PEDV、TGEV与PDCoV S蛋白表位基因三联疫苗的构建及其鉴定

[目的]构建一种同时预防猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的三联表位疫苗,以预防上述病原导致的猪的相关疾病。[方法]本研究运用免疫信息学在线软件对3种猪肠道冠状病毒(SeCoVs)的S蛋白B、T细胞表位进行预测分析,构建新的表位肽段,命名为PPT,通过ExPASy、VaxiJen、TMHMM、SOPMA、SOLpro和AlphaFlod2等在线软件对PPT进行生物信息学分析,并利用C-IMMSIM在线软件对其免疫反应进行模拟。通过T2A将PPT与PEDV的COE序列、TGEV的SAD序列及PDCoV的CTD序列连接并构建至真核表达载体pEGFP-N1,经PCR和双酶切鉴定正确后,将获得的重组质粒转染HEK293A细胞,经DAPI染色、CCK8、RT-PCR及Western blotting试验验证重组质粒在体外表达情况。[结果]构建的表位蛋白PPT由17条表位肽段组成,经生物信息学软件分析,该蛋白为非跨膜蛋白,结构稳定,具有抗原性和可溶性,亲水性高,无过敏性。C-IMMSIM结果显示,PPT能引起机体树突状细胞(DC)增加,B、T细胞免疫反应,刺激免疫球蛋白IgG、IgM和细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)水平升高。重组质粒经PCR和双酶切鉴定结果显示,分别在3359、2375、1064、944、764和467 bp出现特异性目的条带,与预期相符;重组质粒转染HEK293A细胞后,可见绿色荧光;RT-PCR扩增分别在3359、2375、1064、944、764和467 bp处获得与目的基因大小相符的条带;CCK-8检测结果表明,重组质粒对细胞均无明显毒性作用;Western blotting检测结果显示,分别在31.7、16.1、37.9和27.5 ku处出现与目的蛋白分子质量大小一致的条带,重组质粒成功在HEK293A细胞中表达。[结论]本研究基于计算机软件分析设计的PPT表位蛋白成功构建三联疫苗,且在体外表达,为评价PEDV-TGEV-PDCoV三联表位疫苗的免疫效果提供依据。

牛布氏杆菌病和分枝杆菌病二联表位疫苗的构建及其免疫效果评价

为研发一种更安全、有效的防控牛布氏杆菌病和分枝杆菌病的疫苗,运用在线软件ABCPerd和IEBD对牛布氏杆菌外膜蛋白(Omp25)和牛分枝杆菌抗原85A(Ag85A)的B、T细胞表位进行预测分析,设计新的表位基因肽段NewⅠ和NewⅡ,并通过SOPMA和VaxiJen在线软件对NewⅠ和NewⅡ的二级结构与抗原性进行分析。将NewⅠ、Omp25、NewⅡ和Ag85A基因序列依次用自剪切肽T2A、P2A、E2A进行连接,获得串联基因并命名为COE,将COE基因构建至真核表达载体GV658,获得重组质粒GV658-COE;将上述重组质粒转染至HEK293细胞,利用细胞计数(CCK-8)试验评估GV658-COE对细胞的安全性,通过免疫印迹分析目的蛋白的表达情况;将重组质粒以400μg/只的剂量免疫大鼠,检测在第3次免疫后的血清抗体及大鼠脾淋巴细胞中的T细胞亚群占比情况。结果显示:NewⅠ和NewⅡ序列二级结构较稳定,抗原性良好;重组质粒经PCR扩增获得3231 bp大小的目的条带,与预计相符;重组质粒对HEK293细胞无毒性作用;重组质粒在HEK393细胞中可表达出目的蛋白,分别在22.3、17.3、23.9和35.6 kDa处有目的蛋白NewⅠ、Omp25、NewⅡ和Ag85A的表达。三免后,重组质粒免疫大鼠产生的IgG水平均高于空载质粒组和PBS组;与PBS组相比,重组质粒免疫大鼠脾脏中CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞百分比均升高。研究表明,重组质粒GV658-COE能有效激发大鼠的体液免疫和细胞免疫反应,可成为预防牛布氏杆菌病和分枝杆菌病的候选疫苗。

