颗粒状脱细胞真皮基质的形态学特征及理化性能体外研究

目的研究颗粒状脱细胞真皮基质(particulate acellular dermal matrix,PADM)的体外形态学特征与理化性能。方法收集SD大鼠背部皮肤样本,采用本实验室的脱细胞方法制备片状脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix,ADM)并分析其内胞核和DNA残留情况。将片状ADM切割成不同规格的PADM,并结合大体观察、组织学分析、电镜技术、激光粒度分析仪和傅里叶变换红外光谱仪检测其外观轮廓、形态学、粒径分布和胶原分子结构。并将其复合人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)体外培养24 h,观察PADM与HUVEC的黏附情况。结果脱细胞方法有效降低了ADM的DNA含量[(1.51±0.37)μg/mgvs(0.30±0.09)μg/mg]。制备的PADM为白色颗粒,外形近似于长方体或立方体,显微镜下HE染色观察显示颗粒内部胶原纤维束结构疏松。扫描电镜显示颗粒断面结构疏松,透射电镜显示胶原原纤维周期性横纹结构和均匀分布的胶原原纤维间隙。激光粒度分析仪检测显示其粒度分布集中,例如,规格为0.2 mm的PADM,其80%(d0.1～d0.9)的粒径分布于233～487μm。FTIR结果显示,PADM分别在1 659、1 549、1 239 cm-1处出现的特征吸收峰,表明其保留了胶原分子的α-helix、β-sheet和β-turn二级结构,且体外HUVEC较易黏附于PADM。结论室温条件下,切割法制备的新型PADM形态规则,粒径分布集中,胶原纤维束形态和胶原分子的二级结构保存良好。

巴马小型猪与人真皮的组织形态学和生物力学基本特征比较研究

目的通过比较研究巴马小型猪与人皮肤在真皮组织结构、胶原类型和生物力学性能方面的差异,寻找猪脱细胞真皮基质临床应用受限相关的组织结构及生物力学原因。方法收集巴马小型猪与人的背部全层皮肤样本,采用大体观察、HE染色、Masson三色染色、天狼猩红染色、VVG染色、扫描电镜及透射电镜等方法,显微照相后进行形态学观察和图像分析软件测量,同时利用材料试验机检测真皮生物力学性能。结果与人皮肤比较,光镜下可见巴马小型猪皮肤的真皮胶原纤维束更粗[(39.29±10.17)μmvs(17.21±5.20)μm](P=0.000 3),而其间隙率更低[(19.01±1.55)%vs(32.36±1.28)%](P=0.029);真皮弹性纤维分布、Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量及其比值也与人真皮有明显差异(P<0.05);扫描电镜显示巴马小型猪真皮的胶原纤维束排列紧密、束间孔隙小,透射电镜显示巴马小型猪真皮的胶原原纤维较细,横纹的周期更长;生物力学检测显示巴马小型猪真皮的最大应变[(0.52±0.05)mm/mm]低于人真皮[(0.80±0.06)mm/mm](P=0.003),而弹性模量[(69.65±12.16)MPa]和最大应力[(20.72±1.49)MPa]高于人真皮[分别为(44.23±4.63)、(11.85±0.19)MPa](P=0.028,P=0.001)。结论巴马小型猪的真皮与人真皮差异较大,从组织形态学的角度提示猪脱细胞真皮基质不是修复人体真皮缺损的最佳生物材料。

