紫花苜蓿SAUR基因家族的鉴定及其在非生物胁迫中的表达模式研究

SAUR(small auxin-up RNA)是植物早期响应生长素的一类基因,参与植物生长发育与非生物胁迫响应等一系列生物过程。在拟南芥、水稻、棉花等物种中已经对SAUR基因家族进行了系统鉴定与分析,但是,在世界上最重要的豆科牧草紫花苜蓿中关于SAUR基因家族的研究尚未开展。本研究利用生物信息学的方法在紫花苜蓿参考基因组共鉴定到433个MsSAUR成员,并对其基因组位置、基因结构、启动子顺式作用元件以及不同组织中的表达模式进行了分析。同时,利用紫花苜蓿在不同非生物胁迫下的转录组数据,发现有5、11、19以及12个MsSAUR成员分别响应干旱、盐、冷以及碱胁迫,MsSAUR14/94/254可以同时响应干旱和盐胁迫,MsSAUR297可以同时响应干旱、盐以及碱胁迫,MsSAUR306可以同时响应干旱、盐以及冷胁迫。本研究结果可为后期通过基因工程技术创制高产抗逆新种质提供重要的候选基因。

全基因组水平紫花苜蓿WRKY转录因子家族鉴定与表达模式分析

WRKY转录因子是植物中最大的基因家族之一,在植物生长发育以及非生物胁迫过程中发挥重要的作用。目前,WRKY基因家族成员已经在多个植物物种中进行了广泛的研究和分析。然而,WRKY转录因子尚未在四倍体紫花苜蓿全基因组水平上进行鉴定与分析。本研究系统鉴定了紫花苜蓿WRKY基因家族成员,并对其在不同胁迫处理下的表达模式进行了分析。结果显示,共有198个WRKY转录因子不均匀分布在紫花苜蓿的32条染色体上,其中7号染色体的数量最多。系统进化树结果显示,WRKY基因家族成员可以分为3个组。在这些WRKY转录因子中,有42个响应盐胁迫,7个响应碱胁迫,19个响应冷胁迫和37个响应干旱胁迫,同时发现MsWRKY154和MsWRKY166可以同时响应盐、干旱、冷以及碱胁迫。本研究的结果可为紫花苜蓿WRKY转录因子的生物学功能深入研究奠定基础,同时可为紫花苜蓿分子育种提供有价值的信息。

北京地区10个紫花苜蓿引进品种的生产性能研究

通过2002～2007年的田间试验,对国外10个紫花苜蓿品种的产量性能进行了评价,以期筛选出适宜北京及周边地区种植的苜蓿品种,并为新品种的选育提供参考。结果表明:不同年份的苜蓿年产量具有极显著差异(P<0.01);10个苜蓿品种中6年平均年产量(干重)居前三位的是爱菲尼特、牧歌、胜利者,干草产量分别为13.9t/hm2、13.8t/hm2、13.6t/hm2;不同茬次的产量存在显著差异(P<0.05),第1茬产量最高,占年总产量的32%以上,第4茬产量最低,占年总产量的百分比不足18%,第2茬和第3茬产量之间差异不显著;不同茬次对年产量的相对重要性依次为:第1茬>第2茬>第3茬>第4茬;不同年份之间的年株高存在显著差异(P<0.05),2002年各品种年株高最低,2007年最高;10个品种间的年株高没有显著差异,牧歌的年株高始终位居前5位。综合6年的结果,筛选出适宜北京地区种植的苜蓿品种为爱菲尼特、牧歌、胜利者。

41份紫花苜蓿抗旱鉴定试验研究

对来自国内外不同种质的41个紫花苜蓿品种进行盆栽试验,测定其7个抗旱鉴定指标,应用系统聚类的方法对数据进行分级聚类,使其归属于3个抗旱等级,分别是:强抗旱、中抗旱和弱抗旱。

干旱对苜蓿叶片可溶性蛋白的影响

利用SDS-PAGE电泳分析法探讨干旱对供试苜蓿品种叶片可溶性蛋白的变化及其与干旱强度的关系。结果表明:可溶性蛋白的变化与干旱强度有直接关系,随着干旱胁迫强度的增加某些可溶性蛋白的变化表现为先增强后减弱;干旱胁迫诱导蛋白量的变化各异,抗旱性强的品种能诱导基因更强的表达以适应干旱胁迫,而抗旱性较弱的品种可能减弱或丧失其自我调节能力,产生的干旱诱导蛋白量比前者少;在干旱15 d时,抗旱性强的品种均被诱导产生新的蛋白带,只有两个抗旱性弱的品种出现该谱带;供试苜蓿品种的抗旱性存在明显的遗传多样性,其中抗旱性强的品种是苜蓿抗旱性选育的重要种质资源。

