miR-27a通过TLR4/NF-κB信号通路对类风湿关节炎滑膜细胞生物学行为的影响

目的:探讨miR-27a通过Toll样受体(TLR)4/NF-κB信号通路对类风湿关节炎(RA)滑膜细胞生物学行为的影响。方法:选择行膝关节置换术的30例RA患者(RA组)和同期因创伤急诊截肢的18例患者(对照组)的滑膜组织,采用qRT-PCR法检测miR-27a的表达。将RA成纤维样滑膜细胞MH7A分为4组:空白对照组,不进行任何处理;TNF-α组,加入终浓度为20μg/L的TNF-α处理24 h;TNF-α+miR-NC组,加入终浓度为20μg/L的TNF-α处理后转染miR-NC;TNF-α+miR-27a mimic组,加入终浓度为20μg/L的TNF-α处理后转染miR-27a mimic,采用qRT-PCR法检测组织或细胞中miR-27a的表达量,CCK-8法检测细胞增殖情况,克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,Transwell法检测细胞侵袭和迁移能力,Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡情况,双荧光素酶报告实验验证TLR4 mRNA与miR-27a的靶向关系,Western blot法检测细胞中TLR4、NF-κB、磷酸化TLR4(p-TLR4)和磷酸化NF-κB(p-NF-κB)蛋白的表达情况。结果:对照组和RA组滑膜组织中miR-27a的表达量分别为(1.00±0.08)和(0.36±0.05),RA组低于对照组(P<0.001)。与空白对照组比较,TNF-α组和TNF-α+miR-NC组细胞中miR-27a表达量下降,TNF-α+miR-27a mimic组miR-27a表达量升高;与TNF-α组和TNF-α+miR-NC组比较,TNF-α+miR-27a mimic组细胞中miR-27a表达量升高(P<0.05)。与空白对照组比较,TNF-α组和TNF-α+miR-NC组细胞增殖、克隆形成、侵袭和迁移能力增强,细胞凋亡率降低;与TNF-α组和TNF-α+miR-NC组比较,TNF-α+miR-27a mimic组细胞增殖、克隆形成、侵袭和迁移能力减弱,细胞凋亡率升高(P<0.05)。双荧光素酶报告实验证实TLR4是miR-27a的靶基因。与空白对照组比较,TNF-α组和TNF-α+miR-NC组p-TLR4/TLR4、p-NF-κB/NF-κB升高;与TNF-α组和TNF-α+miR-NC组比较,TNF-α+miR-27a mimics组p-TLR4/TLR4、p-NF-κB/NF-κB降低(P<0.05)。结论:miR-27a可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路,降低RA成纤维样滑膜细胞的增殖、侵袭和迁移能力,促进其凋亡。

雷公藤甲素通过抑制细胞铁死亡减轻博来霉素诱发的小鼠肺纤维化

目的:探讨雷公藤甲素(TPL)对博来霉素(BLM)诱导肺纤维化小鼠的改善效果,揭示铁死亡参与TPL改善肺纤维化的潜在机制。方法:选择SPF级小鼠,随机分为3组:对照组、模型组(BLM处理组)和实验组(BLM+TPL处理组),每组10只。Day 0,模型组和实验组小鼠气管灌注BLM水溶液(50μL,5 mg/kg),对照组小鼠接受等体积的生理盐水。Day 1起,实验组小鼠开始灌胃TPL悬液(200μL,0.25 mg/kg),每3 d一次,共7次,对照组和模型组分别接受等体积生理盐水。Masson染色检测肺组织纤维化,TUNEL染色检测肺组织细胞凋亡;体外CCK8法检测细胞活力,流式细胞术及活死染色检测细胞凋亡,免疫荧光法检测细胞脂质过氧化,Western blot检测肺组织及细胞中目的蛋白表达。结果:TPL处理通过下调肺组织中Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达(P<0.05),显著降低BLM诱导小鼠肺部纤维化程度(P<0.01);同时,TPL处理可显著上调肺组织中谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)和铁死亡抑制蛋白1(FSP1)表达(P<0.05),下调转铁蛋白受体1(TfR1)表达(P<0.05),从而抑制BLM诱导的肺部细胞铁死亡和凋亡(P<0.01)。体外研究结果表明,TPL处理可显著抑制肺上皮细胞凋亡(P<0.01),进一步检测发现TPL处理可显著降低BLM诱导的肺泡上皮细胞内脂质过氧化(P<0.01),显著上调细胞内GPX4和FSP1蛋白表达(P<0.01),下调TfR1蛋白表达(P<0.05),通过抑制细胞铁死亡来显著降低BLM诱导的肺上皮细胞凋亡率。结论:TPL可在体内外通过抑制BLM诱导的细胞铁死亡,改善肺部细胞活力,降低细胞凋亡率,从而减轻肺小鼠纤维化程度。本研究为临床使用TPL治疗肺间质病变提供理论依据。

miR-26a-5p通过JAK2/STAT3信号通路对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的影响