2型猪链球菌天津分离株的鉴定及其遗传特征分析

为了解天津市某猪场引起育肥猪神经症状的病原及其特性和遗传特征,本研究采集8份患病猪脑组织样品经细菌分离、形态学观察、gdh基因和cps2J基因的PCR扩增及序列分析,确定8份样品中的分离株均为同一2型猪链球菌(SS2),命名为TJS75。测定其生长曲线、并按照文献方法进行溶血性试验、黏附/侵入试验和对小鼠的致病性试验,分析该SS2分离株特性。结果显示,TJS75菌株经TSB培养6 h~15 h可达对数生长期,对绵羊血红细胞(RBC)具有崩解效果,可黏附并侵入PK-15细胞(黏附率和侵袭率分别为5.16%和7.90%),且感染TJS75株的BALB/c小鼠出现不同程度的行动迟缓、呼吸急促、精神萎靡和神经症状等,经测定其LD50为2.15×107cfu/mL。进一步采用高通量测序,并预测其毒力基因,分析该菌株的遗传特征,结果显示,TJS75菌株基因组全长2368195 bp,GC含量40.88%,含有2299个编码基因,其中有1822、1830和1077个基因分别注释于GO、COG和KEGG数据库,携带的16S r RNA基因序列与国内分离的SS强毒株98HAH33和05ZYH33的亲缘性较近,毒力基因的预测结果显示该菌株携带499种毒力相关基因(编码173种毒力相关因子),依据功能分类,这些毒力基因参与SS2的黏附和侵袭、溶血、促进铁转运、自溶酶的合成、降解胶原酶、唾液酸的合成等。本研究首次分离到携带MRP毒力因子的ST25型SS2,为深入开展SS2 TJS75株的致病机制研究提供了科学依据。

基于能量的振冲碎石桩加密效果评价方法

采用常规检测手段进行处理地基的工后质检存在时间滞后与空间局部的问题,不能及时反映处理地基的整体加固效果。提出了一种基于能量的碎石桩复合地基桩周土振动加密效果评价方法,为实现桩周土加密效果的准实时评价提供参考。首先,根据地基弹性波传播理论建立振冲施工过程中桩周土吸收波动能量的计算方法,通过不排水动三轴试验建立典型饱和粉砂土基于吸收能量的超静孔压模型,为进一步根据固结理论预测处理后复合地基桩周土密实度提供依据;其次,依托某工程水电站深厚坝基碎石桩处理工程实例,采用桩周土超静孔压峰值和处理后孔隙比两个关键物理量对方法进行了检验,发现与施工现场实测超静孔压和工后质检得到的孔隙比相比,方法的预测精度达到90%左右,说明基于能量的振冲碎石桩加密效果评价方法具有可行性。

鸡传染性支气管炎和禽衣原体病的多表位DNA疫苗构建及其免疫原性研究

试验旨在设计和构建基于鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1蛋白和鹦鹉热衣原体(Cps)主要外膜蛋白(MOMP)的抗原多表位DNA疫苗,并分析其免疫原性。研究利用免疫信息学方法筛选出IBV S1蛋白和Cps MOMP蛋白的优势抗原表位,设计多表位基因M,并利用多种生物信息学软件对其进行预测分析;将M基因、S1和MOMP串联基因分别连接至真核表达载体pEGFP-N1并转染至DF-1细胞,利用Western blot检测目标蛋白的表达情况。将上述重组质粒肌内注射7日龄雏鸡,四免后检测免疫鸡血清中特异性抗体IgG、细胞因子及T淋巴细胞含量。结果显示:构建的表位蛋白结构稳定、免疫原性较好且无副作用;重组质粒pEGFP-M和pEGFP-S1-MOMP与预期大小相符;与pEGFP-N1组和PBS组相比,四免后,pEGFP-M免疫组鸡血清中抗IBV IgG和抗Cps IgG抗体水平极显著升高(P<0.01),与pEGFP-S1-MOMP组相当;pEGFP-M组鸡血清中细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)水平,T淋巴细胞抗原CD3+、CD4+和CD8+含量均极显著高于pEGFP-N1组和PBS组(P<0.01)。结果表明,构建的多表位DNA疫苗pEGFP-M能够激发鸡的体液免疫和细胞免疫反应,为研制同时预防鸡传染性支气管炎和禽衣原体病的多表位疫苗奠定基础。

