水产品过敏原及其检测技术概述

水产品因鲜美的味道和丰富的营养而深受消费者青睐。水产品属于联合国粮农组织和世界卫生组织认定的过敏食物,其在加工、运输、贮藏过程中有可能受到外来过敏原的污染,由此引起的食品安全问题日益严峻,严重制约了行业的发展。明确水产食品中的过敏原,并利用适当的检测技术进行检测、监控,有利于预防水产食物过敏疾病的发生。本文概述水产食品中的主要过敏原,以及基于基因水平的核酸检测技术、蛋白水平的免疫检测技术及质谱检测技术研究进展,为丰富水产品过敏原及其检测手段提供理论依据。

透明质酸对南美白对虾虾糜理化性质和凝胶特性的影响

以南美白对虾(Litopenaeus vannamei)虾糜为研究对象,考察不同添加量(0.1%、0.3%、0.5%、0.8%和1.0%,以虾肉的质量计)透明质酸(hyaluronic acid,HA)对虾糜凝胶特性和理化性质的影响。结果显示,一定量HA能够改善虾糜凝胶的质构特性和凝胶强度,提高虾糜凝胶的亮度和白度。适量添加HA还能够促使虾糜凝胶内部自由水和不易流动水向结合水转变,改善虾糜凝胶的水结合特性,提高持水性(water-holding capacity,WHC)。流变学分析表明,一定量HA能使虾糜的储能模量提高,然而低添加量HA会对表观黏度产生不利影响。化学作用力分析表明,离子键和氢键随HA的添加分别呈现先减后增和先增后减的变化趋势,适量HA可以改善疏水相互作用,巯基氧化形成二硫键的过程则被HA抑制。HA还能与虾糜蛋白相互作用,抑制蛋白多聚体的形成,改变蛋白质的构象,促使蛋白质二级结构从α-螺旋向β结构和无规卷曲转变。添加适量HA对虾糜凝胶微观结构同样有所改善,促使虾糜凝胶形成更加均匀致密的微观结构。其中,添加0.8%HA虾糜凝胶具有最高的硬度、咀嚼性、胶着性、凝胶强度以及储能模量和最致密的微观结构,WHC较对照组也显著提高(P<0.05)。而添加0.1%HA虾糜凝胶的质构特性、凝胶强度、WHC、储能模量均较对照组有所降低,微观结构也较为松散。

珍珠蚌肉二肽基肽酶-IV抑制肽的制备与分离

目的:以珍珠蚌肉为原料制备对二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase,DPP)-IV具有抑制作用的生物活性肽。方法:利用两步酶解法并优化珍珠蚌肉酶解条件,筛选体外DPP-IV抑制活性较高组分进行超滤膜浓缩,Superdex^(TM) peptide 10/300 GL凝胶柱层析与反相高效液相色谱(reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)技术分离纯化出酶解液中的DPP-IV抑制肽,最终通过液相色谱-串联质谱鉴定其氨基酸序列。结果:中性蛋白酶与碱性蛋白酶对珍珠蚌肉均有良好降解效果,经3 kDa超滤膜浓缩后,酶解产物的DPP-IV抑制率可达67.4%。通过凝胶过滤柱和RP-HPLC进一步分离纯化出6个活性较高的肽段,序列分别为FNAPAM、FIPNY、IYNPPTPF、LAMPYP、FFVVMP和LAGMP。进一步,以分子对接的方式分析6个肽段与DPP-IV的相互作用关系。结论:本研究利用珍珠蚌肉制备DPP-IV抑制肽,可为以水产加工副产物为原料制备功能性食品提供理论参考。

