多肽的电泳分离

目的 :对4种PAGE方法进行比较 ,选择出适用于分离小分子质量多肽的电泳方法。方法 :用常规SDS_PAGE、低分子质量Tricine_SDS_PAGE、多肽SDS_PAGE以及含尿素的多肽SDS -PAGE4种方法对相同的样品进行电泳分离 ,并对分离效果进行比较。结果 :常规SDS_PAGE不适合分离小分子质量多肽 ,Tricine_SDS_PAGE对分子质量小于10ku的样品效果不佳。多肽SDS_PAGE能分离分子质量在5～20ku的多肽 ,含尿素的多肽SDS_PAGE对分子质量小于5.0ku的多肽也能很好的分离。结论 :含尿素的多肽SDS_PAGE对小分子质量多肽的分离效果最好 ,可根据实验的需要选择适合的电泳方式。

不同碘营养状态对大鼠肝组织Ⅰ型5’脱碘酶的影响

目的研究不同碘营养状态对大鼠肝组织甲腺氨酸I型5’脱碘酶(DI)表达水平及活性的影响。方法正常1月龄Wistar大鼠根据碘摄入量不同分为6组,饲养3个月后处死。放免法测定血清甲状腺激素水平。提取肝组织总RNA,以B-actin为内对照,半定量RT-PCR分析DI基因的表达水平。Chopra氏方法测定肝组织匀浆液中DI的脱碘活性。结果 LI组TT4和FT4显著低于其他5组(P<0．05),100HI组TT3和FT3显著低于其他5组(P<0．05),100HI组TT4和FT4显著低于NI、5HI、10HI和50HI组(P<0．05)。大鼠肝组织DI基因mRNA表达量6组间差异有统计学意义(P<0．01),LI组显著高于其他5组(P<0．05),不同剂量HI组和NI 组相比差异均无统计学意义(P>0．05)。大鼠肝组织DI活性6组间差异有统计学意义(P<0．01),LI组显著高于其他5组(P<0．05),50HI组和100HI组显著低于其他4个组(P<0．05)。结论在碘缺乏状态下,大鼠出现以低T4为主要表现的甲状腺功能减退(甲减),DI活性和DI基因表达水平代偿性上调,使机体维持足够的T3 水平,以避免周围组织出现器官性甲减。高碘仅在转录后水平影响DI,表现为直接抑制DI的活性,使血清TT3和 FT3下降,机体出现失代偿性周围组织器官性甲减。DI对碘过量有一定的耐受能力,这种耐受性有一定的阈值。

缺碘大鼠补碘对脑内甲状腺激素受体的影响

目的研究缺碘大鼠补充不同质量浓度碘后脑内甲状腺激素受体与激素结合动力学参数的变化。方法复制Wistar低碘大鼠,然后根据饮用不同质量浓度的碘水来分组。选用第2代20日龄仔鼠实验,测定甲状腺功能状态,利用放射配体结合分析法测定脑内T3受体。结果①血清T3浓度:低碘组(LI)、高碘组(HI)、适碘组(AI)与正常对照组(N)相比,差异无显著意义(P> 0.05)。血清FT3:LI组、HI组明显高于N组(P< 0.05);②血清T4和FT4:LI组和HI组均显著低于N组(P< 0.05);③受体最大结合容量(MBC):LI组明显高于N组(P< 0.05)。结论LI组血中TT4和FT4低于N组,而脑中T3核受体MBC高于N组,提示甲状腺功能低下(甲低)状态下,脑组织中T3核受体有代偿性升高。高碘状态下缺碘大鼠脑细胞核T3核受体、MBC虽略有升高,但血中TT4和FT4却低于正常,提示长期缺碘后过量补碘会出现碘性甲低。长期缺碘后,即使补充适量碘也会出现一过性碘性甲状腺功能亢进(甲亢)。

rhBMP-2对壳聚糖复合成骨细胞后的成骨活性影响

将重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP2)与壳聚糖为主要基质的支架材料相复合,γ射线辐射灭菌后接种上原代培养的大鼠成骨细胞。体外培养3天后扫描电镜观察细胞与材料的贴附情况,可见成骨细胞紧密贴附于材料孔隙内并保持良好的生长状态。将接种有成骨细胞的复合材料植入裸鼠背部皮下,植入8周后Xray摄片、组织学染色观察植入部位骨形成及支架材料降解情况。Xray下可见与植入物大小、位置相符的高密度影,组织学染色证实材料的降解及孔隙内硬骨的生成。