低温胁迫对野牛草幼苗渗透调节物与根系活力的影响

以暖季型草坪草"中坪一号"野牛草为材料,研究低温胁迫对其幼苗渗透调节物与根系活力的影响。结果表明,渗透调节物与野牛草幼苗低温调节机制密切相关。在低温胁迫下,可溶性糖、可溶性蛋白质、游离脯氨酸含量呈上升的趋势。随着低温处理时间的延长,可溶性糖含量的增加趋于平缓;可溶性蛋白质含量受低温影响较大,随低温胁迫强度的增大,叶片中可溶性蛋白质含量明显增加;游离脯氨酸含量的变化较敏感,低温处理初期,脯氨酸含量急剧上升,随着处理时间延长脯氨酸含量又缓慢降低,但整个过程中脯氨酸含量保持在较高水平;低温胁迫对野牛草幼苗根系活力的影响较显著,随着低温胁迫时间的延长,根系活力急剧降低,说明根系对维持植物正常生长发育的重要性,或可作为植物抗寒性鉴定的一项重要指标。

紫花苜蓿QTL与全基因组选择研究进展及其应用

四倍体紫花苜蓿是重要的豆科牧草之一,由于其复杂的遗传背景与二倍体作物相比遗传作图与重要性状数量性状位点(quantitative trait locus,QTL)定位研究相对滞后。然而,二倍体苜蓿的相关研究起步较早,已经建立了高密度遗传图谱和物理图谱,这些研究为四倍体苜蓿遗传作图与QTL定位奠定了基础。随着第三代分子标记与测序技术的快速发展,极大地促进了四倍体苜蓿的高密度遗传图谱构建与QTL定位研究,并借助分子标记辅助育种技术对提高苜蓿选育效率,加速育种进程具有重要意义。本文对苜蓿遗传图谱构建与QTL定位研究及发展趋势进行了总结,并对苜蓿关联作图与全基因组选择的研究进展及应用前景加以概述,旨在为读者就相关研究领域有较全面的了解。

中苜1号紫花苜蓿高效共生根瘤菌的筛选

研究8株根瘤菌对“中苜1号”紫花苜蓿（Medicago sativa L.cv.Zhongmu No.1）的接种效果。结果表明：8株根瘤菌接种效果差异明显;接种后干草重、根瘤数、干根重、粗蛋白质含量比对照分别增加了3.8%-26.12%、2.9%-41.43%、5.8%-41.38%和2.39%-8.5%;筛选出与中苜1号最佳共生匹配的根瘤菌ACCC17544,该菌株能增强其共生固氮效果,既提高干草产量,又增加粗蛋白质含量,具有一定的生产应用价值。

紫花苜蓿MsSQE1的克隆及对皂甙合成的功能分析

【目的】鲨烯环氧酶(squalene epoxidases,SQE)是苜蓿皂甙合成途径中的一种限速酶,与苜蓿皂甙的合成密切相关。通过对苜蓿鲨烯环氧酶(MsSQE1)基因的克隆及在苜蓿中过表达,探究鲨烯环氧酶对皂甙合成的作用机制。【方法】以模式植物蒺藜苜蓿鲨烯环氧酶基因序列设计引物,同源克隆苜蓿MsSQE1。对MsSQE1进行生物信息学分析;通过基因枪轰击技术,使MsSQE1在洋葱表皮瞬时表达,进行亚细胞定位。利用qRT-PCR方法分析该基因在根、茎、叶中的表达水平,以及在紫外辐射、ABA和GA3条件下的表达模式。在茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导下,分析MsSQE1的转录水平,及对苜蓿皂甙含量的影响。利用根癌农杆菌转化体系,获得过表达MsSQE1的阳性转基因植株,并测定转基因植株的皂甙含量。【结果】克隆了MsSQE1的cDNA序列,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸,等电点为8.59。同源性比对分析,其氨基酸序列与蒺藜苜蓿中SQE1氨基酸序列同源性为98.6%,与拟南芥的同源性为80%。亚细胞定位显示,MsSQE1可能定位于细胞膜。组织特异性表达分析显示,MsSQE1在叶中的表达量最高,茎中次之,根中的表达量最低。在紫外辐射、ABA和GA3的诱导表达显示,紫外辐射诱导24 h,叶中表达量最高;GA3(50μmol·L^-1)和ABA(100μmol·L^-1)处理,均为8 h叶中表达量最高;MeJA处理能诱导MsSQE1表达量上调的同时苜蓿总皂甙含量也随着MsSQE1表达的上调而增加。分析过表达MsSQE1转基因苜蓿和转空载体苜蓿株系发现,MsSQE1的表达水平和总皂甙含量均升高,其中MsSQE1的表达水平是对照的3.11-9.45倍,总皂甙含量比对照提高14.26%-28.05%,暗示MsSQE1是苜蓿皂甙合成途径中的一种关键调节酶。【结论】从豆科牧草紫花苜蓿中克隆了MsSQE1并进行功能分析。在苜蓿中过表达MsSQE1能增加苜蓿总皂甙含量,暗示MsSQE1的表达影响苜蓿皂甙的生物合成,可能对皂甙的合成有重要的调节作用。