葡萄糖糖基化对蓝圆鲹分离蛋白限制性酶解产物结构及功能特性的影响

为拓展蓝圆鲹(Decapterus maruadsi)分离蛋白的应用范围,促进其高值化利用,以蓝圆鲹分离蛋白限制性酶解产物(Brown-striped mackerel scad protein isolate limited enzymatic hydrolysate,BPILH)为原料,采用葡萄糖对其进行糖基化反应,考察不同反应时间对BPILH结构与功能特性的影响。结果表明,葡萄糖与BPILH的糖基化反应程度与反应时间和色度呈正相关。结构表征结果显示,糖基化反应使α螺旋和无规则卷曲含量减少,并降低糖基化产物的内源荧光强度。此外,长时间的高温使蛋白质分子内部的疏水基团暴露,使其表面疏水性增加。溶解度在酸性、碱性条件下随着反应时间的延长呈现先升高后降低的趋势,其中,第8小时糖基化产物的溶解度在pH 10时达到最高值(90.49±0.01)%。乳化性随着反应时间的延长而增加,与第0小时相比,第12小时糖基化产物的乳化性提升了24.28%,乳化稳定性和持油性均随着反应时间的延长呈现先增加后减少的趋势,在第1小时乳化稳定性达到最高值(17.51±0.13)min,在第2小时持油性达到最高值(2.19±0.21)g·g^(-1)。因此,反应时间过长会对功能特性产生一定的负面影响,研究结果可为蓝圆鲹分离蛋白在食品配料蛋白中的应用提供一定的理论参考。

不同干燥方式对南极磷虾分离蛋白结构及功能特性的影响

采用碱溶酸沉的方法提取南极磷虾分离蛋白(krill protein isolate,KPI),通过喷雾干燥和冷冻干燥的方式制备南极磷虾分离蛋白粉,并对这两种分离蛋白粉的结构及功能特性进行比较分析。结果表明:与冷冻干燥南极磷虾分离蛋白(freeze-dried krill protein isolate,FKPI)相比,喷雾干燥南极磷虾分离蛋白(spray-dried krill protein isolate,SKPI)明度大,色泽较好;扫描电子显微镜结果显示,SKPI呈现出向内凹陷的不规则球状结构,而FKPI为薄层片状结构,SKPI的堆积密度高于FKPI;圆二色谱进一步表明,与KPI相比,SKPI和FKPI均呈现α-螺旋含量下降、β-转角含量增加的趋势,其中,SKPI的α-螺旋含量下降27.9%,β-转角含量增加12.2%,表明喷雾干燥后蛋白质的二级结构均从有规则的结构向无规则的结构转化;SKPI持水力、持油力、乳化稳定性和起泡性等均高于FKPI,而SKPI的溶解性、乳化性却比FKPI的差。可见,不同的干燥方式会改变南极磷虾分离蛋白的结构特性,并进一步影响其功能特性。

酶解前后牡蛎肉风味变化研究

该研究以牡蛎(Ostreae concha)为研究对象,蛋白酶与淀粉酶复合反应制备牡蛎肉酶解液,结合感官评价和顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱联用法分析牡蛎肉酶解前后挥发性化合物的变化规律,解析牡蛎肉及其酶解液的关键风味化合物及主要腥味成分。利用相对气味活度值来量化评价各组分对牡蛎肉酶解液风味的贡献程度。添加淀粉酶将牡蛎肉中的糖原分解成小分子单糖,并在一定温度下促使酶解液发生美拉德反应,进而产生具有愉快风味的化合物以遮盖牡蛎的腥味。结果表明,酶解后呈现腥味、哈喇味的(E,E)-2,4-庚二烯醛、己醛、庚醛和壬醛等物质的含量降低,酶解脱除了牡蛎肉中的腥味,生成了具有浓郁果香味和青草味的2-戊基呋喃、苯甲醛和十六醛等物质,在多种挥发性化合物共同作用下,整体香气协调,风味持久。

冷藏条件下鲢鱼肌肉蛋白的变化

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法分析比较了鲢鱼在0和4℃下冷藏14 d过程中肌肉蛋白的变化情况.结果表明:在2种温度下冷藏,肌浆蛋白降解均不显著,其变化趋势基本一致;肌球蛋白重链在0℃下冷藏14 d,4℃下冷藏11 d后发生明显降解;α-辅肌动蛋白和肌动蛋白在2种温度下冷藏均呈逐渐降解的趋势,且在4℃下冷藏降解更为显著;原肌球蛋白在0和4℃下冷藏2 d后均开始降解,此后于0℃冷藏蛋白无明显变化,但于4℃冷藏11 d后降解速度加快.

