CGT52TGT和GGA57GAA甘露聚糖结合凝集素突变体的构建

目的 构建CCT52TGT和GGA57GAA 2种甘露聚糖结合凝集素(MBL)基因突变体。方法 设计2对引物52F/52R和57F/57R(R中引入了点突变),以含汉族人野生型MBL cDNA的重组质粒pGEM-mbl为模板,采用TaKaRa MutanBEST突变试剂盒进行定点突变,以PCR和测序分析进行鉴定。结果 分别用52F/52R和57F/57R为引物对进行PCR,均得到1个约3800 bp的DNA片段,自身连接后获得重组质粒。以SP6/T7P为引物对进行PCR,获得约900 bp的扩增产物。序列分析表明,2种克隆分别除其第52、57位密码变为TGT、GAA外,其余与野生型MBL cDNA完全相同。结论 构建成功CGT52TGT和GGA57GAA MBL基因突变体,为深入探索MBL基因突变引起调理吞噬缺损的机理和MBL分子的结构-功能关系提供了分子模型。

右美托咪定对达芬奇机器人辅助胸外科手术患者术后恢复质量和智能精神状态的影响

目的评价右美托咪定对行达芬奇机器人辅助胸外科手术(RATS)患者术后恢复质量和智能精神状态的影响。方法择期在全身麻醉下行RATS的患者60例,性别不限,年龄20～70岁,BMI<30 kg/m^2,美国麻醉医师协会(ASA)分级Ⅰ或Ⅱ级。采用随机数字表法将患者随机分为对照组和研究组,每组30例。2组患者麻醉诱导和维持方法相同:依次静脉注射咪达唑仑0.04 mg/kg、舒芬太尼0.4μg/kg、丙泊酚1.5～2.0 mg/kg和罗库溴铵0.6 mg/kg进行麻醉诱导,气管插管后行机械通气;麻醉维持采用吸入体积分数为0.015～0.025的七氟烷,使最低肺泡有效浓度(MAC)维持在0.5,每隔30 min静脉注射罗库溴铵5 mg,靶控输注(TCI)丙泊酚1.0～1.5μg/mL,输注瑞芬太尼0.05～0.15μg/(kg·min),维持脑电双频指数(BIS)值40～60。研究组在气管插管后10 min内静脉输注右美托咪定1μg/kg,随后泵注右美托咪定0.4μg/(kg·h)至手术结束前30 min,对照组给予等容量0.9%氯化钠溶液。分别在患者入手术室吸氧后(T_0),单肺通气后10 min(T_1)、20 min(T_2)、30 min(T_3)、40 min(T_4),以及双肺通气后15 min(T_5)各时间点,记录患者的平均动脉压(MAP)、心率、脑血氧饱和度。记录术中失血量、尿量、手术时间、麻醉时间、丙泊酚总用量,以及使用麻黄素和阿托品的患者例数。于拔除气管导管后吸空气状态下记录呼吸频率,以及行动脉血气分析记录动脉血氧分压(p_aO_2)和二氧化碳分压(p_aCO_2)。记录拔除胸部引流管时间、住院天数和肺部并发症(肺不张、肺炎、肺持续漏气)的发生情况。分别于术前和术后第1、3天完成恢复质量量表(QoR-15量表)和简易智能精神状态检查量表(MMSE量表)的评定。结果两组患者间各时间点的MAP、心率、脑血氧饱和度的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。两组患者间手术时间、麻醉时间、术中失血量和尿量、血管活性药物使用情况的差异均无统计学意义(P值均>0.05),研究组的丙泊酚总用量显著少于对照组(P<0.05)。拔除气管导管后吸空气状态下,研究组的呼吸频率显著低于对照组(P<0.05),p_aO_2显著高于对照组(P<0.05),但两组间p_aCO_2的差异无统计学意义(P>0.05)。术后48 h内,研究组患者自控静脉镇痛平均按压次数显著少于对照组(P<0.05)。两组患者间肺部并发症发生率的差异无统计学意义(P>0.05)。研究组拔除胸部引流管时间和住院天数均显著短于对照组(P值均<0.05)。两组患者间术前QoR-15量表和MMSE量表得分的差异均无统计学意义(P值均>0.05);术后第1天,研究组的QoR-15量表和MMSE量表得分均显著高于对照组(P值均<0.05);术后第3天,研究组的MMSE量表得分显著高于对照组(P<0.05),两组间QoR-15量表得分的差异无统计学意义(P>0.05)。结论 RATS术中使用右美托咪定可减少术中全身麻醉药用量,缩短患者住院天数,改善患者的术后恢复质量和智能精神状态。

