用阴离子交换色谱法制备寡聚核苷酸

建立了用Source 15Q强阴离子交换柱分离纯化寡聚核苷酸的方法.在pH 9.0,以20 mmol/L Tris-HCl缓冲液+2.0 mol/L NaCl为流动相,线性浓度梯度洗脱,紫外检测波长为260 nm,流速为1 mL/min的分离条件下,能很好地分离18-78 mer的合成寡聚脱氧核苷酸和PCR的单双链产物,探讨了流速和盐浓度对分离的影响,并测得24mer OligoDNA的回收率为90%左右.该方法简便、快捷、分辨率高,可用于寡聚核苷酸、反义核酸药物的分离、纯化、鉴定和制备.

一种PCR快速鉴定重组体DNA阳性克隆及插入方向的方法

当外源DNA以非定向的方式插入克隆载体时,需用测序或酶切的方法确定插入方向,上述两种方法或昂贵或费力。描述了一种快速、简便的PCR法,即利用载体的通用引物和目的片段的两个特异性引物直接扩增重组菌落,从而达到鉴别DNA插入方向的目的。

肺癌血清肿瘤标志物及其检测方法研究进展

肺癌是当前全世界发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤之一,严重威胁人类的身体健康及生命。肺癌血清肿瘤标志物的检测,对于肺癌的早期诊断、病理分型、临床分期、预后判断以及疗效评估等方面有重要的应用价值。本文综述了近年国内外临床应用的肺癌血清肿瘤标志物及相应的检测方法。

小片段DNA阳性重组子的快速筛选

PCR扩增的小片段DNA用T载体连接,转化受体菌后观察不到典型的蓝/白斑。用插入片段的特异性引物对菌落进行PCR来筛选阳性重组子,测序鉴定结果吻合率达100％,说明当利用颜色特性挑选阳性克隆成为困难时,菌落PCR技术是一种简便、快速、可靠的筛选方法。

干细胞、肿瘤干细胞和肿瘤关系的探究

近年来,恶性肿瘤的发病率已上升到疾病谱的第二位,成为严重威胁人类生命和健康的疾病。其主要特征是肿瘤细胞的恶性生长、转移及复发,病因和发病机制尚不清楚。最近研究认为,肿瘤中存在一小群具有自我更新和分化潜能的细胞即肿瘤干细胞,可能是肿瘤转移和复发的根源。正常干细胞和肿瘤干细胞均具有自我更新和多向分化的潜能,有相类似的标记物,一定条件下可以互相转化。间质干细胞(MSC)作为间质细胞的来源,与肿瘤的关系尤为密切。本文主要就干细胞尤其是间质干细胞,肿瘤干细胞和肿瘤的发生,发展作一综述。

论干细胞异常分化进化形成肿瘤

随着肿瘤干细胞的发现,需要进一步探索肿瘤干细胞和成体组织干细胞的关系以及肿瘤的形成机制,这对肿瘤的诊断、预防和治疗具有重要意义。在骨髓间充质干细胞异常分化进化形成异质细胞簇的基础实验上,得出肿瘤是组织中成体干细胞异常分化进化形成的(简称干细胞成瘤论),并将干细胞成瘤论与基因突变成瘤论在肿瘤标志特征以及产生机制上进行比较分析,初步论证了干细胞成瘤理论能更真实地表达肿瘤发生发展的过程。通过正确认识肿瘤的发病机制,从而完善肿瘤的诊断、预防和治疗方法。

探索肿瘤干细胞起源的进程

近年来,在肿瘤的瘤体研究中发现了与干细胞具有相似的生物学特性和传导调控途径及机制等的一类细胞群体,科学家们命名这种存在于肿瘤细胞群体中的特殊细胞为肿瘤干细胞(cancer stem cell),又称为肿瘤启始细胞(tumor initiating cell,T-Ic),并对其起源进行了一系列的探索试验,本文就其探索过程作一综述。

抗体新时代——核酸多功能配基

抗体在人类疾病诊断和治疗等方面做出了巨大的贡献,但筛选周期长,成本高,分子量较大,在应用中受到一定的局限.tRNA为研制一种多功能核酸配基分子提供了重要的启发和佐证.SELEX技术筛选的核酸配基具有筛选周期短、特异性强、分子量小等优点;利用核酸配基研制的核酸多功能配基,与传统的抗体相比,具有不同功能配基组装方便、搭配灵活、功能多样、实用性强等优势,预计在生物医学领域具有广泛的应用前景.