膜分离法纯化天然牛磺酸的研究

为了研究膜分离法纯化天然牛磺酸的工艺条件,利用超滤和反渗透浓缩技术,考察了Ultra-flo和卷式膜超滤系统对牛磺酸水提液中的固体悬浮物和蛋白质等杂质的清除效果.结果表明:截留相对分子质量30 000的聚丙烯腈膜平均膜通量达88 L/(m2.h),截留相对分子质量1 000的卷式膜平均膜通量为45 L/(m2.h),经两级超滤,蛋白质质量分数可降至0.2%以下,滤液质量高,利于后续工艺.离子交换后,牛磺酸收集液经反渗透可浓缩35倍左右,平均膜通量为43 L/(m2.h).

太平洋牡蛎肌肉蛋白的模拟胃肠液消化研究

采用美国药典提供的模拟胃液、肠液配方,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(Western blot),分析了太平洋牡蛎肌肉过敏蛋白和非过敏蛋白在体外模拟胃液、肠液消化稳定性的差异.结果表明:在模拟胃液中,非过敏蛋白均能被胃蛋白酶快速降解,而主要过敏蛋白原肌球蛋白在60 min时仍未被完全分解;在模拟肠液中,肌浆蛋白不易被分解,肌原纤维蛋白和原肌球蛋白都能在一定程度上被胰蛋白酶分解.可见,太平洋牡蛎的主要过敏蛋白原肌球蛋白相对于非过敏蛋白具有一定的耐消化性.

利用牡蛎制备ACE抑制肽的工艺优化

运用正交试验和响应面法优化牡蛎血管紧张素转换酶(angiotensin-Ⅰconverting enzyme,ACE)抑制肽的分步酶解制备工艺。采用复合蛋白酶和碱性蛋白酶对牡蛎进行分步酶解,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析和ACE抑制率为考核指标优化工艺参数。结果表明,第1步复合蛋白酶最佳工艺参数为:料液比1∶4、加酶量1.2%、pH 7.0、反应温度50℃、酶解时间1 h;第2步碱性蛋白酶最佳工艺参数为:加酶量0.42%、pH 8.3、反应温度53℃、酶解时间73 min。凝胶过滤色谱法测得牡蛎酶解液分子质量在3 000 D以下小肽所占比例为99.72%,其ACE抑制活性IC50为0.8 mg/mL。同时,氨基酸组成分析表明,牡蛎肽中Glu含量最高,Cys含量最低;必需氨基酸和疏水性氨基酸含量分别占总氨基酸的36.6%和37.2%。本研究制备的低分子质量、高ACE抑制活性牡蛎肽,可为牡蛎资源的开发利用提供理论参考。

辐照处理对蟹类过敏原(原肌球蛋白)性质的影响

食物过敏是当前食品安全领域较为突出的问题，辐照作为食物过敏原的加工处理方法之一,引起了学者的重视．作者对中华绒鳌蟹和三疣梭子蟹的主要过敏原（原肌球蛋白）进行了辐照处理，并分析了辐照处理对原肌球蛋白性质的影响．十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，部分纯化的蟹类原肌球蛋白经7kGy辐照处理后出现明显降解,10kGy辐照处理后完全降解；蟹类过敏者血清的免疫印迹分析结果显示．部分纯化原肌球蛋白经3～7kGy辐照处理后的过敏原性无明显变化．而10kGy辐照处理后的过敏原性降低；兔抗锯缘青蟹原肌球蛋白抗体的免疫胶体金层析检测结果证实部分纯化原肌球蛋白经10kGy辐照处理后的抗原性为阴性．但是．3～10kGy辐照处理对整蟹原肌球蛋白及其过敏原性无明显影响。模拟胃液消化反应结果也表明3～10kGy辐照处理对整蟹原肌球蛋白的酶解消化特性无明显影响．