新生小牛皮肤的形态学和生物力学特点及脱细胞方法探索

目的通过新生小牛与成人皮肤组织在形态学和生物力学性能方面的对比研究,寻找临床应用牛真皮基质的可能证据,并初步探索对牛真皮组织进行脱细胞处理的方法。方法收集新生小牛和成人背部全层皮肤标本,采用大体观察、HE染色、Masson三色染色、天狼猩红染色、Gomori醛复红染色、扫描电镜和透射电镜的方法,显微照相后进行形态学观察和图像分析软件的测量;采用力学生物材料试验机检测皮肤的力学性能。采用胰蛋白酶与去污剂的不同浓度和时间组合方式对牛真皮组织进行脱细胞处理,初步观察其脱细胞效果。结果新生小牛与人的皮肤比较,真皮和表皮的厚度均明显变薄,两者的比值显著减小;真皮内Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维分别较人真皮增多和减少,但真皮胶原纤维束的间隙率[(41.72±1.81)∶(40.66±1.40),P=0.467]和胶原纤维束粗细[(11.28±0.18)μm∶(10.88±0.66)μm,P=0.368]差异却没有统计学意义。扫描电镜观察可见新生牛真皮胶纤维束与人真皮胶原纤维束均较纤细,排列疏松,且有一定的孔隙分布;透射电镜显示新生牛真皮胶原原纤维横纹周期长度较人真皮短,但两者的胶原原纤维直径显著差异。生物力学检测示新生牛皮肤最大应力[(21.08±0.91)MPa]和杨氏模量[(82.12±1.23)MPa]均要明显高于人皮肤的最大应力[(12.76±1.60)MPa,P=0.001]和杨氏模量[(48.63±5.50)MPa,P=0.001],而最大应变却明显低于人真皮[(0.51±0.002)mm∶(0.75±0.028)mm,P=0.001]。脱细胞方法探索显示随着胰酶浓度的增加、处理时间的延长,新生牛真皮基质内细胞核成分越来越少,但对真皮胶原结构的破坏也越来越大。结论新生牛皮肤虽然在表皮与真皮厚度、真皮胶原类型比例以及生物力学上与人皮肤有明显差异,但真皮的胶原纤维束三维结构两者之间存在较大相似性。适当浓度和时间的胰蛋白酶组合可制备出空间结构和脱细胞效果较为理想的新生牛脱细胞真皮基质,为修复人体软组织缺损提供有应用前景的生物材料。

PHA、ConA及CD3ε单克隆抗体对小鼠淋巴细胞迁移及分泌趋化因子的影响

目的探讨不同浓度的PHA、ConA及CD3ε单克隆抗体对Balb/c小鼠淋巴细胞迁移及分泌趋化因子的影响,初步了解这3种刺激剂与小鼠淋巴细胞迁移功能之间的关系。方法通过研磨法分离Balb/c小鼠脾脏淋巴细胞,用不同浓度的PHA、ConA及CD3ε单克隆抗体分别刺激培养淋巴细胞,收集细胞上清,用Traswell法测定细胞上清对淋巴细胞迁移率的影响;ELISA法检测细胞上清中趋化因子XCL1、CCL4、CCL5、CCL3、IL-16、IL-8及CCL20的水平。结果 PHA组各个浓度刺激下淋巴细胞的迁移率和对照组无明显差异;ConA组的刺激浓度为20μg/ml时,其对应的淋巴细胞迁移率明显高于对照组;CD3ε单抗组,其浓度分别为2.5、10μg/ml时,对应的淋巴细胞迁移率明显高于对照组。在各个刺激组中,ELISA测得的多种趋化因子水平在总体上存在明显差异。结论 ConA及CD3ε单克隆抗体分别刺激小鼠淋巴细胞后,其分泌趋化因子的功能发生了明显的改变,这些趋化因子影响着小鼠淋巴细胞的迁移功能。趋化因子XCL1、CCL4、CCL5、CCL3的水平明显高于对照,说明这几个因子在淋巴细胞迁移中起到重要的作用。根据实验结果初步推荐CD3ε单抗可以作为小鼠淋巴细胞迁移试验中的首选阳性对照,次选为ConA。

CCL20基因敲低型人永生化角质形成细胞克隆的体外生长特性观察

采用MTT比色法、碘化丙啶染色法和直接免疫荧光双标记法分别观察4个CCL20基因敲低型人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)克隆(代号分别为Ⅱ～Ⅴ)的生长曲线、细胞周期以及表皮干细胞相关表型,预期筛选出体外生物学性状良好的表皮种子细胞克隆。结果显示,与未转染的HaCaT细胞(代号为Ⅰ)比较,Ⅲ～Ⅴ在体外培养第5、6天的光密度值显著降低;Ⅲ和Ⅳ的G2+M期显著增多;Ⅳ和Ⅴ表达CD49f^+CD71-的百分率显著升高,而表达CD49f^+CD71^+、CD71^+的百分率显著降低。可见,4个CCL20基因敲低型HaCaT细胞克隆中仅有Ⅱ表现出与未转染HaCaT类似的体外生长特性,该克隆有可能成为构建低免疫原性组织工程皮肤的表皮种子细胞。