蚕豆病合并脊柱侧弯患者行房间隔缺损修补术一例

患者,男,15岁,身高164cm,体重44kg,因心脏杂音2月余入院。患者平素活动能力无明显受限,活动后无胸闷、心悸,无胸痛,无反复上呼吸道感染,生长发育尚可。心超提示＂先天性心脏病,房间隔缺损＂。遂收治入院。既往患者有蚕豆病史,1岁时曾发病。对青霉素、氨基比林、四环素类药物过敏。无哮喘史,无手术外伤史。

二氧化碳培养箱的使用和保护

二氧化碳(CO2 )培养箱提供了细胞生长环境,为了正确使用,根据它的结构和性能要求,介绍培养箱正确使用方法、常见故障的预防和处理。

人血浆MBL的分离纯化及其特性鉴定

应用甘露聚糖－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ柱亲和层析，从人血浆中分离纯化了甘露聚糖结合凝集素（ＭＢＬ）。在还原条件下进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，该结合蛋白显示２９ＫＤ的单一条带。１２５Ｉ－甘露聚糖与ＭＢＬ的结合是浓度依赖、可饱和的，且受Ｎ－乙酰甘露糖胺、Ｎ－乙酰葡糖胺、甘露糖及Ｌ－岩藻糖的抑制，但葡萄糖、半乳糖及其它单糖则否。这种结合依赖Ｃａ２＋，达５０％最大结合量的Ｃａ２＋浓度大约为１ｍｍｏｌ／Ｌ。

MBL与Raji细胞结合特性的研究

甘露聚糖结合凝集素(MBL)作为关键的天然免疫模式识别分子已得到共识,但其在获得性免疫应答中是否发挥作用目前尚不清楚.采用酶联免疫吸附试验分析MBL能否与Raji、THP1/CD14、Jurkat和红细胞结合,并采用流式细胞术着重研究其与Raji细胞结合特性.结果显示:MBL以浓度依赖方式结合Raji、THP1/CD14、Jurkat细胞,红细胞则否.MBL与Raji细胞结合是Ca2+依赖的,且能被甘露糖、葡萄糖、N-乙酰葡糖胺所抑制;C1q或抗C1qR单克隆抗体能部分抑制MBL与Raji细胞结合;重组人MBL-CRD蛋白或MBL-CLR蛋白均能抑制MBL与Raji细胞结合,两者联合应用则可完全阻断这种结合.研究资料表明,B淋巴细胞系Raji细胞表达Ca2+依赖性、糖敏感的MBL受体,包括对CLR特异和CRD特异的两种受体,前者为MBL和C1q的共同受体.进一步的功能研究显示,高浓度MBL(10～50mg/L)对Raji细胞的生长具有显著抑制作用,且呈剂量依赖关系.提示MBL作为一种重要的模式识别分子,不仅发挥天然免疫功能,而且可能在调节获得性免疫应答中起一定作用.

一种面向控制软件需求分析的方法

设计航天控制系统是一个复杂的过程,涉及需求设计、编码、测试等一系列的流程,若能在需求设计阶段发现错误,那么能减少不少的工作量。针对这一问题,提出了一种分析控制软件需求的方法和一个名为SP-ARDL的建模语言,并制作了一套SPARDL工具。SPARDL可以描述周期性的控制系统,首先将需求文档转换为SPARDL模型,且提供了图形化的表示方法;然后运用原型生成技术去仿真系统的行为,进一步分析需求的准确性。最后以一个案例表明了用SPARDL分析一个简单的航天控制系统需求的有效性。