支撑物对预折纹吸能构件力学特性研究

随着煤矿开采深度的增加对液压支护设备抗压能力提出更高的要求,为了提高矿用支护设备的力学性能及减缓冲击地压对其造成的破坏影响,本文通过对现有预折纹吸能构件内部布置不同支撑物对其力学性能及吸能效果进行了研究分析,采用理论计算与数值模拟相结合的方法加以验证。最终,结果表明吸能构件增加支撑物后降低了载荷波动增强了吸能性能,提高了支护设备的抗冲击能力。

大豆GmZAT10基因克隆与表达分析

非生物胁迫对植物的生长和发育具有严重的影响.研究发现植物中存在NAC、bZIP、WRKY、AP2/ERF、MYC、bHLH、C2H2等一系列可以调控非生物胁迫的转录因子.为了揭示GmZAT10基因的功能,从大豆中克隆出GmZAT10基因,并对该基因进行载体构建、生物信息学分析、亚细胞定位和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)等研究.结果表明,GmZAT10全长702bp,共编码233个氨基酸,分子量为59.14kDa,等电点为4.85;亚细胞定位结果显示GmZAT10定位于细胞核和细胞膜中;通过同源蛋白序列对比显示,GmZAT10蛋白具有两个C2H2锌指结构域,含有植物所特有的QALGGH和C2H2保守序列.通过qRT-PCR技术检测大豆不同组织和不同处理条件下GmZAT10基因的表达情况可知,该基因在大豆根中表达量较高,并且受到高低温、NaCl和ABA诱导表达.结果表明GmZAT10在大豆非生物胁迫中发挥作用.

1株肺炎克雷伯菌噬菌体kp6的生物学特性及全基因组分析

【目的】探究从污水样品中分离到的1株肺炎克雷伯菌噬菌体的生物学特性及全基因组特征,为临床肺炎克雷伯菌感染的防控和开发噬菌体相关新型替抗产品提供基础。【方法】以肺炎克雷伯菌TJAU-K11为宿主菌,采用双层平板法从污水样品中分离纯化获得肺炎克雷伯菌噬菌体。通过透射电镜观察噬菌体形态,测定噬菌体宿主谱、最佳感染复数(MOI)、一步生长曲线,评估噬菌体稳定性,探究其对肺炎克雷伯菌TJAU-K11的生物被膜形成的影响以及裂解效果,同时进行全基因组测序,了解噬菌体的生物学特性及全基因组特征。【结果】从污水样品中成功分离获得3株肺炎克雷伯菌噬菌体,分别命名为kp4、kp5和kp6,透射电镜观察结果显示,噬菌体kp6是具有正二十面体形态的短尾噬菌体。一步生长曲线结果显示,噬菌体kp6的潜伏期为20 min,爆发期为30 min。该噬菌体在―20~50℃、pH 4.0~10.0和紫外照射12 min内噬菌体效价保持稳定。单一噬菌体的体外抑菌试验结果显示,不同MOI噬菌体kp6组的D 600 nm值在7 h内始终<0.4;噬菌体鸡尾酒制剂的体外抑菌试验结果显示,MOI为1、100时,噬菌体kp6在12 h内的D 600 nm值<0.1。不同MOI噬菌体kp6组宿主菌生物被膜形成量均极显著低于阳性对照组(P<0.01),单一噬菌体kp6与噬菌体鸡尾酒制剂均能裂解宿主菌生物被膜。全基因组测序表明噬菌体kp6基因组为双链环状DNA,全长40971 bp,GC含量为53.13%,49个编码序列中有23个编码已知功能的蛋白,其中包括短尾噬菌体吸附和注入作用的尾纤蛋白gp12、裂解功能蛋白内溶酶等。【结论】本研究分离获得的肺炎克雷伯菌裂解性噬菌体kp6,其基因组中存在1个内溶酶,以其制备的噬菌体鸡尾酒制剂在12 h内能完全抑制宿主菌生长,试验结果为后续裂解酶和噬菌体制剂的开发奠定基础。