渗透冲击联合超声和去污剂处理对新生牛真皮组织学和生物活性成分的影响

目的采用渗透冲击联合超声和去污剂处理新生牛真皮,观察处理前后新生牛真皮基质的组织学和生物活性成分的变化。方法从8头健康雄性新生牛皮肤获取网状层真皮组织。采用反复渗透压改变、超声震荡和去污剂联合法对新生牛网状层真皮进行处理,HE染色、DAPI染色和核酸电泳检测细胞成分残留情况;扫描电镜(SEM)观察胶原束结构和细胞成分;PicoGreen法、DMMB法和BCA法对脱细胞前后真皮基质的DNA、sGAG和蛋白质含量进行定量分析;ELISA法测定脱细胞前后真皮基质内TGF-β1、EGF、bFGF和KGF含量。结果形态学观察可见脱细胞处理后的真皮三维结构完整,胶原纤维束排列较疏松,细胞清除较彻底,未见明显细胞及细胞碎片残留。与脱细胞处理前比较,脱细胞处理后的DNA含量[(2 516.1±324.2)ng/mg vs(249.5±53.8)ng/mg,P=0.000)]、sGAG含量[(5.92±0.50)μg/mg vs(2.48±0.24)μg/mg,P=0.000]、TGF-β1含量[(478.8±196.1)pg/g vs(180.3±111.0)pg/g,P=0.009]和EGF含量[(10.52±2.78)pg/g vs未能检测到EGF含量]均明显减少;而bFGF含量[(788.6±333.8)pg/g vs(364.8±294.8)pg/g,P=0.424]下降了53.7%,KGF含量[(0.033±0.000)pg/g vs(0.033±0.000)pg/g,P=0.433]变化不显著。结论反复渗透冲击联合超声和去污剂处理对新生牛真皮基质明显地清除了细胞及细胞碎片,较好地保留了真皮细胞外基质的三维结构和主要生物活性成分。

CCL20基因短发夹RNA表达载体转染人胚胎肾细胞的干扰效应

目的观察人CCL20基因短发夹RNA表达载体(pSCS-EGFP)转染人胚胎肾细胞(293FT细胞),以及对其表达CCL20 mRNA和分泌CCL20蛋白的抑制作用。方法用脂质体转染法把构建成功的3个pSCS-EGFP质粒(其中pSCS-EGFP-1为CCL20基因错配型,pSCS-EGFP-2和pSCS-EGFP-3均为CCL20基因特异型)转染到293FT细胞,24h后分别用荧光显微镜照相和流式细胞仪检测293FT细胞的转染率。将未转染及分别转染3种质粒的293FT细胞培养48h,用TNF-α和IL-1β刺激培养24h后,分别用荧光定量RT-PCR和ELISA法检测CCL20基因mRNA和蛋白的表达水平,计算其抑制率。结果3种质粒(pSCS-EG-FP-1～3)转染293FT细胞的效率分别为(73.8±5.3)%、(50.0±4.8)%、(56.8±2.9)%。加细胞因子刺激下,3种载体对293FT细胞表达CCL20 mRNA相应的抑制率分别为(18.53±34.44)%、(90.40±3.94)%和(92.50±6.15)%;上清中CCL20蛋白相应的抑制率分别为(14.88±17.39)%、(71.76±8.27)%和(88.56±1.74)%。未加细胞因子刺激下,CCL20 mRNA的相应抑制率分别为(61.37±11.72)%、(84.33±12.78)%和(80.27±15.84)%;CCL20蛋白的相应抑制率分别为(19.91±48.12)%、(-27.87±50.24)%和(87.21±8.36)%。结论特异性CCL20shRNA表达载体能明显下调细胞因子刺激人胚胎肾细胞表达CCL20 mRNA及蛋白,该载体为研究肾移植排斥反应等CCL20相关性肾脏疾病的治疗提供了一定的实验基础。