RAPD技术分析不同抗旱性苜蓿品种DNA的多态性

分别从不同抗旱性的紫花苜蓿品种中挑选抗旱性强的、抗旱性中等的和抗旱性弱的品种各三个,提取叶片基因组DNA,相同抗旱性苜蓿品种DNA等量混合构建三个池DNA。采用RAPD技术分析不同抗旱性混合DNA的多态性,并筛选出标记多态性的引物。结果表明:13组260个随机引物经五轮筛选,得到48个引物对不同抗旱性苜蓿品种池DNA扩增结果产生多态性,多态性引物占18.5%。其中5个引物能够稳定标记池DNA多态性,且特异性明显。表明不同抗旱性苜蓿品种之间具有明显的遗传多样性。

植物抗虫转基因工程研究进展

较系统地介绍了植物抗虫基因的来源及遗传转化方法,提出了抗虫基因工程潜在的问题及解决途径,并对抗虫转基因植物的前景作了展望。

利用双向电泳技术分离野牛草叶片蛋白的方法研究

制备野牛草叶片蛋白质样品,对双向电泳条件等技术环节进行优化,以期获得高分辨率、重复性好的蛋白质双向电泳图谱,建立适应野牛草叶片蛋白组学研究的技术平台,并对其蛋白组进行初步分析。采用TCA/acetone沉淀法和Trizol沉淀法分别提取野牛草叶片蛋白,通过不同聚焦时间分离,最终经硝酸银染色,以Imagemaster 2D Platinum V 5.0图像分析软件对所得的双向电泳图谱进行分析比较。对获得的最佳图谱进行蛋白点分布分析,选择最适合的胶条pH值。结果表明：Trizol沉淀法提取蛋白样品,总聚焦伏时数在8-10万V.h间,为最适合条件,获得图谱背景清晰,纵横纹少,蛋白点分离较完全,在pH3-10胶条凝胶可检测到的蛋白质点达到800个。对蛋白点pH分布范围分析表明,85%蛋白点分布在pH4-7之间,选择pH4-7的IPG胶条,能检测到1 000个以上的蛋白点。以Trizol沉淀法结合优化的双向电泳参数对野牛草叶蛋白组进行双向电泳分离,获得了高分辨率、高重复性的双向凝胶电泳图谱,可用于野牛草差异蛋白质组学研究。

SSH与cDNA芯片技术的联合及其在植物基因差异表达研究中的应用

抑制消减杂交技术(SSH)与cDNA芯片技术是新近发展起来的研究差异表达基因的两种非常有效的方法。近年来,将SSH和cDNA芯片技术结合使用,为分析组织细胞的已知基因表达差异提供了新的手段,也为克隆和鉴定新基因开辟了新的道路,是目前寻找差异表达基因的适用方法。鉴于此,对SSH和cDNA芯片技术的基本原理、两种方法结合使用的操作流程、克隆差异表达新基因的特点,以及在植物基因差异表达方面的应用进行了概述。

半胱氨酸蛋白酶基因表达载体的构建及转基因苜蓿的初步研究

【目的】为培育高抗逆的作物品种提供科学依据。【方法】以耐盐苜蓿"中苜1号"为外植体,采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘法转化苜蓿。【结果】成功构建了含有半胱氨酸蛋白酶基因MsCP1和报告基因GUS的植物表达载体pCAMBLA1391-CP-GUS,共获得47株抗性再生植株。经PCR和RT-PCR检测,表明外源基因已成功整合到苜蓿基因组中,并在转录水平得到表达。【结论】初步获得了高抗逆的转基因苜蓿新品系。