猪链球菌靶向DC重组蛋白DC3pep-SDZ对斑马鱼的免疫保护性分析

为了探究本课题组前期构建的由猪链球菌(SS)的分泌型DNA核酸酶A(SsnA)、二氢硫辛酰胺脱氢酶(DLDH)和高亲和力锌摄取系统蛋白(ZnuA)3个毒力因子的优势细胞表位和树突状细胞靶向肽(DC3pep)串联而成的重组蛋白DC3pep-SDZ(SsnA-DLDH-ZnuA)对致病型SS攻击斑马鱼的免疫保护效果,本试验表达和纯化重组蛋白DC3pep-SDZ和SDZ,分别免疫AB系野生型斑马鱼,攻击致病型2、3和9型SS(SS2、SS3和SS9),计算存活率,采用苏木精-伊红(H.E.)染色法观察斑马鱼脑组织病理变化,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析SS3感染斑马鱼后脑组织炎性细胞因子表达量变化。结果显示,诱导表达的重组蛋白DC3pep-SDZ和SDZ分子质量分别为44和42 kDa,2个蛋白均以可溶的形式表达。SS2、SS3和SS9攻击斑马鱼后,重组蛋白DC3pep-SDZ组和重组蛋白SDZ组斑马鱼存活率分别为50.0%、65.0%和60.0%,45.0%、47.3%和45.0%,两组间差异不显著(P>0.05),但与PBS对照组相比差异均极其显著(P<0.001)。H.E.染色镜检结果显示,重组蛋白DC3pep-SDZ组的斑马鱼被3种分型SS攻击后脑组织均无明显病理变化。RT-qPCR结果显示,重组蛋白DC3pep-SDZ组促炎细胞因子:与PBS对照组相比较IL-6、TNF-α和IFN-γmRNA表达量分别极显著(P<0.01)、极其显著(P<0.001)和极显著(P<0.01)下调,与重组蛋白SDZ组相比较IL-6和TNF-αmRNA表达量分别极显著(P<0.01)和显著下调(P<0.05);重组蛋白DC3pep-SDZ组抗炎性细胞因子:与PBS对照组相比较IL-10和TGF-β1 mRNA表达量分别极显著(P<0.01)和极其显著(P<0.001)上调,与重组蛋白SDZ组相比较TGF-β1 mRNA表达量显著上调(P<0.05)。结果表明,重组蛋白DC3pep-SDZ较SDZ具有更好的免疫原性,能产生SS2、SS3和SS9交叉免疫保护作用,同时还能够有效缓解斑马鱼感染SS3后的脑部炎症。

地铁轴箱体铸件铸造工艺优化

地铁轴箱体是地铁车辆轴箱装配的重要零部件,随着车辆时速与承载量的不断提高,轴箱体铸件的产品质量要求也逐步提高。在铸造生产过程中铸件还存在着不同程度的铸造缺陷,铸造质量问题的产生与轴箱体的铸造工艺密切相关。对轴箱体铸造工艺进行分析,通过调整铸件浇冒口方案降低了铸造缺陷比例,最终废品率低至4%以下,提高了产品质量。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及药敏试验