目的:探讨miR-26a-5p对人类风湿关节炎(RA)-成纤维样滑膜细胞(FLSs)凋亡及炎性因子分泌的影响,阐明其作用机制。方法:分离RA患者的膝关节滑膜组织RA-FLSs,将miR-26a-5p模拟物(mimic)、抑制物(inhibitor)及阴性对照转染RA-FLSs,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测转染效果,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞培养液中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6 (IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,CCK-8法检测各组细胞增殖活性,AnnexinⅤ-FITC/PI与Hoechst 33342染色检测各组细胞凋亡情况,Western blotting法检测各组细胞中凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤2 (Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)与酪氨酸激酶2 (JAK2)/信号传导及转录活化因子3 (STAT3)信号通路相关蛋白表达水平。结果:与空白对照组和NC-mimic组比较,miR-26a-5p mimic组RA-FLSs中miR-26a-5p mRNA表达水平升高(P<0.05),RA-FLSs增殖活性降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞中Bcl-2、 JAK2、 p-JAK2、 STAT3和p-STAT3蛋白表达水平降低(P<0.05),Bax蛋白表达水平升高(P<0.05);与空白对照组和NC-inhibitor组比较,miR-26a-5p inhibitor组RA-FLSs中miR-26a-5p mRNA表达水平降低(P<0.05), RA-FLSs细胞增殖活性升高(P<0.05),细胞凋亡率降低(P<0.05), Bcl-2、 JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表达水平升高(P<0.05), Bax蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论:过表达miR-26a-5p能够抑制RA-FLSs细胞增殖,促进细胞凋亡,其作用机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路的激活有关。

小核糖体管家基因RNA 1转染对IL-1β刺激的大鼠软骨细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨转染小核糖体管家基因RNA 1(SNHG1)对IL-1β刺激的大鼠软骨细胞增殖、凋亡的影响及其机制。方法:以10μg/L的IL-1β刺激大鼠软骨细胞6、12和24 h(以未刺激细胞为对照),采用实时荧光定量PCR法检测SNHG1的表达。将体外培养的软骨细胞分为正常对照组(正常培养)、IL-1β组(以10μg/L IL-1β刺激24 h)、IL-1β+空载体组(转染pcDNA3.1空载体后以10μg/L IL-1β刺激24 h)和IL-1β+SNHG1组(转染pcDNA3.1-SNHG1后以10μg/L IL-1β刺激24 h),采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞中SNHG1的表达,MTT法和Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞增殖和凋亡情况,Western blot法检测细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2和Bax的表达。结果:与未刺激细胞比较,IL-1β刺激6、12和24 h,大鼠软骨细胞中SNHG1表达水平逐渐降低(P<0.05)。与正常对照组比较,IL-1β组细胞中SNHG1表达水平,细胞增殖率和PI3K、p-AKT、Bcl-2蛋白的表达水平降低,细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平升高(P<0.05);与IL-1β组或IL-1β+空载体组比较,IL-1β+SNHG1组细胞中SNHG1表达水平,细胞增殖率和PI3K、p-AKT、Bcl-2蛋白的表达水平均升高,而细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论:SNHG1可促进IL-1β刺激的大鼠软骨细胞增殖并抑制其凋亡,其作用机制可能与激活PI3K/AKT信号通路有关。