原位合成TiC颗粒弥散强化2A50铝基耐磨材料

采用原位合成的方法制备30wt%TiC/Al中间合金,再以2A50铝合金为基体,通过搅拌铸造法加入一定量的中间合金制备TiC颗粒弥散强化2A50铝基耐磨材料。采用XRD和SEM研究了中间合金的显微组织和相组成以及TiC颗粒的加入对基体的组织及力学性能的影响。结果表明:TiC为原位合成反应的唯一生成产物,且颗粒细小分布均匀,TiC颗粒的加入能够细化基体的晶粒,显著提高基体合金的力学性能,尤其是耐磨损性能。

重组人ω-干扰素的制备及活性分析

目的:建立人ω-干扰素(hIFN-ω)的大肠杆菌表达系统,为人ω-干扰素的生产及临床应用奠定基础。方法:自抗凝血中提取人基因组DNA,PCR扩增人ω-干扰素成熟肽编码序列克隆入pGEM-T-easy载体,进一步构建表达型重组质粒pBV-IFN-ω,温度诱导表达,表达产物行SDS-PAGE及Western blot鉴定。溶解并复性包涵体,细胞病变抑制法测定表达产物的抗病毒活性。结果:DNA序列分析证实,重组质粒pBV-IFN-ω含有开放读码框架正确的人ω-干扰素成熟肽编码序列。SDS-PAGE显示,诱导表达碎菌后的沉淀中有大小约为20kD的外源蛋白,Western blot证明此外源蛋白为重组人ω-干扰素,并经体外活性测定证实有良好的抗病毒活性。结论:成功地构建了人ω-干扰素(IFN-ω)的大肠杆菌表达系统,表达出具有抗病毒活性的重组人ω-干扰素。

新生儿甲低筛查脐足血相关性分析

目的分析甲低筛查中脐足血相关性,评价脐血代替足血的可靠性。方法采用Finlandlabsystems公司NeonatalhTSHELISA试剂盒和本实验室TSH检测试剂盒两种试剂盒对天津市226例脐足血分别进行三次测定。结果经统计三次测定结果的相关系数r分别为0.176,0.325,0.14,P<0.05。结论脐血不能替代足血进行甲低筛查。

不同碘营养水平对大鼠肝脏组织中Ⅰ型5’脱碘酶的影响

目的研究不同碘营养水平对大鼠肝脏组织中Ⅰ型5’脱碘酶（DI）表达及活性的影响。方法正常2月龄Wistar大鼠根据碘摄入量不同分为6个组：低碘（LI）组、适碘（NI）组、5、10、50、100倍高碘（5HI、10HI、50HI、100HI）组，分别于饲养3、6、12个月时处死。放免法测定血清甲状腺激素水平；提取肝组织总RNA，以β-actin为内对照，半定量RT-PCR分析DI基因的表达水平：改进的Chopra法测定肝组织匀浆液中DI活性。结果与NI组相比，因碘供给量及给予时间的不同，100HI组及LI组大鼠血清甲状腺激素水平有不同程度的降低．而50HI组则无明显变化。肝DI基因表达水平，LI组随低碘持续时间的不同有所波动，各HI组则与NI组无显著差别。肝DI活性：3个月时与碘供给量成反比；饲养6、12个月时LI组则显著低于NI组（P〈0．05），各高碘组与NI组相比较，差异没有统计学意义（P〉0．05）。结论在碘缺乏早期，大鼠出现以低L为主要表现的甲状腺功能低下症（甲低），并导致DI活性和DI基因表达水平代偿性上调，以维持足够的T3水平来避免周围组织出现器官性甲低；长期碘缺乏后，动物表现为失代偿性的甲低和肝DI活性及DI基因表达水平的降低。机体对碘过量有一定的耐受阈值，若碘摄入量为正常量的50倍以内，甲状腺功能可保持正常，当超过50倍时，甲状腺功能出现失代偿。长期（12月）高碘状态下．机体又会出现对高碘的耐受，而表现为甲状腺功能逐渐恢复正常．肝DI的活性和基因表达水平也趋于正常。