MBL对树突状细胞体外分化成熟的影响

目的: 探讨甘露聚糖结合凝集素 (MBL)对人外周血单核细胞来源的树突状细胞 (MoDC)分化成熟的影响。方法: 以天然人MBL刺激MoDC, 在倒置显微镜下观察DC的形态; 用FACS分析DC的表型; 用 3H- TdR掺入法测定DC刺激同种异体T细胞增殖的能力; 以酵母多糖颗粒吞噬试验评估DC的抗原摄取能力; 用ELISA检测DC培养上清中IL- 12和TNF- α的含量。结果: MBL刺激的DC表面分子CD1a、CD83、CD40、CD80、CD86和MHC DR的表达均上调,摄取酵母多糖颗粒的能力降低, 激发初始T细胞增殖的能力加强, 分泌的IL- 12增多但几乎不分泌TNF- α。结论: MBL能诱导DC分化成熟, 提示其可能通过调节DC的功能而参与获得性免疫应答。

联合应用配体和单克隆抗体亲和层析纯化人血浆天然MBL蛋白

目的优化从人血浆分离纯化天然甘露聚糖结合凝集素(MBL)的方法。方法联合应用甘露聚糖-Sepharose 4B层析柱和抗人MBL-CRD单克隆抗体-Sepharose 4B层析柱,3次上柱亲和层析分离,分别用EDTA、D-甘露糖、Gly-HCl(pH2.4)溶液洗脱结合蛋白。以SDS-PAGE、Western blot和ELISA等技术鉴定纯化产物。结果所获纯化MBL为Mr28000和Mr32000肽链构成的功能性寡聚体,其纯度较高,可与配体甘露聚糖结合并有效凝集酵母菌,还能与U937细胞胶凝素受体结合。结论联合使用配体亲和层析和单克隆抗体亲和层析从血浆中分离纯化MBL,获得高纯度、高活性的天然MBL蛋白。

广东地区汉族人MBL基因GGC54GAC点突变的初步筛查

目的 对广东地区汉族人群的甘露聚糖结合凝集素结构基因第一外显子第 5 4位密码点突变 (GGC5 4GAC)进行初步筛查。方法 提取外周血白细胞DNA进行相应片段的PCR扩增 ,再对产物进行单链构象多态性分析。结果 在 16 6人中查出野生型纯合子 14 7例 ,占 88.5 5 % ,GGC5 4GAC突变杂合子 19例 ,占 11.4 5 % ,未发现GGC5 4GAC突变纯合子。结论 广东地区汉族人群MBL基因GGC5 4GAC突变频率为 0 .0 5 7。

GGC54GAC MBL突变体的构建

目的 :在人甘露聚糖结合凝集素 (MBL)基因中引入GGC5 4GAC点突变。方法 :设计上下游引物和诱变引物 ,以汉族人野生型MBLcDNA为模板 ,采用megaprimer PCR技术进行定点突变 ,将PCR产物克隆至pGEM T载体 ,酶切和测序分析。结果 :以上游引物和诱变引物进行第一轮PCR ,获得一约 180bp的DNA片段 ,以此片段和下游引物行第二轮PCR扩增 ,得到一长约 780bp的产物 ;将其克隆至pGEM T载体 ,酶切发现第 5 4位密码中的BanI酶切位点已被破坏 ,与计算机酶切图谱分析结果一致 ;序列分析表明 ,除第 5 4位密码变为GAC外 ,余与野生型MBLcDNA完全相同。结论 :构建成功了GGC5 4GACMBL突变体 。

中国蒙古族人MBL基因启动子区SNP的研究

目的 研究中国蒙古族人群甘露聚糖结合凝集素 (MBL)基因启动子区单核苷酸多态性 (SNP)。方法 抽提人外周血白细胞基因组DNA ,建立SSP PCR及分子灯塔实时荧光PCR技术 ,检测MBL基因启动子区SNP位点 - 5 5 0 (G C ,称H L等位基因 )、- 2 2 0 (G C ,X Y等位基因 )和 +4(C T ,P Q等位基因 ) ,分析其单倍型及基因型频率。结果 从 82人中检出等位基因型LYP LYP 4例 (4 .9% ) ,HYP LYQ 5例 (6 .1% ) ,LYP LYQ 35例 (4 2 .9% ) ,LXP LXP 1例 (1.2 % ) ,LYQ LYQ 11例 (13.4 % ) ,LXP LYQ 14例 (17.1% ) ,HYP LYP 2例 (2 .4 % ) ,HYP LXP 1例 (1.2 % ) ,HYP HYP 9例 (11.0 % )。结论 中国蒙古族人群MBL基因启动子区SNP等位基因型以LYP LYQ、LXP LYQ、LYQ LYQ和HYP