多系统室内分布共建共享的应用

本文针对多系统室内分布共建共享的技术要素,重点对多系统的合路方式选择和系统间干扰进行了分析,同时对各系统损耗、天线布放和小区划分提出了原则性建议。

人、猪、大鼠来源网状层真皮组织学及材料学表征的比较

背景:课题组以往研究证实,猪边腹部网状层真皮质地柔软,伸展性也较其他部位好,适合作为异种脱细胞真皮的制作材料,但将其与人网状层真皮和大鼠网状层真皮进行组织形态学和材料学表征的系统对比未见相关报道。目的:研究猪边腹部、大鼠背部与人网状层真皮在组织学、生物力学、分子结构和热稳定性等方面的差异。方法:取人、猪边腹部、Wistar大鼠背部网状层真皮标本并大体观察,石蜡切片后行苏木精-伊红染色、苦味酸-天狼星红染色,显微照相后用图像分析软件测量分析;样本真空干燥并复水后用电子拉伸机测量其力学性能并计算杨氏模量;真空干燥后的样品研碎后用傅里叶红外光谱仪及同步热分析仪分析测量。结果与结论:猪边腹部网状层真皮胶原纤维束直径与人网状层真皮无差异,大鼠背部胶原纤维束较人网状层真皮细(P<0.01);猪边腹部网状层真皮间隙率较人网状层真皮低(P<0.01),大鼠网状层真皮间隙率与人网状层真皮相似(P=0.17)。猪网状层真皮胶原纤维排列紧密杂乱,Ⅰ型胶原蛋白含量及Ⅰ型、Ⅲ胶原蛋白比值高于人网状层真皮(P<0.05),Ⅲ胶原蛋白含量低于人网状层真皮(P<0.05);大鼠网状层真皮Ⅰ型和Ⅲ胶原蛋白含量及其比值与人网状层真皮相近(P>0.05)。3种网状层真皮杨氏模量差异无显著性意义。大鼠网状层真皮胶原蛋白分子有较多的氢键参与,人较少,猪介于两者之间;大鼠网状层真皮热稳定性较好,人和猪次之。

异体颗粒状脱细胞真皮基质与自体刃厚皮复合移植修复大鼠皮肤缺损创面效果观察

目的观察异体颗粒状脱细胞真皮基质（PADM）与自体刃厚皮复合移植修复大鼠皮肤缺损创面的效果。方法采用随机数字表法将12只SD大鼠分为实验组和对照组，每组6只。于2组大鼠背部制作全层皮肤缺损创面，实验组创面复合移植SD大鼠异体PADM（扩张比10：5）及厚度0．20mm的自体刃厚皮，对照组创面仅移植厚度0．20mm自体刃厚皮。术后2周起打开敷料观察大鼠创面愈合情况。术后2、3、4、6、8、12、20周计算2组创面移植皮片成活率、收缩率（或扩张率）。术后20周取2组创周正常皮肤及创面皮肤标本，采用HE染色法观察胶原纤维束结构，测量胶原纤维束直径和间隙率；用天狼星红染色法观察I、Ⅲ型胶原分布情况，测量I、Ⅲ型胶原含量及其比值。对实验数据行独立样本t检验、Levene检验、t’检验。结果（1）术后2周，实验组大鼠创面移植皮片成活率[（76．1±13．1）％]低于对照组[（94．5±1．3）％，t’=3．440，P=0．018]。术后3周，实验组创面移植皮片收缩率[（34±8）％]明显大于对照组[（16±12）％，t=-3．211，P=0．009]；术后8周，2组移植皮片扩张率接近一致。（2）HE染色和天狼星红染色显示，与大鼠创周正常皮肤比较，对照组移植皮片胶原纤维束呈均质化改变，胶原纤维纤细，排列紊乱；实验组移植皮片胶原纤维束结构、排列更接近创周正常皮肤，可见未完全降解的PADM。与对照组创面皮肤胶原纤维束直径[（7．3±1．4）um]、间隙率[（17±4）％]、I型胶原含量[（68．1±8．4）％]、Ⅲ型胶原含量[（32．0±8．4）％]以及I、Ⅲ型胶原比例（2．3±1．0）比较，实验组胶原纤维束更粗[（9．6±0．8）um，t=-3．562，P=0．005]，间隙率更大[（24±5）％，t=-2．760，P=0．020]，I型胶原含量更高[（80．2±5．4）％，t=-2．981，P=0．014]，Ⅲ型胶原含量更低[（19．8±5．4）％，t=2．981，P=0．014]，I、Ⅲ型胶原比例更高（4．3±1．2，t=-3．204，P=0．009）。实验组创面皮肤上述胶原相关指标更接近于创周正常皮肤水平。结论异体PADM在体内作为真皮再生模板，有助于改善自体刃厚皮所修复的大鼠皮肤缺损创面中真皮胶原纤维束的结构，提高再生真皮组织的成熟度。