蠲痹化湿汤联合西药治疗类风湿关节炎的疗效及对基质金属蛋白酶、DNA甲基转移酶和趋化因子的影响

目的:观察蠲痹化湿汤联合西药治疗类风湿关节炎的疗效及对基质金属蛋白酶、DNA甲基转移酶和趋化因子的影响。方法:选择本院收治的RA患者90例,按照1∶1的比例分为两组,每组45例。对照组口服甲氨蝶呤片,7.5 mg/次,1次/周;美洛昔康片,7.5 mg/次,1次/d。治疗组在对照组治疗基础上加用蠲痹化湿汤(独活、羌活、川芎、乳香、秦艽、木香、桑枝、海风藤、当归、桂枝、甘草)加减治疗,1剂/d,水煎药汁至300 mL,2次/d,早晚温服。两组均于连续治疗8周后判定疗效。结果:治疗组显效22例,有效19例,无效4例,有效率为91.11%(41/45);对照组显效15例,有效17例,无效13例,有效率为71.11%(32/45)。两组对比,差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后,两组关节肿胀、疼痛、屈伸不利、晨僵、肢冷畏寒评分和中医症状总评分均明显降低,且治疗组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);两组基质金属蛋白酶3水平均明显下降,且治疗组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);两组DNA甲基转移酶1、DNA甲基转移酶3a、DNA甲基转移酶3a表达量均明显升高,且治疗组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);治疗后,两组核转录因子-κB受体活化因子、CC类趋化因子配体5、CXC趋化因子配体10、γ-干扰素诱生蛋白10水平均明显降低,且治疗组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。治疗组不良反应发生率明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:蠲痹化湿汤联合西药治疗RA有较好疗效,可有效改善临床症状,减轻机体炎症反应,降低趋化因子表达,上调DNA甲基转移酶表达。

间充质干细胞移植治疗系统性红斑狼疮的研究进展

系统性红斑狼疮是一种累及多系统的自身免疫性疾病。尽管传统免疫抑制和靶向生物治疗一直在进步,但对于难治性、重症系统性红斑狼疮患者来说,仍然具有潜在的致命性。在系统性红斑狼疮的病理过程中,造血干细胞及间充质干细胞的结构和功能受到干扰,因此,近年来造血干细胞和间充质干细胞移植均作为难治性、重症系统性红斑狼疮的新型治疗方法而出现。虽然在同种异体间充质干细胞移植治疗方面的研究取得了重要进展,但同时也存在一些问题。

微小RNA-106a-5p/集落刺激因子1轴对狼疮性肾炎患者免疫球蛋白G诱导的足细胞损伤的影响

目的探讨微小RNA-106a-5p/集落刺激因子1(miR-106a-5p/CSF1)轴对狼疮性肾炎(LN)患者免疫球蛋白G(LN-IgG)诱导的足细胞损伤的影响。方法采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和Western blot法检测LN患者和健康志愿者血清及LN-IgG或阴性对照(NC)-IgG(提取自健康志愿者)诱导的足细胞中miR-106a-5p和CSF1的表达。采用双荧光素酶报告实验检测miR-106a-5p与CSF1的靶向关系。采用CCK-8实验、流式细胞术、酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot实验检测miR-106a-5p或CSF1表达修饰后的足细胞活性、凋亡、炎症反应和自噬。结果与健康志愿者相比,LN患者体内miR-106a-5p低表达,而CSF1高表达,差异有统计学意义(P<0.05);miR-106a-5p在LN-IgG诱导的足细胞中表达降低,而CSF1表达上调,差异有统计学意义(P<0.05)。功能实验表明,过表达miR-106a-5p可逆转LN-IgG诱导的足细胞活性抑制以及凋亡促进,同时抑制LN-IgG诱导细胞中白细胞介素-6(IL-6)以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的升高,同时诱导足细胞自噬,差异有统计学意义(P<0.05)。CSF1是miR-106a-5p的功能靶标。实验结果显示,在LN-IgG诱导的足细胞中,上调CSF1抑制miR-106a-5p过表达介导细胞活力增强、凋亡抑制、炎症反应以及自噬增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论miR-106a-5p通过靶向抑制CSF1减弱LN-IgG诱导的足细胞凋亡和炎症反应以及促进足细胞自噬,表明miR-106a-5p可能是延迟或缓解LN的有效治疗靶标。