广东地区汉族人MBL基因点突变的研究

目的:研究我国汉族人群甘露聚糖结合凝集素(MBL)结构基因外显子1第52、54、57位密码点突变(CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA)。方法:收集广东地区汉族普通人群的血标本,提取白细胞基因组DNA,以PCR扩增目的基因片段,应用荧光探针杂交可视技术检测其MBL基因的点突变。结果:从202份样本中,检出GGC54GAC点突变纯合子6例和杂合子44例(等位基因频率为0.139),GGA57GAA点突变杂合子1例(频率为0.002),未发现CGT52TGT点突变(频率为0)。结论:广东地区汉族人群MBL基因点突变的频率较高,为防治MBL缺损病提供了一定的实验依据。

人MBL糖识别域在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

目的原核表达重组人甘露聚糖结合凝集素(MBL)糖识别域(CRD)。方法采用PCR技术,从含汉族人MBL全长编码区cDNA的重组质粒pGEMmbl中扩增出CRD包括颈区的基因片段,将其插入原核表达载体pGEX4T1中,经PCR、限制性酶切和测序确证后,以IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。包涵体经变性、复性后以GSTtrap亲和层析柱纯化,融合蛋白经凝血酶切割后回收目的蛋白。分别以Westernblot和ELISA分析表达产物的免疫学和糖结合活性。结果PCR扩增得到长约450bp的目的基因片段,插入pGEX4T1载体所获重组表达载体pGEX4T1CRD的酶切图谱和序列与预期的一致。重组子经诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在。以GSTtrap亲和层析柱纯化获得约Mr43000的GSTCRD融合蛋白,经凝血酶切割后得到约Mr17000的CRD蛋白。纯化的GSTCRD蛋白能与抗人CRD单克隆抗体特异性结合并具糖结合活性。结论获得了具生物学活性的人MBLCRD蛋白,为进一步探索MBL分子CRD的效应功能提供了实验材料。

人DC-SIGN全长编码区基因的克隆及其胞外段的原核表达

目的:克隆人DC-SIGN全长编码区基因,获得其胞外段的原核表达产物。方法:采用RT-PCR方法,从健康产妇胎盘中克隆DC-SIGN全长cDNA,扩增其胞外段基因并构建pET41a-sDC-SIGN重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果:从健康产妇胎盘总RNA中,扩增获得约1300bp的DNA片段,克隆至pGM-T载体获得重组质粒pGM-DC-SIGN。从pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN的胞外段基因,构建重组表达质粒pET-41a-sDC-SIGN;纯化表达产物sDC-SIGN-GST,鉴定其相对分子质量(Mr)为66000,Western blot证明其可与抗DC-SIGN抗体特异性结合。结论:成功克隆DC-SIGN全长编码区基因,并在大肠杆菌中成功表达其胞外段融合蛋白sDC-SIGN-GST,为进一步研究DC-SIGN的功能奠定了基础。

人MBL-CLR表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的:在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)胶原样区(CLR)蛋白。方法:应用PCR技术,从含中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM-MBL中扩增CLR基因片段,将其克隆至pET32a原核表达载体后,转化E.coliBL21(DE3)感受态菌株诱导表达CLR蛋白。通过Ni2+-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白,以SDS-PAGE、Westernblot和ELISA法进行鉴定。结果:从重组质粒pGEM-MBL中扩增到长约180bp的DNA片段。构建的重组表达载体经BamHI和HindⅢ酶切后出现约5900bp和180bp的片段,测序结果同预期的结果完全一致。重组质料在大肠杆菌中诱导表达后,纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳出现Mr约为30000、60000和120000的3条带。Westernblot分析表明,3条蛋白带均可与抗His抗体起反应,3条蛋白带对应于融合蛋白的单体和寡聚体。ELISA检测证实,纯化的蛋白能与鼠抗重组人MBL蛋白抗体结合。结论:获得可表达人MBL-CLR的大肠杆菌菌株和重组的人MBL-CLR-Trx融合蛋白,为MBL分子结构、功能关系的进一步研究提供了条件。