影响苜蓿产草量相关因素研究进展

综述了影响苜蓿产草量的相关性状株高、分枝数、生长速度和再生性能与产量的相关性,并对影响苜蓿产草量的秋眠性进行了解析,分析了接种根瘤菌、施肥和刈割措施对苜蓿产草量提高的重要作用。

紫花苜蓿盐诱导HD-Zip类转录因子MsHB2的克隆及功能分析

【目的】在已有的一条紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhongmu-1)盐诱导未知基因的EST序列基础上,克隆其(MsHB2)全长序列并分析其功能,以进一步了解其在紫花苜蓿中的耐盐调控机理。【方法】以先前获得的EST序列为基础设计引物,使用RACE法从紫花苜蓿中克隆得到MsHB2的3′和5′末端序列,经DNAMAN软件拼接后得到其全长序列。使用多种生物信息学软件对MsHB2的开放阅读框,编码蛋白等电点、分子量、疏水性、亚细胞定位、进化关系等进行预测分析。构建MsHB2的亚细胞定位瞬时表达载体,使用基因枪转化法将MsHB2与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并观察其亚细胞定位荧光信号。将生长30 d的中苜一号分别进行300 mmol·L-1NaCl和0.1 mmol·L-1 ABA胁迫处理,取胁迫处理0、2、4、10、24 h后的根和茎叶组织提取总RNA并进行荧光定量PCR分析。构建了MsHB2的植物超表达载体,转化农杆菌GV3101菌株,使用农杆菌花序侵染法转化拟南芥并在盐胁迫条件下对转基因株系进行相关表型分析。【结果】将RACE法克隆得到MsHB2的3′和5′末端序列拼接后得到1 126 bp的全长序列,序列分析表明,其编码蛋白包含247个氨基酸,具有一个同源异型结构域和一个亮氨酸拉链结构域,与拟南芥HD-Zip第I类转录因子ATHB12具有较高相似性。进化树聚类分析表明MsHB2属于第Ⅰ类同源异型域亮氨酸拉链蛋白。洋葱亚细胞定位分析表明MsHB2定位于细胞核。转录水平表达分析表明MsHB2受300mmol·L-1 NaCl和0.1 mmol·L-1 ABA胁迫诱导而表达量显著升高。转基因研究表明在NaCl和ABA胁迫下,过量表达MsHB2的转基因拟南芥表现比野生型拟南芥更敏感。【结论】从紫花苜蓿中克隆得到一个定位于细胞核的同源异型域亮氨酸拉链蛋白基因MsHB2,其在紫花苜蓿中受NaCl和ABA胁迫诱导,并在NaCl和ABA胁迫条件下抑制转基因拟南芥的生长。推测MsHB2可能通过ABA信号途径参与紫花苜蓿盐胁迫应激调控,并在盐胁迫等非生物胁迫下对紫花苜蓿的抗逆性起负调控作用。

黄淮海地区紫花苜蓿氮磷钾肥料效应与推荐施肥量研究

为高产优质苜蓿草地施肥提供科学依据,2016-2017年选择黄淮海地区苜蓿生产的典型区域沧州为试验点,以该地区当家苜蓿品种中苜3号(Medicago sativa L.‘zhongmu No.3’)为试验材料,采用"3414"二次回归最优设计试验方案,研究N,P,K肥配施对紫花苜蓿当年干草产量和营养成分的影响。结果表明,影响中苜3号苜蓿干草产量高低顺序为磷肥>钾肥>氮肥。处理3(N_1P_2K_2)即施N 5.00kg·hm^(-2),施P_2O_5 60.00kg·hm^(-2),施K_2O 180.00kg·hm^(-2)时获得最高产量23 657.9kg·hm^(-2)。14个处理组合中,处理7(N_2P_3K_2)粗蛋白含量最高,为22.45%,处理6(N_2P_2K_2)粗蛋白含量最低,为16.87%。酸性洗涤纤维含量最低的处理3(N_1P_2K_2),为34.14%,中性洗涤纤维的含量最低的处理7(N_2P_3K_2),为51.27%。处理7(N_2P_3K_2)相对饲用价值最高,为111.36。综合分析,处理7(N_2P_3K_2)的初花期营养价值较高。根据产量模型分析,中苜3号苜蓿施N 4.10kg·hm^(-2),施P_2O_5 48.47kg·hm^(-2),施K_2O 270.00kg·hm^(-2)时可获得最高产量23 918.2kg·hm^(-2)。

