民猪骨骼肌对低温环境的应答反应

低温会导致猪只发生应激反应,造成抗病力下降、生长速度减慢等,是影响生猪产业健康发展的重要因素之一。猪对低温应答的调控机制非常复杂,目前仍然没有准确的解析。本研究以具有明显耐寒特性的地方猪种民猪为主要研究对象,将9头6月龄体重相近的雌性民猪随机分成3组,2组置于半敞篷舍内饲养,其中1组低温处理3 d(短期低温处理组),1组低温处理58 d(长期低温处理组),第3组为正常舍内饲养(对照组)。采用PCR矩阵的方法,对骨骼肌中90个与细胞应激反应相关的基因进行了实时荧光定量PCR检测,筛选受低温诱导的应激基因。结果发现,长期低温处理下,有7个基因的表达水平发生了显著上调,分别是CCT8、CYP11A1、DNAJA4、DNAJB6、DNAJC8、HSPB2和HSPB3,1个基因CYP11B2发生了极显著上调,未发现受到抑制的基因;短期低温处理下,有3个基因的表达水平发生了显著上调,分别是DNAJC8、GPX1、PON3,1个基因SOD1发生了极显著上调,1个基因HOPX受到了显著抑制。对2种处理下均发生显著上调的DNAJC8基因进行了遗传学分析,发现该基因在不同物种间高度保守,符合基因进化规律,具有明显的组织表达特异性,可考虑将其作为机体发生低温应答反应的一个标志基因。综上,民猪骨骼肌应激基因对短期和长期低温处理应答反应不明显,仅11个基因发生了显著变化。

低温对民猪骨骼肌线粒体能量代谢基因的影响

为了探究低温环境下民猪肌肉组织内与线粒体能量代谢相关基因的变化情况,以解析民猪抗寒特性的遗传机制。将9头体质量相近的母猪随机分成3组,每组3头,在冬季将其中2组置于室外半敞篷舍内饲养,分别处理3 d(急性低温处理组)和58 d(慢性低温处理组),1组置于常规舍内饲养,作为对照组。以背肌为试验材料,采用PCR array方法,对90个与线粒体能量代谢相关基因的表达水平进行检测。结果表明,与对照组相比,急性低温处理组基因的表达水平差异不显著,但慢性低温处理显著改变 ATP5H、 ATP5L、 ATP6V1G3、 COX5A、 COX7A2、 COX7A2L、 NDUFS4、 SDHB、 UQCRQ和 GADD45B基因的表达水平,尤其是 GADD45B,达到了极显著水平(P<0.01),这些基因均为编码OXPHOS系统亚基基因,推测慢性低温诱导了背肌ATP的生成。对 GADD45B基因进一步分析发现,该基因在哺乳动物中高度保守,基本符合分子进化规律,表达具有明显的组织特异性。急性低温处理对民猪背肌内ATP的生成影响不显著,但慢性低温处理诱导ATP的生成,以维持体温恒定。

lncRNA2099对猪前脂肪细胞增殖、分化标志基因的影响

为了探究lncRNA2099对猪前脂肪细胞增殖分化的影响,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测lncRNA2099在猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背肌和背脂及离体培养的前体脂肪细胞增殖和分化阶段的表达水平;利用核质分离技术确定lncRNA2099在脂肪细胞中的表达位置;构建真核表达载体pcDNA3.1-lncRNA2099,采用qRT-PCR技术检测在脂肪细胞内过表达该lncRNA后对脂肪细胞增殖、分化相关标志基因表达的影响。结果显示:lncRNA2099存在明显组织表达特异性,且在肾脏和背脂中高表达,在背肌中不表达;lncRNA2099在猪前脂肪细胞增殖阶段12 h表达量最高,随后逐渐降低。在分化阶段第2天表达量最高,随后逐渐降低。核质定位结果表明,lncRNA2099在细胞核与细胞质中均有表达;在脂肪细胞内过表达lncRNA2099后,增殖标志基因P21与成脂分化标志基因LPL表达量极显著升高。lncRNA2099可能作为转录调节因子抑制猪前脂肪细胞增殖、促进成脂分化。