水产食品中组胺的丹磺酰氯柱前衍生反相高效液相色谱测定方法的建立及应用

建立一种快速测定水产食品中组胺的丹磺酰氯柱前衍生反相高效液相色谱方法.该方法中样品经三氯乙酸提取、丹磺酰氯衍生,C18反相色谱柱分离,以70％乙腈和30％超纯水为流动相进行等度洗脱,254 nm波长处紫外检测.结果显示,组胺保留时间为5.5 min,组胺在1～500μg/rnL范围内线性系数为0.999 9,仪器检出限（RSN=3）为0.5 μg/mL,定量限（RSN=10）为1.0 μg/mL,且重复性良好;采用该方法测定了16种水产品和19种水产加工食品中的组胺,结果显示含量在0～～682.22 mg/kg之间;样品添加不同质量浓度组胺的回收率为89.54％～101.92％.结果表明,该方法快速准确、灵敏度高、重复性好,适用于水产食品中组胺的测定.采用该方法检测了鲣鱼、鲭鱼和蓝圆鲹在不同温度条件下的组胺变化情况,结果发现,3种鱼在低温贮藏条件下的组胺含量明显低于高温贮藏条件下的含量,表明低温贮藏可有效抑制组胺产生.

蟹类原肌球蛋白基因的克隆与表达

通过分子生物学技术方法,分别克隆得到锯缘青蟹(Scylla serrata)、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)和三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的原肌球蛋白基因序列。测序结果表明,三个基因的序列长度均为855 bp,编码284个氨基酸残基,三者氨基酸序列同源性为99.3%。三种蟹的原肌球蛋白基因序列与GenBank中其他甲壳类动物的原肌球蛋白具有很高的同源性。将锯缘青蟹的原肌球蛋白基因与pGEX-4T-3载体连接后,经IPTG诱导得到分子量约为61 ku的融合表达蛋白。通过与甲壳类过敏患者血清的免疫印迹反应,证实融合表达的原肌球蛋白具有过敏原性,表明原肌球蛋白是蟹类的主要过敏原之一。该融合蛋白有望用于甲壳类食物过敏诊断试剂的开发与应用。

反相高效液相色谱法同时检测海产品中8种生物胺

目的建立一种可同时快速测定海产品中8种生物胺的丹磺酰氯柱前衍生反相高效液相色谱法。方法样品经5%三氯乙酸提取,丹磺酰氯柱前衍生后,采用Agilent zorbax SB-C_(18)色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm),以甲醇和水作为流动相,进行梯度洗脱。柱温30℃,流速为1.5 m L/min,采用UV紫外检测器,检测波长254 nm,对8种生物胺进行分离分析。结果结果显示,色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺在15 min内得到有效分离,在1~100 mg/L范围内线性系数r^2﹥0.999,8种生物胺测定方法的检出限范围为0.02~0.17 mg/L,定量限范围为0.067~0.57 mg/L,且重复性良好,向秋刀鱼中分别添加生物胺标准品20.0、50.0、100.0 mg/L 3个含量水平,8种生物胺平均回收率介于79%~117%之间,相对标准偏差为0.84%~12.57%。采用该方法测定了秋刀鱼等5类海产品中8种生物胺的含量,结果显示生物胺总含量在23~208 mg/kg之间。结论该方法简单、快速,灵敏度和准确度符合要求,适用于海产品中多种生物胺的同时检测。

天然牛磺酸提取新工艺研究

本实验将超滤、离子交换、反渗透浓缩等现代加工技术整合,从低值牡蛎中提取分离天然牛磺酸。结果表明:此工艺流程设计合理、可行、方法简便,产品纯度高达98.5%以上,并进一步用红外光谱(IR)和核磁共振波谱(NMR)对其结构进行了确定。

鲤鱼小清蛋白的纯化及其过敏原性鉴定

目的:分离纯化鲤鱼小清蛋白(parvalbumin),并对其进行过敏原性鉴定,为建立鱼类过敏原检测技术奠定基础。方法:采用硫酸铵分级盐析和阴离子交换层析纯化鲤鱼小清蛋白,采用点杂交和特异性IgE检测试剂盒筛选鱼类过敏者血清,应用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹技术分析确定纯化目标蛋白的性质。结果:硫酸铵分级盐析和阴离子交换层析纯化方法可以得到电泳纯单一目标蛋白;小鼠抗蛙小清蛋白单克隆抗体免疫印迹实验表明,所得纯化蛋白是小清蛋白。此外,免疫杂交结果显示,鱼类过敏者血清能与纯化的小清蛋白发生特异性结合,从而证实了鲤鱼小清蛋白的过敏原性。