苜蓿镰刀菌根腐病病原菌的分离鉴定与致病性分析

为了解河北廊坊、内蒙古临河和山西阳高县紫花苜蓿根腐病的病原,于2013年采集疑似感染镰刀菌根腐病的苜蓿病株,在PSA和MGA等培养基上分离纯化后观察菌落、菌丝和大小孢子等形态特征。在形态学观察的基础上,筛选各地具有代表性的菌株,克隆其rDNA-ITS和TEF-1α序列。通过形态学观察和分子生物技术相结合,对分离出的代表性菌株进行快速鉴定,并通过回接试验确定其致病性。共分离6个菌株,分别命名为C1、C2、C3、C4、C5和L1。根据形态和分子共同鉴定:C1和C2为三线镰刀菌(Fusarium tricinctum),C3、C4和C5为腐皮镰刀菌(F.solani),L1为层出镰刀菌(F.proliferatum)。L1和C4菌株的致病性较强,发病率均大于80%,病害严重指数分别为61.35%和59.26%。C2株系致病性最弱(DI 54.44%,DSI 29.63%)。C1、C3和C5菌株的发病率和致病性均无显著差异,发病率分别为66.66%,62.22%和65.55%;病害严重指数分别为42.59%,40.37%和38.89%。

河北地区22个紫花苜蓿品种的生产性能比较研究

2013-2016年通过田间试验,在中国农业大学涿州教学实验场对22个紫花苜蓿品种的产量性能进行比较分析,以期筛选出适宜河北地区种植的苜蓿品种。结果表明,不同年份的苜蓿年干草产量具有极显著差异(P<0.01);建植当年各苜蓿品种平均年产量最低,随着生长年限的延长,产量总体呈增加趋势;‘中苜5号’的4年总干草产量最高,‘SR4030’等6个品种的总产量低于对照品种‘中苜1号’,但与对照差异不显著;第1茬产量最高,随着茬次的增加产量呈下降趋势,第1茬与年产量之间的关联度最高;秋眠性3~6级的品种丰产性和产量稳定性综合评价较高。综合4年试验结果,‘中苜5号’、‘中苜1号’、‘SR4030’、‘巨能551’、‘BR4010’、‘MF4020’、‘SK3010’和‘WL363HQ’产草量高,具有潜在的推广价值,适宜在河北地区大面积推广应用。

播种量和行距配置对盐碱地紫花苜蓿草产量及品质的影响

在山东省东营市农业科学研究院试验基地,以黄淮海当家紫花苜蓿品种中苜3号为试验材料,采用随机区组设计,设播种量(7.5, 15.0, 22.5 kg·hm^(-2))和行距(15, 30, 40 cm)两个因素,研究了盐碱地条件下不同播种量和行距对紫花苜蓿干草产量和品质的影响,旨在为苜蓿生产确定最佳播种量和行距配置,为发展盐碱地苜蓿产业提供科学依据。结果表明,1)播种量对3年总产量无显著性影响(P>0.05),但对播种当年产量有极显著影响(P<0.01),播种量22.5 kg·hm^(-2)的3年总产量最高,产量随播种量增加呈不断提高的趋势;行距对3年总产量有极显著性影响(P<0.01),行距15 cm的3年总产量最高,随着行距的增加产量呈减小趋势;行距对播种当年的产量影响较大,随着生长时间的延长,行距对产量的影响逐渐减小;播种量为22.5 kg·hm^(-2)、行距为15 cm组合的3年总产量最高。2)播种量和行距对每m^2枝条数和枝条重有显著性影响(P<0.05),随着播种量的增加和行距的减小,每m^2枝条数呈增加的趋势,枝条重则呈减小趋势。产量与每m^2枝条数始终呈正相关关系,与枝条重呈负相关关系,均达到极显著水平(P<0.01)。3)随着播种量的增加和行距的减小,粗蛋白(crude protein,CP)含量和相对饲喂价值(relative feed value,RFV)有上升的趋势,中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber,ADF)含量有下降趋势;播种量为22.5 kg·hm^(-2)、行距为15 cm时营养价值最高。4)从高产和品质综合考虑,在播种量22.5 kg·hm^(-2)和行距15 cm配置情况下,有利于提高苜蓿的产量和品质。综上,在山东以及黄淮海盐碱地区以种植耐盐碱苜蓿品种为宜,不同播种量和行距对产量的影响有随生长期的延长而减少的趋势,在适宜播种量和行距配置条件下,有利于提高苜蓿的产量和品质。