民猪与大白猪胴体和肉质性状的比较研究

为了探究民猪和大白猪胴体和肉质性状之间的差异,试验以民猪和大白猪为研究对象,在相同的饲养方式及饲养条件下,选取大白猪(日龄180 d)、民猪(日龄180 d和240 d)各6头屠宰,分别测定活体重、活体瘦肉率、背膘厚、眼肌面积等胴体性状;测定pH值、肉色、滴水损失、剪切力、肌内脂肪含量等肉质性状。结果表明:胴体性状同体重与同日龄民猪和大白猪比较变化趋势基本一致,民猪背膘厚显著高于大白猪,眼肌面积极显著低于大白猪,活体瘦肉率和生长速度显著低于大白猪;肉质性状同体重民猪和大白猪相比,民猪肌内脂肪含量极显著高于大白猪,滴水损失和剪切力极显著低于大白猪,肉色红度显著高于大白猪,肉色黄度、亮度和pH24h值与大白猪差异不显著;同日龄民猪肌内脂肪含量和肉色a*值显著高于大白猪,滴水损失和剪切力极显著低于大白猪,肉色黄度、亮度和pH24h值与大白猪差异不显著。说明民猪和大白猪具有较大的遗传基础差异,民猪生长速度慢、瘦肉率低,但肌内脂肪含量高、嫩度和保水性好、肉色鲜红,肉质明显优于大白猪。

吡嗪酰胺联合左氧氟沙星治疗耐多药肺结核的临床疗效分析

目的:探讨吡嗪酰胺联合左氧氟沙星对耐多药肺结核(MDR-TB)的治疗效果。方法:选取2019年6月~2022年12月某院收治的104例MDR-TB患者作为研究对象,采用随机数字表法分为对照组和观察组,每组52例。对照组在常规抗结核治疗基础上给予左氧氟沙星治疗,观察组在对照组基础上加用吡嗪酰胺。比较两组患者临床治疗总有效率、痰菌阴转率、空洞闭合率、氧化应激指标、炎症因子及不良反应。结果:治疗后,观察组临床治疗总有效率高于对照组(P<0.05);观察组痰菌阴转率、空洞闭合率高于对照组(P<0.05);观察组总抗氧化态(TAS)水平高于对照组,总氧化态(TOS)水平低于对照组(P<0.05);观察组单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)水平低于对照组(P<0.05)。两组食欲不振、肝功能异常等不良反应总发生率比较无统计学差异(P>0.05)。结论:吡嗪酰胺联合左氧氟沙星治疗MDR-TB,可有效改善患者肺部炎症损伤,提高结核分枝杆菌清除率,临床疗效明显,且不增加不良反应的发生风险。

冷处理对民猪皮下脂肪组织基因表达模式的影响

民猪具有不同于我国其他地方猪种的耐寒特性,但其具体耐寒机制未知。本研究构建了民猪15 d冷处理模型,检测了冷处理后的血液生化指标;RNA-seq技术测定了背部皮下脂肪的基因表达变化模式,qRT-PCR技术检测了与脂肪代谢、细胞分化、应激、炎症和信号传递等相关基因的表达水平。结果发现,冷处理后民猪血液中的谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、血皮质醇、白细胞总数和血小板总数显著升高,而超氧化物歧化酶和肌酸激酶显著下降。背脂的2141个基因表达水平发生了1倍以上的变化,其中1435个为上调表达,706个为下调表达,差异倍数多集中在1~3倍。差异基因显著富集于其他次生代谢产物的生物合成通路和折叠、分类和降解通路。差异最显著的ATP6V0A4、TAP2基因和NOX1基因在背脂、颈脂、腹股沟脂以及腹脂等部位高表达。背脂内C/EBPβ和TNF-α发生了极显著上调,CD137、Tbx1、HSPA6和CIRBP发生了显著上调;PPARα发生了极显著下调。

猪FASN基因功能性单核苷酸多态性的生物信息学分析

为了筛选出猪FASN基因中具有生物学功能的非同义单核苷酸多态性(non-synonymous single nucleotide polymorphisms,nsSNPs)位点,试验采用生物信息学方法对FASN基因的nsSNPs位点进行了研究。首先利用Ensembl数据库分析FASN基因nsSNPs位点的相关信息,然后利用SIFT、Polyphen2和Provean三种方法预测nsSNPs位点的有害性,再利用ConSurf server、I-Mutant 3.0、Mupro、BDM-PUB、SUMO plotTM、NetPhos 2.0 Server等在线软件对nsSNPs位点的进化保守位点、蛋白质稳定性、泛素化位点、磷酸化位点进行预测,SOPMA和MutPred2在线软件分析nsSNPs位点对FASN蛋白二级结构和三级结构的影响,最后使用Phyre2和VMD软件预测和构建野生型和突变型FASN蛋白的空间结构。结果表明:FASN基因有2个转录子,共38个nsSNPs位点,其中有7个位点被SIFT、Polyphen2和Provean三种方法均预测为有害突变位点,分别是L215F、V560G、R409C、F494L、L560R、R872W、R1123W。L215F、F494L位点属于高保守性位点;7个位点都可降低FASN蛋白的稳定性且不存在泛素化修饰,只有L215F位点存在磷酸化修饰;7个位点都可能参与了FASN蛋白二级结构的形成;L215F、V560G、L560R位点对FASN蛋白的三级结构有影响。说明L215F位点可能是猪FASN基因的潜在功能性位点。