甲状腺癌NIS和TSHR表达的矛盾性及非相关性

目的研究钠/碘转运蛋白(sodium/iodide symporter,NIS)和促甲状腺激素受体(thyroid stim-ulating hormone receptor,TSHR)在甲状腺癌中的表达和相关性。方法收集正常甲状腺组织18例、甲状腺癌23例,通过荧光定量分析和免疫组织化学SP法对NIS和TSHR的表达进行研究。结果甲状腺癌NIS和TSHR mRNA的表达显著低于正常甲状腺组织(P<0.005),正常甲状腺组织NIS和TSHR的表达呈显著正相关(r=0.667,P=0.000),而在甲状腺癌中无相关性(r=0.222,P=0.376)。免疫组织化学结果表明甲状腺癌NIS阳性产物主要定位于细胞质,TSHR阳性产物定位于细胞质和细胞膜,甲状腺癌NIS及TSHR蛋白阳性表达率显著高于正常组(P<0.05);甲状腺癌NIS mRNA表达下降同时伴有细胞质NIS蛋白表达升高的有17例(74%)。结论甲状腺癌NIS和TSHR表达具有非相关性以及在转录和翻译水平上具有矛盾性,NIS蛋白非功能定位于细胞质,因而不能发挥正常的运输及聚碘功能,我们推测这可能是造成甲状腺癌患者放射性碘治疗失败的重要原因。

环氧基化磁性微球的制备及表征

采用反相聚合包埋技术制备以Fe3O4为磁核,琼脂糖为壳层的琼脂糖磁性微球,用环氧氯丙烷对其进行表面化学修饰后制得环氧基化磁性微球.通过傅里叶变换红外光谱、热重分析和振动样品磁力测定等表征其结构和性质,采用酶联免疫吸附试验检测其对乙肝表面抗原的固定能力.结果表明,环氧基化磁性微球平均粒径为30.3μm,环氧基含量为140.19μmol·g-1,磁含量为50.53%,饱和磁化强度为11.25emu·g-1,对乙肝表面抗原的固定能力明显高于琼脂糖磁性微球,具有良好的单分散性、超顺磁性和生物兼容性,可作为筛选乙肝表面抗原特异性核酸适配体的载体.

琼脂磁珠消减SELEX技术筛选HIV P24抗原适配体

建立以羧基化琼脂磁珠为筛选介质,快速筛选高特异性、高亲和力的HIV P24抗原适配体的方法.利用消减SELEX技术及靶标替换的方法,以HIV P24抗原作为靶分子,羧基化琼脂磁珠为载体,进行6轮筛选,筛选到3条特异性核酸适配体.特异性检测表明,筛选得到的HIV P24抗原适配体与HIV P24抗原的结合解离常数均在纳摩尔级水平.该方法为HIV早期检测提供了新的检测技术,对适配体与靶分子相互作用机理的研究具有重要价值.

靶标替换消减SELEX技术筛选小鼠IgG Fc片段的DNA配基及其活性鉴定

建立高特异性和亲和力的小鼠IgGFc片段DNA配基筛选方法.采用几种小鼠IgG亚类(鼠抗HBV-IgG、小鼠IgG的Fc,IgG1,IgG2a)作为靶分子,利用靶标替换消减SELEX筛选方法进行16轮筛选.利用dot-blot,高压液相色谱以及凝胶阻滞(EMSA)方法对所得配基进行活性鉴定.经过16轮筛选,得到了与小鼠IgG不同亚类相同Fc片段特异性结合的寡核苷酸配基(IgG的Fc配基).特异性分析显示,此配基只与小鼠IgG特异性结合,与胰蛋白酶、小牛血清白蛋白、人血清均无明显结合.高压液相色谱和凝胶阻滞结果均说明了配基和靶蛋白具有特异结合.通过使用靶标替换消减SELEX技术可以有效得到小鼠IgG不同亚型相同部分Fc片段的特异性结合配基,为不同分子相同部位的分子作用机制,以及应用于小鼠抗体亲和层析的研究奠定基础.

胃癌血清适配体的筛选及其鉴定

目的 :以羧基化琼脂磁珠为筛选介质,利用RT-PCR和靶标替换消减SELEX技术从胃癌血清中筛选得到高特异性、强亲和力的适配体。方法:以离心超滤(50 000超滤管)法处理后的胃癌血清作为靶分子,羧基化琼脂磁珠为载体,先将寡核苷酸文库与反筛磁珠(结合正常血清)结合,取上清再与筛选磁珠(结合胃癌血清)结合,洗去未结合的寡核苷酸分子,对结合在磁珠上的寡核苷酸分子进行分离和扩增,λ酶切法制备ss DNA次级库,进行10轮筛选,将第10轮的文库扩增得到ds DNA,利用胶回收试剂盒回收纯化目的片段的ds DNA,并与p MDTM18-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆,测序获得适配体序列,同时用流式细胞术测定胃癌血清适配体的Kd值。结果:经过10轮筛选后,得到20条与胃癌血清结合的适配体。结论:特异性检测表明,筛选得到的胃癌血清适配体与胃癌血清的结合解离常数均在纳摩尔级水平,其中5、7、16、17、18号适配体能高特异性、强亲和力结合胃癌血清,与正常人血清不结合。该研究为胃癌的早期诊断提供了实验基础。