突变型人白细胞介素-2基因在大肠杆菌中的表达

目的:建立突变型人白细胞介素-2(rhIL-2)基因大肠杆菌表达系统,为rhIL-2的生产及临床应用奠定基础。方法:自人胎盘组织中提取总RNA,逆转录PCR(RT-PCR)扩增突变型人IL-2基因cDNA,通过对下游引物的设计将编码125位半胱氨酸(C125)的密码子TGT更改为编码丝氨酸的密码子TCT。构建表达型重组质粒pBV-IL-2熏温度诱导表达,表达产物行SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)及WesternBlot鉴定。结果:DNA序列分析证实,重组质粒pBV-IL-2含有突变型人IL-2编码序列及正确的开放读码框架。SDS-PAGE显示,诱导表达碎菌后的沉淀中有分子质量大小约为16.5ku的外源蛋白产生,经Western印迹(WesternBlot)证明为rhIL-2。结论:成功构建了突变型人白细胞介素-2大肠杆菌表达系统,表达产物主要以包涵体的形式存在于碎菌后的沉淀中。

不同碘营养状态对克汀大鼠脑内甲状腺激素受体的影响

目的 利用放射配体结合分析法研究不同碘营养状态下大鼠脑内甲状腺激素受体与激素结合的动力学参数的变化。方法 利用低碘饮食复制了Wistar克汀大鼠模型。取第 2代缺碘动物 ,自分娩之日起 ,分别给每窝母鼠和其哺乳的仔鼠供应不同含碘量的饮水以补给不同量的碘 ,并依次分组。选用 2 0日龄的仔鼠进行实验 ,对 4组动物模型甲状腺功能状态及脑内T3 受体性质和数量进行了测定。结果 ①甲状腺功能比较 :血清TT3 水平各组间无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;血清FT3 浓度低碘组显著高于正常对照组 74 .0 % (P <0 .0 5 ) ;作为甲功重要指标的TT4和FT4在低碘组均显著低于正常对照组 (P <0 .0 5 ) ,均为正常对照组的 3.5 % ;适碘组与正常组比 ,TT4和FT4前者均显著高于后者 (P <0 .0 5 ) ;高碘组除了FT3 显著高于正常对照组外 ,其TT4和FT4均显著低于正常对照组 (P <0 .0 5 ) ,仅分别为正常对照组的 6 1.86 %和 6 2 .0 %。②脑T3 受体参数比较 :各组Ka近似而变化不大 ,各曲线斜率近于平行 ;低碘组最大结合容量MBC显著高于正常对照组 19.7% ,也显著高于适碘组35 .3% (P <0 .0 5 ) ,其他组间无显著差异。结论 低碘组血中TT4和FT4低于正常组而脑中T3 核受体结合容量高于正常对照组 ,提示甲低脑中受体有代偿性升高。高碘?

重组人胰岛素样生长因子1的制备

目的:建立人胰岛素样生长因子1(IGF-1)基因大肠杆菌高效表达系统及rhIGF-1的初步纯化方法。方法:将人IGF-1基因克隆入原核表达质粒载体pBV220,重组质粒转化大肠杆菌DH5α,温度诱导表达,WesternBlot对表达产物进行鉴定。超滤离心纯化rhIGF-1,纯化产物行高效液相色谱分析。H3-TdR掺入法测定所制备rhIGF-1的促细胞增殖活性。结果:成功构建了重组质粒pBV-IGF-1,聚丙烯酰胺凝胶电泳可见与预期7.5ku大小相符的蛋白条带,WesternBlot证实该条带即为rhIGF-1。超滤离心一步纯化后rhIGF-1纯度即可达95%以上。H3-TdR结果显示,所制备的rhIGF-1可促进体外培养成肌细胞增殖。结论:成功建立了rhIGF-1的制备及纯化方法,表达产物经体外试验证实具有促细胞增殖的生物活性。

