HLA-G基因敲除人滋养层干细胞模型构建

目的构建人白细胞抗原G(HLA-G)基因敲除的人滋养层干细胞(TSC)模型,初步探究HLA-G对TSC向绒毛外滋养层细胞(EVT)分化的影响。方法利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人TSC的HLA-G基因,将TSC向EVT细胞分化,采用免疫荧光染色及实时定量聚合酶链式反应(qPCR)方法观察HLA-G基因敲除对其标志基因表达的影响。结果经测序、免疫荧光染色及蛋白质印记法(WB)验证,成功获得了HLA-G基因完全敲除的人TSC细胞系。HLA-G^(-/-)-TSC可诱导分化为EVT样细胞,HLA-G^(-/-)-EVT的标志基因表达量与野生型相比无显著性差异(P>0.05)。结论本研究成功构建了稳定的HLA-G基因敲除人TSC模型,且HLA-G并不明显影响EVT的分化过程。

经典Wnt/β-catenin信号通路介导子痫前期滋养细胞氧化应激损伤的机制研究

目的:研究经典Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路参与人滋养细胞氧化应激损伤的机制,探讨其在子痫前期(preeclampsia,PE)发病中的作用。方法:(1)采用免疫组化SP法和蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测胎盘组织中β-catenin信号分子的表达。(2)将HTR8/SVneo分为正常培养对照组、缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)处理组、氯化锂(Li Cl)+H/R处理组、Li Cl+正常培养组。利用WB法和间接免疫荧光法检测β-catenin在各组细胞中的表达。(3)利用流式细胞仪检测各组细胞凋亡指数及细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。(4)利用Transwell小室模型和明胶酶谱法分析检测各组HTR8/SVneo的侵袭率及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、9的活性。结果:(1)与正常晚孕比较,子痫前期胎盘组织中β-catenin蛋白表达降低(P<0.05)。(2)与正常培养组相比较,H/R处理组的β-catenin蛋白水平显著下降,经Li Cl预处理后H/R细胞中的β-catenin蛋白表达增加(P<0.01)。(3)与正常对照组相比,H/R处理可导致HTR8/SVneo凋亡率及ROS水平增加(P<0.01);予以Li Cl预处理可有效抑制H/R导致的细胞凋亡及ROS聚集(P<0.05,P<0.01)。(4)H/R组细胞的体外侵袭能力及MMP-2、9的活性均低于正常培养组;经Li Cl预处理后,H/R组细胞的体外侵袭能力及清液中MMP-2、9的活性显著上升(P<0.01)。结论:Li Cl通过特异性激活Wnt/β-catenin信号通路,对滋养细胞氧化应激损伤有保护性作用。