微小RNA-6779-5p对白细胞介素-1β诱导软骨细胞损伤的影响及机制研究

目的 分析微小RNA-6779-5p(miR-6779-5p)在白细胞介素-1β(IL-1β)刺激的软骨细胞中对细胞增殖和凋亡的影响以及相关的分子机制。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法分析RNA的表达量。将miR-6779-5p模拟物、白细胞介素1受体相关激酶3(IRAK3)过表达载体以及各自对照转染CHON-001细胞,采用10 ng/mL的IL-1β刺激细胞。应用功能试验分析miR-6779-5p和IRAK3对IL-1β诱导的细胞损伤的影响;采用免疫印迹试验分析核因子-κB(NF-κB)通路的相关蛋白表达;鉴定miR-6779-5p和IRAK3的关系。结果 miR-6779-5p在骨关节炎患者中表达下调,而IRAK3表达上调,差异有统计学意义(P<0.05);miR-6779-5p和IRAK3的RNA水平在不同浓度IL-1β诱导的CHON-001细胞中也有相同的表达趋势,差异有统计学意义(P<0.05)。IL-1β处理后,CHON-001细胞的活力(100.00%对比51.00%)和EdU阳性率降低(43.00%对比25.00%),细胞凋亡率增加(6.43%对比18.60%),差异有统计学意义(P<0.05),但这些影响在miR-6779-5p过表达后缓解(细胞活力:52.00%对比85.00%;EdU阳性率:25.67%对比38.67%;细胞凋亡率:18.70%对比12.10%),差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-6779-5p靶向结合IRAK3。IRAK3表达上调在IL-1β诱导的CHON-001细胞中逆转miR-6779-5p过表达对细胞的影响,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-6779-5p模拟物在IL-1β诱导的软骨细胞中减少p-P65和P65比值(2.06对比1.34)以及p-IκBα和IκBα的比值(2.42对比1.42),差异有统计学意义(P<0.05),但IRAK3过表达缓解了这些影响(p-P65和P65比值:1.30对比1.88;p-IκBα和IκBα的比值:1.45对比2.16),差异有统计学意义(P<0.05)。结论 miR-6779-5p通过抑制IRAK3/NF-κB通路的激活来挽救IL-1β诱导的软骨细胞损伤,表明miR-6779-5p可能是治疗骨关节炎的潜在靶点。

槲皮素通过调控miR-431-5p/鼠双微基因4信号通路抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞侵袭和促进凋亡

目的 探讨槲皮素对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLSs)侵袭和凋亡的影响以及分子机制。方法 收集27例RA患者和25例非RA患者的滑膜组织。分析miR-431-5p和鼠双微基因4(MDM4) mRNA表达及其蛋白表达。将miR-431-5p抑制剂、miR-NC、MDM4过表达载体和pcDNA 3.1(+)载体转染至RA-FLSs,转染后48 h,在每孔中添加槲皮素,并收集细胞,测定细胞活力、细胞凋亡率和侵袭细胞数。采用双荧光素酶实验分析miR-431-5p和MDM4的结合关系。结果 miR-431-5p在RA滑膜组织和RA-FLSs中表达下调,在槲皮素诱导的RA-FLSs中上调,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-431-5p低表达或者MDM4过表达减弱了槲皮素对RA-FLSs凋亡的促进作用及对侵袭的抑制作用(P<0.05)。miR-431-5p在RA-FLSs中结合MDM4,且miR-431-5p通过MDM4调控RA-FLSs的凋亡和侵袭(P<0.05)。结论 槲皮素通过介导miR-431-5p/MDM4信号通路来调控RA-FLSs侵袭和凋亡,提示槲皮素可能是治疗RA的替代药物。

miR-142-3P靶向ADAM17对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞活性的影响及其作用机制研究

目的:研究微小R-142-3P(miR-142-3P)靶向解聚素金属蛋白酶17(ADAM17)对类风湿关节炎(RA)滑膜成纤维细胞(FLS)活性的影响及其作用机制。方法:购买12份类风湿关节炎-外周血单个核细胞(RA-PBMC),随机分为4个RA-PBMC组,每组3份,3份正常人外周血单个核细胞(PBMC)记为正常PBMC组,采用Western blot法检测检查RA-PBMC、正常PBMC中ADAM17表达情况,采用实时荧光定量PCR法检测RA-PBMC、正常PBMC中miR-142-3P表达情况,检测过度表达ADAM17和miR-142-3P的RA-PBMC对RA-FLS凋亡及增值的影响。结果:RA-PBMC组中ADAM17水平低于正常PBMC组(P<0.05),RA-PBMC组中miR-142-3P水平高于正常PBMC组(P<0.05);过度miR-142-3P组RA-FLS凋亡率高于空白对照组,RA-FLS增殖活性低于空白对照组(P<0.05);过度ADAM17组RA-FLS凋亡率低于空白对照组,RA-FLS增殖活性高于空白对照组(P<0.05)。结论:RA-PBMC中ADAM17呈低表达状态,miR-142-3P呈高表达状态,miR-142-3P与RA-FLS活性呈负相关,ADAM17与RA-FLS活性呈正相关。