东北野猪IFN OMEGA-2基因的克隆测序和遗传多样性分析

干扰素OMEGA-2(IFNω-2)基因属于ω型干扰素,在结构、来源方面为Ⅰ型,根据前期研究发现猪的IFNω-2基因位于1号染色体,处于其染色体长臂的187329341–187329913位置,赵光伟研究团队针对荣昌猪IFNω基因研究中发现IFN-ω基因具有良好的抗原性,能够增强荣昌猪的免疫力,与Xin Zhao研究团队研究结果相似,推测其具备在提高机体免疫调节能力、抵御病毒侵染过程中发挥重要作用。

民猪Y-box结合蛋白基因的克隆、表达以及冷刺激对其表达方式的影响

为了探讨Y-box结合蛋白(YB1)是否参与哺乳动物的冷适应反应,本研究采用RT-PCR和Real-time PCR的方法克隆测序了民猪YB1基因的序列,检测了该基因在大肠、腿肌、肺脏、脂肪、心脏、脾脏和肝脏组织的表达情况,比较了该基因在冷刺激13d后常温组((10±2)℃)和冷刺激组((-20±3)℃)个体的骨骼肌组织内的表达变化。结果表明,民猪的YB1基因完整的CDS区长975bp,编码325个氨基酸,具有1个高度保守的冷休克域,存在多个磷酸化位点,不包含任何跨膜区域,是一种存在于细胞质中的蛋白质。组织表达谱表明YB1基因在所检测的7种组织内均高水平表达。该基因在被冷刺激13d后,在腿肌内的表达水平出现显著下降(P<0.05)。冷刺激造成了YB1基因转录发生了变化。

FRP布约束RC矩形空心桥墩抗震性能试验研究

为研究纤维增强复合材料(FRP)布约束钢筋混凝土(RC)矩形空心桥墩抗震性能,进行六个高宽比为4的矩形空心桥墩拟静力试验研究,分析FRP布约束矩形空心桥墩破坏形态、位移延性、耗能、最大水平承载力等抗震性能参数。试验结果表明:在轴压比0.2低轴压荷载作用下,采用FRP布加固可明显提高矩形空心桥墩的延性及耗能,位移延性系数及累计耗能分别提高65.4%,25.8%,但对最大承载力影响较小,仅提高3.0%。基于Clough退化双线性滞回模型,结合试验结果,建立考虑强度、刚度退化等FRP布约束RC矩形空心桥墩的简单滞回模型,给出其卸载刚度与再加载刚度的回归公式。

利用CRISPR-Cas9系统定点突变猪MSTN基因的研究

为了今后能够有效的利用CRISPR-Cas9系统进行基因功能研究及转基因动物的培育,本研究将带有绿色荧光蛋白(GFP)和肌肉生长抑制素基因(Myostatin,MSTN)靶序列的CRISPR-Cas9系统转染入PK15细胞系,利用流式细胞仪分离并收集转染成功的阳性细胞,使用PCR扩增结合克隆测序的方法检测和分析CRISPR-Cas9系统的定点突变情况,以评价CRISPR-Cas9系统的作用效果。结果发现,随机挑选的100个阳性克隆中,38个发生了变异,突变效率为38%,其中32个为插入突变,6个为缺失突变。插入突变中突变1(Mutation1)所占比例最高,为47.4%。本研究中CRISPR-Cas9系统的突变效率达到了38%,是目前进行基因组编辑的一个有效工具,推测其突变类型具有一定的偏好性。

民猪全基因组序列测定与分析

民猪是我国优良地方猪品种,具有高繁殖、耐粗饲、抗逆和肉质优良等特性,但遗传背景模糊。为合理保护和利用民猪资源,利用Illumina Hiseq2000测序平台,采用双末端测序方法,测定10头民猪和4头东北野猪全基因组序列,统计分析SNPs和InDel标记信息,利用NCBI数据库中已知的50个不同个体的SNPs信息作主成分分析并构建分子进化树,使用θπ和Fst两个参数筛选民猪和东北野猪基因组内受选择基因。结果表明,民猪基因组内检测8 255 874个SNPs,大量的SNPs发生在基因间区及内含子区;与猪dbSNP数据库相比,新发现7 739 173个SNPs;检测到739 647个InDel位点,其中纯合多于杂合位点。民猪在遗传距离上介于亚洲猪种和欧洲猪种之间,说明民猪在品种形成过程中,曾引入欧洲猪血统,东北野猪则与亚洲家猪和亚洲野猪聚为一类,符合其地理分布。民猪基因组内共181个基因受到选择,涉及能量代谢、脂质转运、脊椎及视神经发育等。东北野猪基因组内共411个基因受到选择,涉及神经系统、免疫应答、繁殖、线粒体能量代谢等。