癌胚抗原特异性单克隆抗体(Anti-CEA)核酸适配体的筛选

目的 :筛选癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)特异性单克隆抗体(Anti-CEA)的核酸适配体(aptamers),为肺癌血清肿瘤标志物核酸适配体的筛选奠定实验基础。方法:利用羧基化琼脂磁珠作为筛选介质,以Anti-CEA为筛选的目标靶分子,通过消减SELEX技术及实时定量PCR技术,从随机ss DNA文库中筛选出与Anti-CEA特异性结合的aptamers,并通过凝胶阻滞实验(EMSA)鉴定筛选到的Anti-CEA-aptamer复合物,然后将得到的第10轮富集文库扩增为双链DNA,通过切胶纯化后,连接PMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,同时利用交错PCR技术鉴定阳性克隆,经测序,获得aptamers的序列。结果:经过10轮筛选得到了4条与Anti-CEA结合的aptamers,测序结果显示均为不同序列。结论:验证筛选出的与Anti-CEA结合的aptamer,特异性检测结果表明2号aptamer与靶分子结合的特异性很高,且与非特异蛋白无明显吸附,筛选出的aptamers用于识别Anti-CEA,将为肺癌的早期诊断和早期治疗提供新的突破口。

应用双向热循环消减SELEX技术筛选肺癌血清核酸适配体

肺癌是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤。现阶段,用于肺癌早期诊断的血清肿瘤标志物因其特异性与敏感性均较低,严重影响肺癌的临床诊断和治疗。本文用双向热循环消减指数富集的配基进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术,筛选肺癌和非癌血清标志物的核酸适配体,建立肺癌的检测方法,提高诊断和治疗效率。实验用环氧基琼脂磁珠为筛选介质,以非癌混合血清、肺癌混合血清作为双向靶标。应用热循环消减SELEX技术,经19轮筛选分别获得非癌和肺癌血清的特异性核酸适配体。通过高通量测序,得到40条非癌核酸适配体序列和41条肺癌核酸适配体序列。从肺癌与非癌血清特异性核酸适配体序列中分别挑选出高丰度的4条序列,合成后制成检测试剂,经临床血清验证,阳性率为90%。该检测方法检测灵敏度高,为肺癌的早期诊断和治疗提供了新的分子识别元件。

HIV-P24核酸适配体的筛选

目的利用SELEX技术筛选HIV-P24的核酸适配体,为艾滋病的诊断和治疗奠定基础。方法以重组P24为筛选靶,用SELEX技术从随机寡核苷酸库中筛选与HIV-P24结合的寡核苷酸,利用凝胶阻滞实验鉴定第12轮筛选到的寡核苷酸与HIV-P24的结合,再用Dot-blot法筛选出与HIV-P24结合的核酸适配体,并检测核酸适配体识别HIV-P24的特异性。结果 Dot-blot筛选到5条与HIV-P24有较强结合能力的核酸适配体,且均为不同的序列。特异性检测显示,18和26号配体只与HIV-P24特异性结合,而与人血清白蛋白、牛血清白蛋白和脱脂奶粉均无明显结合。结论成功筛选到2条特异结合HIV-P24的核酸适配体,为其应用于艾滋病诊断和治疗提供了实验基础。

大豆过氧化物酶基因随机突变文库的构建

为提高大豆过氧化物酶(soybean peroxidase,SBP)的活性及研究该酶一级结构与酶活性间的关系,采用连续易错PCR方法对大豆过氧化物酶基因(sbp)进行了2轮随机突变,将第二轮易错PCR产物与质粒载体pPICZα-A分别进行双酶切,经T4DNA连接酶催化连接后,CaCl2法转化重组质粒pPICZα-A-sbp至大肠杆菌DH5α中,成功构建出sbp随机突变文库,库容量约为1.77×106 cfu。

炎症相关因子基因多态性与弥漫大B细胞淋巴瘤的易感性研究

目的:探讨甘肃汉族人群中炎症相关因子基因多态性与弥漫大B淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)发病率的相关性。方法:运用高分辨率溶解曲线(high-resolution melting,HRM)方法检测炎症因子基因多态性。结果:IL-1RA的rs4251961位点CC纯合子基因型携带者与患DLBCL风险有关(以TT为参照,CC基因型的OR为0.83,95%CI=0.697-0.997,P<0.05),但与T等位基因相比,C等位基因与DLBCL风险升高显著相关(OR=8.83,95%CI=1.909-40.813,P<0.01)。结论:IL-1RA的rs4251961位点的次等位基因C与DLBCL的易患性显著相关。