染过程中的作用,原核表达、纯化了PreS1-谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase,GST)融合蛋白,利用此蛋白与HepG2细胞裂解液进行Pull-down实验,其产物进行双向凝胶电泳分离.结果发现2个PreS1特异结合蛋白,经质谱鉴定为分子伴侣蛋白——葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和葡萄糖调节蛋白75(GRP75).通过免疫共沉淀和Western印迹分析证实,PreS1与GRP75之间存在相互作用.实验结果表明,GRP75为新发现乙型肝炎病毒PreS1特异结合蛋白,其与PreS1结合后的生理功能以及在HBV感染过程中的作用值得深入研究.

EV71型手足口病患儿血清Th1/Th2细胞因子水平分析

目的探讨EV71病毒感染所致手足口病患儿血清Th1/Th2细胞因子水平的变化。方法运用BD流式液相多重蛋白定量技术,检测EV71型手足口病患儿(病例组)和健康儿童(对照组)血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α及IFN-γ的水平。结果收集病例组和对照组样本各30例;病例组、对照组血清IL-6水平P50分别为7.0、1.9pg/ml,IL-10水平P50分别为3.4、2.4pg/ml,两组IL-6、IL-10水平比较差异均有统计学意义(P<0.05);而血清IL-2、IL-4、TNF-α及IFN-γ水平两组差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 IL-6和IL-10可能参与了EV71病毒的致病机理。

含H5N1禽流感病毒核酸序列的病毒样颗粒的制备及应用

目的构建耐RNase酶的内含禽流感病毒H5N1亚型部分核酸序列的病毒样颗粒。方法构建中间载体pET32a-MS2,将禽流感病毒H5N1亚型的HA、NA和M基因片断连接到中间载体上,构建原核表达载体pET32a-MS2-HA,pET32a-MS2-NA和pET32a-MS2-M,分别转化宿主菌,诱导表达制备病毒样颗粒。结果表达载体经PCR、酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。电镜观察到了病毒样颗粒,荧光定量RT-PCR试验表明颗粒稳定性良好。结论成功构建了含禽流感病毒H5N1部分核酸序列的病毒样颗粒且稳定性良好,可作为禽流感H5N1亚型RNA检测的标准品和质控品。

重组酶介导的等温扩增法检测H7N9禽流感病毒

目的建立H7N9禽流感病毒一步法逆转录重组酶介导的等温扩增的检测方法(RT-RAA)。方法根据H7N9禽流感病毒HA片段和NA片段的保守区序列分别设计引物、探针,建立RT-RAA方法,研究其特异性、敏感性,并与Realtime RT-PCR方法进行比较。结果成功建立了H7N9禽流感病毒RT-RAA检测方法,H7反应体系和N9反应体系的最低检出限分别为10copy/μL和100copy/μL,且与其他呼吸道病原无交叉反应。H7N9RT-RAA体系检测结果与Real-time RT-PCR一致性较高,Kappa检验u系数为0.933。结论建立的RT-RAA检测方法具有快速、特异及灵敏的特点,为H7N9禽流感病毒的快速检测提供了新的分子工具。

环介导等温扩增结合核酸级联侵入反应和纳米金探针显色技术快速检测脑膜炎奈瑟菌

目的 建立一种适合现场使用、灵敏、特异的脑膜炎奈瑟菌（N.men）检测方法。 方法 针对N.men的ctrA基因设计环介导等温扩增（LAMP）特异性引物和核酸侵入反应探针，对LAMP扩增产物进行核酸级联侵入反应和纳米金颗粒探针杂交检测。优化反应体系和反应条件后进行敏感性和特异性实验，并与Real-Time PCR检测方法进行比较。 结果 以核酸级联侵入反应和纳米金颗粒探针显色技术检测LAMP扩增产物和毛细管电泳法具有相同的敏感性和特异性；LAMP结合核酸级联侵入反应和纳米金探针显色技术的检测敏感性为10 copies DNA分子/反应，且与其他病原体之间无交叉反应。在临床样本检测方面，LAMP结合核酸级联侵入反应和纳米金探针显色技术与Real-Time PCR检测效果相当。 结论 结合LAMP、核酸级联侵入反应和纳米金探针显色技术建立的N.men检测方法灵敏、特异，无需特殊仪器，适用于基层检测和现场快速检测。