为了给天津某规模猪场提供猪传染性胸膜肺炎(PCP)的科学防控和合理的用药方案,本试验对该猪场疑似患PCP的病猪进行临床综合诊断和病理组织学观察,无菌采集病料,通过细菌的分离与培养、镜检、生化试验、卫星试验、PCR检测、动物致病性试验及药敏试验等实验室方法对分离菌进行系统分析。结果发现,病猪呼吸困难,病理剖检和病理组织学观察可见有典型的纤维素性肺炎变化;显微镜下分离菌呈多形性的革兰氏阴性杆菌,且其生化试验、卫星试验结果与传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)特性一致;用APP APXⅣA毒素基因特异性引物扩增结果为阳性;该APP分离菌对小鼠具有致病性,且对头孢噻肟、氟苯尼考等药物高度敏感。根据实验室检测结果并结合临床综合诊断,最终判定该细菌分离株为猪传染性APP。

肉鸡禽呼肠孤病毒与巴氏杆菌混合感染的鉴别诊断

2014年11月河北某规模化鸡场一批4周龄左右的肉鸡发病死亡,临床表现为精神沉郁、呼吸困难、关节肿大、跛行等症状,为对此疫病进行确诊,通过病理组织学观察、细菌分离、PCR检测、药敏试验、动物致病性试验等实验室诊断方法进行系统分析。病理组织学观察结果显示肺脏出血,心脏、肝脏水肿,并伴有异嗜性粒细胞浸润;镜检可见两极深染的短杆菌;用多杀性巴氏杆菌KMT-1基因和禽呼肠孤病毒(ARV)σB基因特异性引物的扩增结果均为阳性;该巴氏杆菌分离菌可致死小鼠,且对头孢曲松、头孢哌酮等药物高度敏感。根据上述实验室检测结果并结合临床症状进行综合分析,最终确诊该病为ARV和巴氏杆菌混合感染。

鸡传染性支气管炎继发感染大肠杆菌病的鉴别诊断

2015年6月河北某规模肉鸡场发生疫情,病死鸡为2周龄雏鸡,临床表现为呼吸困难、咳嗽、喷嚏,排黄绿色稀便等症状。通过病理剖检、细菌分离鉴定、动物致病性试验、血清型鉴定、RT-PCR检测等实验室诊断方法对病原进行鉴别诊断。剖检濒死鸡可见"花斑肾",腺胃肿大,心包膜混浊,肝脏表面有大量纤维素性渗出物等;病理组织学观察结果显示肾脏、肝脏、心脏及肺脏等有大量炎性细胞浸润和红细胞渗出;镜检组织抹片和分离细菌可见革兰氏阴性短杆菌,生化试验结果与大肠杆菌特性一致,且血清型鉴定为O_(78);该分离株对雏鸡有致病性,且对呋喃唑酮、头孢曲松等药物高度敏感;用鸡传染性支气管炎病毒S1基因特异性引物的扩增结果为阳性。根据上述实验室检测结果并结合临床症状进行综合分析,最终确诊该发病鸡群为鸡传染性支气管炎继发大肠杆菌感染。

节能伺服油源控制系统

伺服油源控制系统采用PLC作为控制中心,主要通过伺服电机实现对系统压力的精确控制,并可连接其他液压设备,如静压主轴、伺服油缸等,可以调节压力控制系统输出的力值,也可以为静压主轴提供动力输出,同时采集油温、液位、压力,实现状态的实时监控。

我国商业银行投资银行业务发展问题分析

党的十九大报告强调要"贯彻新发展理念,建设现代化经济体系"需要科技创新、现代金融、人力资源协同发展。现代金融的发展重点在金融体系创新发展,这样才有利于服务实体经济。商业银行从事投资银行业务,可以提升资产的流动性、丰富业务和产品多样性。现在分析我国商业银行投资银行业务的现状、问题及差异基础上,提出完善我国商业银行投资银行业务应改善业务结构;提高风险管理水平;提升创新能力等几点对策和建议。