民猪肠道菌群特征分析

试验旨在解析不同月龄民猪的肠道菌群特征及粗纤维对民猪肠道微生物的影响。选择5头体重为(100±7.24)kg的10月龄成年母猪(成年组)和(50±4.31)kg的6月龄青年母猪(青年组),青年组又分为正常饲喂组(5头)和添加粗纤维组(4头),采集同一时间、新鲜的粪便样品,提取总DNA,利用带标签的通用引物扩增16S rRNA V4区,使用Illumina Hiseq 2000测序平台测序,通过计算Ace和Shannon多样性指数以及与已知数据库的比对,分析菌群多样性及结构特征。结果表明:3个处理组在菌群多样性方面无显著差异(P>0.05);3组均以拟杆菌门、厚壁菌门和螺旋菌门所占的比例最高,总计可达91%~92%,粗纤维的添加明显改变了青年组肠道微生物的组成,大幅提升了拟杆菌门所占的比例,降低了厚壁菌门和螺旋菌门所占的比例,使其菌群分布比例更接近成年个体;同时,粗纤维的添加也促进了肠道微生物内纤维杆菌属的增加。

利用Affymetrix芯片分析民猪冷应激后肌肉组织的基因表达谱

冷应激可引起动物生产性能下降,诱发多种疾病,甚至造成死亡。民猪是我国北部地区特有的一个抗寒品种,为了研究冷应激下基因的表达调控机制,本研究利用Affymetrix猪基因芯片对民猪冷应激后肌肉组织内表达发生变化的基因进行了高通量的检测。结果,共检测到差异基因34个,其中下调表达的基因27个,上调表达的基因7个。在下调表达的基因中有7个(OAS1、IRG6、ISG20、DDX58、IFITl、ISG15、CXCL9)与干扰素诱导相关,1个(FST)与生长性状相关,2个(MX1、PG-2)与抗病毒有关,2个(S100A9、Numb)与细胞生长和凋亡有关;上调表达的基因功能还不清楚,推测它们可能与提高机体的抗寒性有关。对其中5个基因进行了Real-time PCR分析,证实它们都受到了温度的调节,与芯片检测结果吻合。结果提示,重度冷应激会造成机体免疫力下降,生长减缓。

杂种猪染色体的核型与显带研究

应用常规方法获得了杂种猪(野猪(♂)×家猪(♀))的核型、C带和174条带纹的G带,应用微量秋水仙素法得到了258条带纹的高分辨G带。结果表明,杂种猪的二倍体细胞染色体数目2n=38,C带具有多态性,G带和高分辨G带与家猪相比无明显差异,它们属于同一种。

民猪PGD和LDHA基因的表达与冷诱导研究

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因(6-phosphogluconate dehydrogenase,PGD)是戊糖代谢途径中的一个关键酶,乳酸脱氢酶A(Lactate dehydrogenase A,LDHA)是动物体内参与糖酵解的重要酶类之一。为了探讨PGD和LDHA基因在民猪抵御寒冷气候的过程中是否起着一定的生物学作用,研究采用RT-PCR和Real-time PCR的方法,分析了这2个基因在民猪大肠,腿肌、肺、脂肪、心脏、脾脏和肝脏的表达情况以及冷诱导后在腿肌的表达变化情况。结果表明,PGD基因在所检的7个组织内均高水平表达,冷诱导后表达水平显著上升(P<0.05),LDHA基因在所检的7个组织中也均有表达,冷诱导后表达水平出现显著下降(P<0.05)。

东北民猪SLA-DQA基因的PCR-RFLP多态性分析

采用克隆测序和PCR-RFLP的方法对SLA-DQA基因的整个编码区进行了扫描和多态性分析。结果表明该基因的第2外显子是整个基因的高变区,突变率达到5.6%,其中80%为有效突变,但没有发现新的等位基因;PCR-RFLP结果表明外显子2用限制酶EcoR I酶切可获得3种基因型:254 bp(AA)、254 bp/88 bp/ 166 bp(AB)、88 bp/166 bp(BB),用限制酶PvuⅡ酶切可获得3种基因型:254 bp(AA)、254 bp/129 bp/125 bp (AB)、129 bp/125 bp(BB),外显子3用限制酶FbaⅠ酶切可获得3种基因型:282 bp(AA)、282 bp/130 bp/152 bp (AB)、130 bp/152 bp(BB),外显子4用限制酶Hin1Ⅰ酶切可获得3种基因型:184 bp(AA)、184 bp/83 bp/101 bp (AB)、83 bp/101 bp(BB);Hardy-Weinberg平衡分析表明民猪在EcoRⅠ位点处于平衡状态(P<0.05),而在PvuⅡ位点处于不平衡状态(P>0.05),FbaⅠ和Hin 1Ⅰ位点处于极不平衡状态(P>0.01)。