羊及其体表蜱中SFTSV的分离培养与全基因序列分析

目的 调查2012年春季江苏省某县羊及其体表蜱中发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）感染情况,并对分离到的毒株进行全基因序列分析.方法 采用荧光定量RT-PCR法对标本进行SFTSV核酸检测,所有阳性标本进行病毒分离并测序,序列结果用Lasergene和MEGA4软件进行拼接和分析.结果 7只羊和从羊体上采集的93只长角血蜱中,1只羊的血清和淋巴结SFTSV核酸检测呈阳性,附着于该羊体表的1只长角血蜱病毒核酸也呈阳性,通过病毒分离获得2株SFTSV毒株,JS2012-yang01（羊）和JS2012-pi01（蜱）.序列分析结果显示,JS2012-yang01和JS2012-pi01的L、M和S基因片段的核苷酸同源性分别为99.8％ 、99.8％ 、100.0％,氨基酸同源性分别为99.6％ 、99.6％、100.0％,进化树分析显示两株病毒处于同一亚分支.2株毒株与中国其他地区流行的SFTSV毒株核苷酸序列同源性介于95.9％～～ 99.6％（L基因）,94.7％～～99.5％（M基因）和95.0％～99.5％（S基因）,与布尼亚病毒科白蛉病毒属其他毒株序列差异较大.结论 该调查中分离自羊和蜱的SFTSV高度同源.蜱虫通过叮咬吸血,可能在SFTSV从动物到人的传播过程中起媒介作用.

基于逆转录-环介导等温扩增技术快速检测发热伴血小板减少综合征病毒方法的建立

目的建立1种快速、特异、灵敏的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)的检测方法。方法针对SFTSV M基因保守区域的核酸序列,设计逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)特异性引物,优化反应体系和条件。用毛细管电泳法和横向流动试纸条(LFD)法检测扩增产物,建立RT-LAMP检测方法。进行敏感性、特异性检验,并与Real-time RT-PCR法进行比较。结果以LFD法和毛细管电泳法检测RT-LAMP扩增产物具有相同的敏感性和特异性;RT-LAMP-LFD检测SFTSV的敏感性为10copies RNA分子/反应,且与其他病毒无交叉反应。RT-LAMP-LFD和Real-time RT-PCR检测临床标本阳性率差异无统计学意义(P>0.05),2种方法一致性好(Kappa=0.918)。结论建立的RT-LAMP方法快速、简单、操作简单,具有较高的敏感性和特异性,适合应用于基层单位和现场SFTSV的快速检测。

2010年南京人群甲型H3N2流感分离毒株全基因组特性分析

目的分析2010年南京地区甲型H3N2流感病毒的分子特征和演化趋势。方法测定2010年期间所分离3株病毒的8个RNA片段的核苷酸序列。构建各个基因基于核苷酸序列的系统发生树,并分析分离毒株与参考毒株11个基因特定氨基酸位点的变异情况。结果在3株病毒中,未发生片段间的重配。以A/Perth/16/2009为参考,3个分离毒株发生在HA和NA蛋白抗原决定簇的氨基酸变异均数分别为5.7和1.3;以A/Brisbane/10/2007为参考,3株病毒PB1的第375位发生突变(S→G),Nanjing/1655和Nanjing/1663的PB1-F2蛋白第26位缺失。另外3株病毒M2的金刚烷胺耐药位点(31位)为N。结论所测3株流感病毒HA基因的氨基酸变异可能导致新流行株的形成,病毒对金刚烷胺耐受而对神经氨酸酶抑制剂敏感。病毒的PB1第375位和PB1-F2第26位的变异可能成为H3N2病毒新的进化方向。