WLST训练结合阶段性正念减压训练对系统性红斑狼疮青年女性自护能力、免疫功能及睡眠质量的影响

目的观察系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)青年女性通过威廉姆斯生活技能训练(Williams life skills training,WLST)结合阶段性正念减压训练(MB-SR)对自身自护能力、免疫功能及睡眠质量的影响。方法选取新乡市中心医院风湿免疫科2017年4月至2019年7月期间124例SLE青年女性,按随机数字表分组,两组同在常规护理下,对照组62例给予MB-SR训练,观察组62例增加WLST训练,3个月末,比较两组患者的自护能力、免疫功能及睡眠质量。结果观察组患者自护能力总分较对照组高,IgG、IgA、IgM较对照组降低,匹兹堡睡眠量表(PSQI)总评分较对照组降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论MB-SR训练结合WLST方法更适合于SLE青年女性患者,对患者增强自护能力、增强免疫功能、提升睡眠质量效果显著。

丹酚酸C通过上调转录因子-E2相关因子信号通路抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞炎症及促进凋亡

目的探讨丹酚酸C(SalC)对RA成纤维样滑膜细胞(FLSs)的作用,及转录因子-E2相关因子(Nrf2)信号通路在其中所扮演的角色。方法用丹酚酸C 0.1、1、5、10、20μmol/L分别处理RA-FLSs 24~72 h,之后用CCK8检测细胞活性。根据半抑制浓度(IC50)值,选取实验所需的时间和剂量处理RA-FLSs。用伤口划痕实验和Transwell小室技术检测细胞迁移及侵袭能力。ELISA检测TNF-α,IL-1β及IL-6水平,蛋白质印迹实验检测MMP-9和MMP-13的表达及细胞凋亡相关蛋白及Nrf2及介导的相关基因的表达。用ML385干扰Nrf2,实验分成3组RA-FLSs、RA-FLSs+丹酚酸C(10μmol/L)、RA-FLSs+丹酚酸C(10μmol/L)+ML385(2μmol/L),测量迁移及侵袭能力,并检测凋亡、炎性及Nrf2信号通路相关蛋白的表达。统计学分析采用方差分析,两两比较采用Turkey检验。结果与对照组相比,丹酚酸C处理后RA-FLS的细胞迁移水平(丹酚酸C 0.1μmol/L,0.75±0.05;丹酚酸C 5μmol/L,0.50±0.05;丹酚酸C 10μmol/L,0.26±0.05)显著性减少(t=7.65,P<0.001;t=14.25,P<0.001;t=20.67,P<0.001)和侵袭能力(丹酚酸C 0.1μmol/L,0.75±0.11;丹酚酸C 5μmol/L,0.49±0.06;丹酚酸C 10μmol/L,0.26±0.07)显著性降低(t=4.93,P<0.001;t=10.32,P<0.001;t=14.96,P<0.001),MMP-9(丹酚酸C 0.1μmol/L,0.72±0.10;丹酚酸C 5μmol/L,0.48±0.08;丹酚酸C 10μmol/L,0.27±0.06)水平显著性降低(t=5.60,P<0.001;t=11.03,P<0.001;t=5.94,P<0.001)及MMP-13(丹酚酸C 0.1μmol/L,0.77±0.06;丹酚酸C 5 mol/L,0.58±0.06;丹酚酸C 10μmol/L,0.32±0.13)水平显著性减少(t=8.66,P<0.001;t=11.03,P<0.001;t=14.22,P<0.001),促进细胞凋亡。丹酚酸C显著性降低促炎性细胞因子的水平(P<0.001),激活Nrf2信号通路蛋白Nrf2,过氧化氢酶(CAT),醌NADH脱氢酶1(NQO1)、超氧化物歧化酶1(SOD1)及谷胱甘肽合成酶(GSS)的表达(P<0.001)。用ML385干扰Nrf2后,显著性逆转丹酚酸C对Nrf2通路蛋白Nrf2(0.68±0.06;t=5.08,P<0.001),CAT(1.44±0.12;t=4.77,P<0.001),NQO1(0.65±0.12;t=5.04,P<0.001),SOD1(1.43±0.10;t=6.36,P<0.001)及GSS(1.42±0.10;t=7.60,P<0.001)的水平,及TNF-α[(260±22)pg/ml;t=13.75,P<0.001],IL-1β[(701±30)pg/ml;t=12.98,P<0.001],IL-6[(180.3±10.2)pg/ml;t=16.38,P<0.001]炎症因子的水平。除此之外ML385阻碍丹酚酸C对细胞迁移和侵袭的抑制作用(0.70±0.09;t=11.24,P<0.001;0.64±0.04;t=8.03,P<0.001)及对凋亡的诱导作用(24.4±1.8;t=23.02,P<0.001)。结论丹酚酸C可能通过上调Nrf2信号通路,抑制细胞活力及炎症反应,促进凋亡。丹酚酸C是治疗RA的有效潜在药物,但有待进一步动物及临床深入研究。