基于溢出与合作效应的企业共性技术研发的博弈分析

建立在D'Aspremont&Jacquemin创立的博弈分析模型(简称A-J模型)的基础上,通过构建数理模型,加入合作系数,同时考察共性技术研发的溢出效应和合作水平对技术研发水平的影响。研究表明,考虑研发具有水平溢出效应,如果溢出效应很大,那么企业之间共性技术的研发采用合作的模式最佳,同时,如果合作系数很高,企业共性技术研发水平也会提高。政府决策者应鼓励企业在共性技术研发上加强合作,并在必要时提供政策扶持和资金支持。

从矿化的骨组织中提取骨细胞的总RNA

描述了两个从以含大量羟基磷灰石 (钙 )和细胞密度、数量甚低为特点的矿化的成年骨组织 (成年大鼠颅骨 )提取总RNA的改进方法 .紫外分光光度法 (A2 60 、A2 80 和A2 3 0 )和 1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳予以鉴定 .进而以其逆转录的cDNA为模板扩增出 β actin和BMP 2基因 ,均表明所得总RNA完整和模板活性俱佳 .每克骨组织中总RNA产量为 5 6 0

重组人促甲状腺激素β亚基的切胶纯化及多克隆抗体制备

目的:切胶纯化重组人促甲状腺激素亚基(hTSHβ),免疫家兔制备多克隆抗体,为人TSH测定试剂盒的国产化奠定基础。方法:将含有重组人促甲状腺激素β亚基(hTSHβ)的大肠杆菌表达产物进行SDS-PAGE分离,切取相应分子量的蛋白条带,研磨回收后用于免疫新西兰大耳朵白兔,ELISA监测血清中抗hTSHβ抗体的效价,饱和硫酸铵沉淀及亲和层析自血清中纯化抗体。结果:切胶后获得了高纯度的重组GST-hTSHβ蛋白,所免疫家兔产生了针对hTSHβ的多克隆抗体,效价可达1:12000。结论:切胶纯化的重组hTSHβ蛋白可成功诱导兔产生高效价的抗hTSHβ多克隆抗体。

胰岛素样生长因子1对成骨细胞中BMP-2、BMP-7基因表达的影响

目的 研究胰岛素样生长因子1(IGF-1)对成骨细胞中BMP-2、BMP-7基因表达的影响,探讨IGF-1促进成骨细胞增殖、分化的分子机理。方法 以不同浓度的IGF-1刺激分离培养的大鼠成骨细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR扩增BMP-2及BMP-7基因cDNA,同时扩增管家基因β-actin作为内对照。扫描PCR产物电泳照片,计算BMP-2/β-actin及BMP-7/β-actin的积分光密度比值,推算BMP-2及BMP-7基因的相对表达水平。结果 IGF-1可以在转录水平增加大鼠成骨细胞中BMP-2及BMP-7基因的表达,并呈明显的剂量依赖关系。结论IGF-1促进成骨细胞增殖、分化的作用可能是通过增加BMP-2及BMP-7基因的表达来实现的。

人骨形态发生蛋白2(BMP-2)在巴斯德毕赤酵母中的表达

以重组质粒pUC-BMP2为模板PCR扩增人BMP-2成熟肽编码序列,将该序列克隆入pGEM-T载体进行DNA序列分析后亚克隆入分泌型毕赤酵母表达载体pPIC9K中。重组质粒oPIC9K-BMP2经BelⅡ酶切后回收线性化片段,聚乙二醇法转染毕赤酵母茵株GS115。PCR筛选整合有人BMP-2基因的酵母细胞重组子,以甲醇进行诱导表达,于酵母细胞培养基中可检测到rhBMP-2。体外培养条件下,所得rhBMP-2可增加2T3小鼠成骨细胞内碱性磷酸酶活性;体内实验.rhBMP-2冻干粉可于小鼠骨四头肌肌袋中诱导软骨细胞群产生。