SATB1及wnt/β-catenin信号通路相关分子在子痫前期胎盘组织中的表达及意义

目的：探讨富含AT序列的特异性结合蛋白1（SATB1）及蛋白（wnt）/β连环蛋白（β-catenin）信号通路相关分子在调控滋养细胞侵袭以及在子痫前期发病中的作用。方法收集2013年3月-2014年3月在重庆医科大学附属第一医院行人工流产术的20例孕8-10周孕妇的绒毛组织（早孕组）；同期在妇产科住院行水囊引产的18例中孕期（孕18-20周）孕妇的胎盘组织（中孕组）；同期行择期剖宫产术的20例健康足月妊娠孕妇的胎盘组织（正常足月组）；同期住院行选择性剖宫产术分娩的20例子痫前期孕妇（孕33-38周）的胎盘组织（子痫前期组）。采用免疫组化SP法检测各组绒毛或胎盘组织中SATB1及β-catenin的蛋白表达定位；采用蛋白印迹法检测各组绒毛或胎盘组织中SATB1及β-catenin的蛋白表达水平；采用细胞免疫荧光法检测SATB1及β-catenin在滋养细胞株HTR8/SVneo细胞中的定位表达，并对细胞中SATB1及β-catenin蛋白表达水平进行检测；采用免疫共沉淀法检测子痫前期组胎盘组织和缺氧/复氧组HTR8/SVneo细胞中的SATB1与β-catenin的相互关系；采用明胶酶谱法检测子痫前期组和缺氧/复氧组细胞中基质金属蛋白酶（MMP）2、9的活性水平。结果（1）正常足月组胎盘组织合体滋养细胞结节和纤维素样坏死很少见，毛细血管数目丰富；子痫前期组胎盘组织可见合体滋养细胞胞核空泡化明显，有较多纤维素样坏死，绒毛内微血管数目减少。（2）各组绒毛或胎盘组织中均可见SATB1棕黄色染色颗粒，子痫前期组胎盘组织中SATB1阳性染色强度较正常足月组明显减弱。（3）各组绒毛或胎盘组织中均可见β-catenin蛋白的表达，子痫前期组胎盘组织中β-catenin阳性染色强度较正常足月组减弱。（4）早孕组、中孕组、正常足月组及子痫前期组中SATB1蛋白表达水平分别为0.300±0.009、0.271±0.015、0.238±0.018及0.153±0.007；β-catenin蛋白表达水平分别为0.743±0.041、0.648±0.021、0.549±0.069及0.269±0.047。子痫前期组SATB1及β-catenin蛋白表达水平均较早孕组、中孕组、正常足月组明显下降，分别比较，差异均有统计学意义（P〈0.05）。（5）常氧组及缺氧/复氧组SATB1蛋白定位于细胞滋养细胞的胞核中，缺氧/复氧组细胞的荧光强度较常氧组细胞明显减弱；常氧组及缺氧/复氧组β-catenin蛋白定位于细胞滋养细胞的胞核及胞质中，缺氧/复氧组细胞的荧光强度较常氧组细胞明显减弱。（6）常氧组细胞SATB1及β-catenin蛋白表达水平分别为0.213±0.005和0.797±0.081，而缺氧/复氧组分别为0.083±0.021和0.543±0.131。两组分别比较，差异均有统计学意义（P〈0.05）。（7）子痫前期组胎盘组织中和缺氧/复氧组细胞中经SATB1抗体免疫共沉淀后的蛋白复合物中，均可检测到β-catenin蛋白的表达；同样，经β-catenin抗体免疫共沉淀后的蛋白复合物中，也均可检测到SATB1蛋白的表达。（8）子痫前期组胎盘组织中MMP-2、9活性水平分别为2.251±0.310、1.447±0.102，正常足月组分别为7.098±0.451、5.502±0.197，两组分别比较，差异有统计学意义（P〈0.05）。缺氧/复氧组细胞中MMP-2、9活性水平分别为0.471±0.104、0.297±0.103，常氧组分别为0.842±0.209、0.595±0.100，缺氧/复氧组细胞明显低于常氧组，分别比较，差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论子痫前期胎盘组织中SATB1表达水平下降，可能是通过调控wnt/β-catenin信号通路而影响MMP-2、9的活性水平改变，使滋养细胞的侵袭力减弱，最终导致子痫前期的发生。

过表达SATB1保护人滋养细胞氧化应激损伤的机制研究

目的探讨富集AT序列的特异性结合蛋白1(SATB1)参与人绒毛外滋养细胞株(HTR8/SVneo)氧化应激损伤的机制。方法收集2013年9月至2014年9月在重庆医科大学附属第一医院产科行选择性剖宫产术的子痫前期孕妇(n=22)和正常足月妊娠行择期剖宫产术的孕妇的胎盘组织(n=22)。采用免疫组化和Western blotting(WB)检测正常晚孕期及子痫前期胎盘组织中SATB1的表达。构建SATB1过表达慢病毒载体(LV-SATB1)和阴性对照载体(LV-NC)。将滋养细胞分为正常培养对照组、缺氧/复氧(H/R)培养组、LV-SATB1+H/R培养组、LV-NC+H/R培养组。利用免疫荧光和WB法检测SATB1在各组细胞中的表达。采用流式细胞仪检测细胞凋亡指数及细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。利用Transwell小室模型检测细胞的体外侵袭率。结果 SATB1在子痫前期中的表达显著低于正常晚孕组(0.24±0.02 vs.0.12±0.01,t=9.35,P<0.05)。转染LV-SATB1可显著提升H/R培养组的SATB1蛋白水平(0.92±0.17 vs.0.58±0.15,P<0.01)。LV-SATB1可抑制H/R导致的细胞凋亡率上升及ROS聚集(P<0.01)。H/R组细胞侵袭能力低于正常培养组;上调SATB1的表达可提升H/R组细胞的体外侵袭能力(34.33±10.08 vs.19.33±6.52,P<0.05)。结论过表达SATB1可以逆转滋养细胞氧化应激损伤,其有望成为研究子痫前期发病机制的新靶点。

人类白细胞抗原-G在母-胎免疫界面的功能和作用机制

人类白细胞抗原-G(human leucocyte antigen G, HLA-G)作为非经典的主要组织相容性复合物Ⅰ类分子, 在母-胎界面的绒毛膜外滋养层细胞上特异性表达。妊娠期间, 胎儿同种异源的绒毛膜外滋养细胞侵入子宫黏膜, 却免于母体来源的免疫细胞攻击, 其中HLA-G起到极其关键的作用。关于HLA-G在母-胎界面特殊调控方式的研究, 特别是与各类免疫细胞及膜表面受体作用的分子机制, 引起学者的广泛关注。本文将着重对HLA-G在母-胎界面的表达、调节及与相关免疫细胞作用机制进行综述。