PcDNA4/His C-MBL表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的构建PcDNA4/HisC-MBL表达载体,在哺乳细胞中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)。方法应用PCR从含有中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM-MBL中扩增目的基因片段,将其克隆至PcDNA4/HisC真核表达载体。经酶切及测序鉴定后,以电穿孔法转染CHO细胞,以RT-PCR分析其mRNA表达,通过Ni-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白并以SDS-PAGE和Western-blotting鉴定,以其为免疫原免疫小鼠后取鼠血清进行ELISA检测分析目的蛋白的免疫活性。结果从pGEM-MBL中扩增得到约750bp的cDNA片段,构建成重组载体经酶切出现约5100和750bp片段,测序鉴定与预期的完全一致。RT-PCR证实转染细胞有MBLmRNA表达,纯化蛋白经SDS-PAGE电泳可见约29000、58000和87000条带,其中29000蛋白带可与6-His抗体反应。纯化蛋白免疫小鼠所获抗血清ELISA效价是1∶819200,与天然人MBL和重组MBL三聚体糖识别域反应的ELISA效价均为1∶25600。结论获得了表达中国人MBL的CHO细胞株和重组人MBL,为MBL分子的进一步研究提供了条件。

人MASP1 N端片段原核表达载体的构建及其表达

目的:在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)相关丝氨酸蛋白酶1(MASP1)N端片段。方法:采用PCR技术从含人MASP1cDNA的质粒pGEM-MASP1中扩增MASP1-N端基因片段,将其插入原核表达载体pGEX4T-1,转化BL21(DE3)感受态菌诱导表达MASP1-N端蛋白,通过GSTrap亲合层析柱纯化目的蛋白,以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,并以ELISA分析了目的蛋白与重组MBL-CLR、重组MBL的结合活性。结果:从pGEM-MASP1中扩增得到约860bp的基因片段,构建成重组载体经酶切出现约4900bp和860bp片段,测序结果与预期的完全一致。纯化蛋白经SDS-PAGE可见Mr60000蛋白带,该蛋白可与抗GST抗体反应并能与重组人MBL-CLR、重组人MBL蛋白结合。结论:获得了表达人MASP1N端片段的大肠杆菌菌株和重组人MASP1N端片段/GST融合蛋白,为MASP1分子的进一步研究提供了条件。

爆炸伤创面愈合过程中MMP-9和TGF-β所起的作用和重量的变化

目的通过研究湿热环境基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及转化生长因子-β(TGF-β)在创面愈合过程中的表达变化,探讨它们对创面愈合所起的作用以及两者之间的相互关系,为临床预防和治疗湿热环境下战伤创面提供理论依据。方法建立湿热环境爆炸伤创面的动物模型,收集伤后4、24、48h和5、7、14、21、28d创面渗液。采用明胶酶谱法和ELISA法,分别对创面MMP-9和TGF-β进行检测。结果创面愈合过程中MMP-9和TGF-β有规律性变化,以伤后48h为高峰,TGF-β伤后7d出现第二高峰,伤后2周两者水平下降,并且出现分离现象。创面给予金属蛋白酶抑制剂(TIMP)的干预,在早期无明显作用,但在后期,即伤后2周,可以降低MMP-9、上调TGF-β的水平。结论创面愈合过程中,早期MMP-9和TGF-β水平上升促进了创面细胞的迁移,有利于创面炎性坏死组织的清除,可能是创面愈合的机制之一,而MMP-9水平的过度升高,不利于创面的愈合。合理外用TIMP对促进延迟愈合创面的愈合会取得良好的效果。