削痂皮下组织创面植皮术治疗大面积Ⅲ度烧伤患者的效果

目的：探讨削痂皮下组织创面植皮术（ TESGSTW ）治疗大面积Ⅲ度烧伤患者的效果。方法回顾性分析2002年1月至2013年12月山东大学附属济南市中心医院烧伤科连续收治的31例Ⅲ度烧伤面积＞70％并于伤后7 d内首次行TESGSTW成年患者的资料。31例焦痂完整创面分次行TESGSTW，部分肢体削痂不用止血带。收集并分析比较患者入院时病情、死亡原因、削痂创面失血量和治愈组手术治疗过程及效果相关资料。结果31例患者年龄（32．4±12．8）岁，烧伤总面积（89．0±6．2）％，Ⅲ度烧伤面积（80．4±7．6）％，25例（80．6％）合并吸入性损伤，22例（71．0％）入院前并发早期休克。治愈18例（58．1％），其中包括Ⅲ度面积≥90％患者2例。死亡13例（41．9％），其中10例于伤后4～19 d 死亡。烧伤面积是死亡的危险因素，脓毒症及多器官功能障碍综合征（ MODS）是主要死亡原因，其中4例死于早期脓毒症。伤后14 d内肢体每1％削痂面积失血量，不用止血带组略高于用止血带组但差异无统计学意义。治愈18例共行TESGSTW 41次，14例（77．8％）共行2次削痂，首次削痂时间伤后（4．1±0．6） d，前2次削痂间隔时间（6．4±2．0） d，首次削痂面积（33．8±7．6）％，累计削痂面积（58．4±10．8）％。伤后14 d内39次削痂创面，33次（84．6％）行冷藏异体皮或新鲜猪皮移植过渡，术后5～7d揭起皮片创面新鲜、渗血，异体（种）皮移植后揭除或排异、扩创自体皮更植时间（18．0±4．8）d、成活率（89．5±9．5）％。其中4例发生术后创面感染5次。随访0．5～9．0年，愈合创面丰满、收缩较轻、不易破溃，伸展性、感觉性好。结论 TESGSTW治疗大面积Ⅲ度烧伤患者安全，近、远期效果较好。

灾害性群体烧伤早期救治的现状及思考

在人类社会进程中，突发的事故灾难、社会安全、自然灾害等公共事件始终存在。20世纪90年代以来，随着我国经济社会的高速发展，火灾、爆炸等事故灾难时有发生，造成大量人员伤亡。

甲型血友病慢性溃疡创面一例

患者男，59岁，平素体质较差，确诊甲型血友病（hemophiliaA）55年，曾多次输注凝血因子Ⅷ。本次因右下肢溃疡近8年，加重伴感染2周入院。8年前患者被蚊虫叮咬右下肢后出现红斑，约米粒大小，来高出皮肤，局部稍痒，因抓挠致红肿渗出。曾到多家医院治疗，效果欠佳，红斑区域间断破溃流液，创面经久不愈。入院前2周，创面渗出明显增多，

大面积深度烧伤的早期切除与皮肤移植

伤及全层皮肤乃至部分皮下组织的Ⅲ度烧伤和伤及深层真皮伤后21 d内难以愈合的深Ⅱ度烧伤,是需要自体皮移植修复的深度烧伤(DB)。面积超过40%总体表面积(TBSA)者,病情复杂,供皮区相对缺乏。早期切除植皮是改善大面积深度烧伤(EDB)生存及后果的关键技术。本文以国内外代表性专著为基础,参考相关文献并结合本科经验,就EDB早期切除植皮中的几个关键问题进行了探讨。对烧伤创面深度的准确评估和对创面衍变过程的深刻理解,是创面处理的病理生理学基础。应贯彻损伤控制性手术理念,确定适宜的切除时机及面积。削痂术适用于深Ⅱ度和Ⅲ度烧伤,削除深度应以有效去除坏死组织至有生机真皮或皮下组织平面为度。肢体削痂可不用止血带,而是尽可能使患肢处于抬高状态分区快速削痂。对削痂后新鲜创面仍水肿明显者,可多点穿刺引流。对伤后14 d尤其是7 d以内削痂创面可行异体(种)皮移植过渡择期自体皮更植术,微粒皮移植宜用于伤后7 d后血运趋于改善的切除后创面。应加强围术期尤其是术中管理。EDB早期切除植皮治疗策略虽然取得了良好疗效,但更多是基于经验与实用的总结,仍需随机对照临床试验的确证。