基于DEA方法对我国上市商业银行的效率分析

商业银行的效率问题一直备受人们的关注，银行作为金融体系中的主要组成部分，对其效率测度尤为重要。运用非参数的数据包络分析方法(DEA),以我国16家上市商业银行2007-2015年数据为研究样本，选取部分指标作为银行的投入和产出指标，对我国上市商业银行的经营效率从综合效率、纯技术效率和规模效率三个方面进行的比较分析表明，我国国有上市商业银行效率的提升空间较大，股份制上市商业银行效率评价得分参差不齐，城商行发展较好，其发展模式值得借鉴。

切实加强高校组织工作

干部队伍建设、党的基层组织建设和党员发展工作 ,是高校组织工作的重要内容。要以“三个代表”重要思想为指导 ,认真贯彻执行党的干部路线 ,下功夫把党的基层组织建设好 ,做好党员发展工作。

新型城镇化的经济高质量发展效应研究——理论机制与模型构建

基于经济增长、分工和区位理论,构建了新型城镇化影响经济高质量发展的理论框架,并进行了数理证明。研究发现:在经济增长模型中,城镇化作为非给定的外生变量通过分工和专业化、要素聚集形成的直接机制和规模外部性的间接机制促进经济高质量发展。直接机制表现为城镇化对消费增长、投资增加和创新水平的提高;间接机制表现为城镇化的外部性导致产业结构升级、公共服务供给水平提高和生态环境优化。为此,要不断深化新型城镇化的理论内涵,拓展实践渠道,以期通过新型城镇化建设实现经济高质量发展。

基于DEA方法的我国上市商业银行效率研究

传统的数据包络分析DEA方法在分析商业银行效率时,缺点在于无法考虑环境变量和随机因素对效率测度的影响,三阶段DEA方法可以解决这一问题。以我国17家上市商业银行2007-2016年数据为研究对象,从综合技术效率、纯技术效率和规模效率三个方面,对比分析了我国上市的国有商业银行、股份制商业银行、城市商业银行和农村商业效率差异,并从投入冗余的角度讨论了环境变量对商业银行效率的影响。结果表明,国有商业银行以往低效率的运营已得到一定改善,股份制商业银行应关注纯技术效率的提升,城商行和农村商业银行应适当调整规模。

负荷剂量辛伐他汀对急性心肌梗死患者PCI围术期相关指标的影响

目的:探讨负荷剂量辛伐他汀对急性心肌梗死患者急诊经皮冠状动脉介入(PCI)治疗围术期相关指标的影响。方法:回顾性收集急诊行PCI治疗的203例急性心肌梗死患者资料,按照治疗方案的不同分为观察组(102例)和对照组(101例)。对照组患者在PCI术前3 d给予常规治疗,包括口服阿司匹林肠溶片300 mg,qd+辛伐他汀片40 mg,qd,术后给予辛伐他汀片40 mg/d,qd,疗程为4周。观察组患者于PCI术前2 h顿服辛伐他汀片80 mg,其他治疗方法均与对照组相同。观察并记录两组患者手术前后24 h总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、白细胞介素6(IL-6)、IL-10、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血浆超敏肌钙蛋白(TNT-HSST)、肌酸激酶同工酶(CKMB)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平,记录治疗期间不良反应发生情况。同时,随访术后30 d心血管主要不良事件(MACE)和造影剂肾病(CIN)发生情况。结果:两组患者治疗前后TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。治疗前,两组患者TNF-α、IL-6、IL-10、hs-CRP、CKMB、TNT-HSST水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后,两组患者TNF-α、IL-6、hs-CRP、CKMB、TNT-HSST水平显著高于同组治疗前,且观察组TNF-α、IL-6、hs-CRP水平显著低于对照组,CKMB、TNT-HSST水平显著高于对照组;两组患者IL-10水平显著低于同组治疗前,但观察组显著高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。观察组患者MACE和CIN发生率显著低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗期间两组患者均未见明显不良反应发生。结论:急性心肌梗死患者PCI围术期使用负荷剂量辛伐他汀不仅能显著降低患者TNF-α、IL-6和hs-CRP水平,升高CKMB、TNT-HSST和IL-10水平,还能降低术后MACE及CIN的发生率。