野猪骨桥蛋白基因表达及与家猪的对比分析

采用RT-PCR法克隆野猪(Sus scrofa)OPN基因,构建其进化树,半定量RT-PCR法结合Western-blot法对其表达进行研究。结果表明,野猪的OPN基因CDS全长909 bp,编码303个氨基酸。特征基序包括(1)第86个氨基酸处有8个连续的天冬氨酸;(2)第153～157氨基酸处有一个与细胞黏附有关的Gly-Arg-Gly-Asp-Ser(GRGDS)序列;(3)第163～164氨基酸处有一个凝血酶酶切位点RS。分子进化树表明,野猪与家猪的亲缘关系最近,与石斑鱼(Danio rerio)的亲缘关系最远,OPN基因在进化过程中发生过一次大的变异。OPN mRNA在心、胃、肾、卵巢的表达水平较高,在肝、脾、肺、小肠、肌肉、子宫内的表达水平较低。不同组织表达的OPN蛋白大小不同,存在70 ku、70 ku+45 ku和70 ku+45 ku+24 ku这三种模式。

民猪和大白猪背最长肌差异表达基因的筛选与注释

为了筛选民猪和大白猪背最长肌中的差异表达基因,本研究采用高通量测序技术,构建了民猪(脂肪型)和大白猪(瘦肉型)背最长肌组织的数字基因表达谱,对差异表达的数字基因进行了筛选与注释,并进行了GO和通路的功能显著性富集分析。结果表明,民猪和大白猪分别获得5 000 000多条可用的标签数据(Clean tag),其中拷贝数大于100的标签所占比例最高,分别为88.62%和84.62%;完全比对到正义链上,且1个标签仅比对到1个基因的分别为2 351 788和2 388 175条。以大白猪为对照组,民猪与之相比,差异倍数在2倍以上的共有1 098个基因,其中44个上调表达,1 054个下调表达,有11个基因只在民猪中表达,256个基因只在大白猪中表达,差异表达基因中包括多个与肌内脂肪含量、脂类代谢、肉色、嫩度和肌肉生长发育相关的基因或转录子。民猪和大白猪分别预测到了23 853个和34 731个定位在猪基因组不同位置的新转录本,其中包含存在1个碱基错配的标签。民猪和大白猪之间的差异基因在细胞所处位置方面显著富集的条目有细胞质、膜旁细胞器、色素粒、水解性液泡、部分细胞内等共计18个;在基因分子功能方面显著富集的条目有蛋白结合和氧化还原酶活性2个;在参与的生物过程方面显著富集的条目有对压力的应答、对活性氧的应答和羧酸代谢过程等14个。显著富集的通路共计11个,按照P值从小到大的顺序,溶酶体、PPAR信号通路和胆汁酸合成通路为差异最显著的3个通路。本研究结果可为今后挖掘新基因和研究影响猪肉品质的遗传因素等提供理论依据。

民猪保种群体的遗传基础分析

为了科学准确地划分现有民猪保种群体的亲缘关系及家系结构,试验采用猪的"中芯一号"育种芯片检测了70头民猪的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP);使用MEGAX(V10.0)和R软件进行公畜样本及全部样本的聚类分析,使用Plink(V1.90)和R软件等进行近交系数的计算及因果突变分析,并统计分析影响猪的肉质性状、生长和体型性状、繁殖性状和抗病性性状等11个基因的基因型。结果表明:民猪保种群内的20头公猪可划分为5个血统,49头母猪可分别划入这5个血统,但有1头个体与这5个血统均不存在亲缘关系,而被归为"其他"。群体平均近交系数为0.11,属于中度近交。在因果突变分析中,该群体内氟烷基因和酸肉基因还未得到净化;采食量、抗仔猪腹泻和料肉比的优势等位基因占比较高,但影响多肋骨数和多胸椎数的优势等位基因占比非常低,还有较大的选择空间。说明未来该民猪保种群体要尽量避免近交,考虑引入新的公猪血统,尽快剔除携带有劣势基因型的个体,提升种群的生产性能。