大鼠胰岛素样生长因子Ⅰ基因的克隆及表达

以大鼠染色体DNA为模板 ,PCR分别扩增胰岛素样生长因子Ⅰ (IGF Ⅰ )基因外显子 2编码区和外显子 3编码区 ,并使外显子 2编码区的 3′端与外显子 3编码区的 5′端有相同的 4 0个碱基。采用外显子拼接法 ,以两种扩增产物为模板再次进行PCR ,得到 2 10bp的大鼠IGF Ⅰ基因全编码序列。将此序列克隆入pUC18质粒进一步构建表达型重组质粒pGEX IGF Ⅰ ,并在大肠杆菌DH5α中进行诱导表达。表达产物经SDS PAGE分析及Westernblot检测 ,并经体外实验证明其具有刺激细胞增殖的生物活性。

超热中子活化法研究补碘大鼠甲状腺碘水平

低碘饲料喂养的第二代Wistar母鼠,产子后根据其母鼠饮水中KIO3的质量浓度(3 0,0 4,0mg/L),将其分为高碘,适碘和缺碘三组,另用正常鼠饲以低碘饲料和0 4mg/LKIO3+超纯水作为对照组,用超热中子活化法测定第三代幼鼠甲状腺中的碘含量,并用酶联免疫法测定血清中甲状腺激素水平。实验结果表明,与对照组相比,高碘组的总四碘甲状腺原氨酸(TT4)和游离四碘甲状腺原氨酸(FT4)明显偏低(p<0.001),游离的三碘甲状腺原氨酸(FT3)明显偏高(p<0.001),其第三代幼鼠的体重也明显增高,并伴有甲肿,但甲状腺含碘量无显著差别;适碘组的甲状腺质量、总含碘量和血清激素水平均无显著差别。实验还表明,妊娠期缺碘母鼠产后及时补碘,仔鼠甲状腺中的碘含量和血清甲状腺激素持正常水平。但过量补碘反而引起TT4和FT4水平低下和甲肿。

壳聚糖与重组人骨形成蛋白2复合物体外成骨作用的研究

目的探讨复合重组人骨形成蛋白2(recombinanthumanbonemorphogeneticprotein2,rhBMP-2)的壳聚糖-明胶支架的体外成骨作用。方法将rhBMP-2与壳聚糖-明胶支架复合,按2×104/ml的密度接种成骨细胞系或成肌细胞系至rhBMP-2复合材料上,以及无rhBMP-2复合的对照材料上。A组(2T3成骨细胞接种组),其中实验A组复合有rhBMP-2的材料14块,分别于接种培养第3、7、14和21天各取3块,以管家基因β-tubulin为内参照,RT-PCR行半定量分析,测定骨钙素基因表达水平,余2块于第14天终止培养,茜素红-S染色观察钙盐沉积情况;对照A组未复合rhBMP-2的材料5块,接种培养至14d终止,其中3块用于测定骨钙素基因表达,2块测定钙盐沉积。B组(C2C12成肌细胞接种组),实验组及对照组情况、培养时间及检测指标同A组。另取接种有rhBMP-2的材料2块接种2T3成骨细胞,培养3d后扫描电镜观察细胞与材料的黏附情况。结果A组培养3d,扫描电镜可见成骨细胞紧密黏附于多孔材料网表面,生长状态良好。实验A组成骨细胞中骨钙素基因的表达为1.28±0.17,对照A组14d为0.56±0.09,表明复合rhBMP-2可促进材料中骨钙素基因表达,两者差异有统计学意义(P<0.01);rhBMP-2还可诱导不表达骨钙素基因的C2C12成肌细胞出现基因表达,B组培养21d,实验B组为0.58±0.13,对照B组为0,差异有统计学意义(P<0.01)。茜素红-S染色可见,A组材料网络内均有不同程度的钙盐沉积。接种相同的细胞时,复合有rhBMP-2的材料中有更多的钙盐沉积。结论复合有rhBMP-2的壳聚糖-明胶人工骨支架材料在体外具有良好的诱导成骨能力。