鲤鱼过敏原(胶原蛋白)的体外模拟消化

首先采用酸法提取纯化鲤鱼过敏原（胶原蛋白）,依据美国药典提供的模拟胃液、肠液配方,分别利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对纯化的胶原蛋白进行酶解消化,以SDS-PAGE和免疫印迹分析测定纯化的胶原蛋白在体外模拟胃液、肠液中的消化稳定性及免疫原性.结果表明,鲤鱼胶原蛋白经模拟胃液（胃蛋白酶）消化15min出现较为明显的降解,消化1h的产物仍具有一定的免疫原性;经模拟肠液（胰蛋白酶）消化30min出现较为明显的降解,消化3h的产物仍具有一定的免疫原性;经模拟肠液（胰凝乳蛋白酶）消化1～4h均未出现明显降解,其消化产物仍具有较强的免疫原性.结果提示,鲤鱼胶原蛋白的耐消化性及免疫原性可能是导致食物性过敏反应的重要原因.

鲍鱼内脏中天然牛磺酸的提取与检测

目的：以皱纹盘鲍内脏为原料,优化高纯度牛磺酸的提取工艺,并建立用高压液相色谱检测牛磺酸纯度的方法。方法经水煮、乙醇抽提、蒸发浓缩、沉淀、活性炭处理、结晶等步骤,获得高纯度天然牛磺酸。用高压液相色谱检测牛磺酸纯度的方法为：色谱柱：Discovery C18；流动相：甲醇-0.05 mol/L乙酸钠缓冲液(pH 5.3)(v/v,50：50)；流速：1 mL/min；检测波长：330 nm；柱温：室温。结果该提取工艺能从1 kg 鲍鱼内脏中提取得到天然牛磺酸3.07 g。采用该检测方法,牛磺酸的出峰时间为6.037 min,在1~20μg/mL浓度范围内线性关系良好(R2=0.9999),最低检出限为0.03μg/mL,最低定量限为0.12μg/mL,样品测定的平均回收率为99.44%(RSD=0.25%),方法的精密度和稳定性好(RSD<1%),用该方法检测提取得到的牛磺酸纯度为96.06%。采用红外光谱法(IR)对提取得到的鲍鱼内脏牛磺酸进一步作结构鉴定,发现它与标准品的红外特征吸收峰一致。结论获得了高纯度牛磺酸的提取工艺。本方法精密度和稳定性好,回收率高。

长牡蛎(Crassostrea gigas)不同组织中蛋白酶的分布及冷藏过程中酶活力与鲜度变化

以长牡蛎(Crassostrea gigas)为研究对象,采用酶活力测定和Western blotting鉴定牡蛎不同组织中氨肽酶、胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶、组织蛋白酶等几种主要蛋白酶的分布,探讨牡蛎肉在4℃冷藏过程中酶活力和鲜度指标的变化规律。结果显示:在牡蛎的外套膜、鳃、闭壳肌和性腺-内脏团四种组织中,亮氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶、精氨酸氨肽酶均有较高酶活力;胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶主要分布于性腺-内脏团,在另外三种组织中活性较低;组织蛋白酶B和B+L绝大部分在性腺-内脏团中表达。在4℃冷藏过程中,酶活力发生明显变化,经7d冷藏后,性腺-内脏团中亮氨酸氨肽酶的酶活力为初始值的25.15%,丙氨酸氨肽酶的酶活力为初始值的31.65%,精氨酸氨肽酶的酶活力为初始值的23.19%;组织蛋白酶B和B+L的酶活力分别是初始值的2.59和4.23倍;胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶酶活力上升44%。随着冷藏时间的延长,牡蛎的鲜度指标发生变化:牡蛎pH值呈现先降低,9d后上升的趋势;氨基酸态氮含量由初始的(0.26±0.05)g/100g增加至第7d的(0.31±0.03)g/100g;挥发性盐基氮含量从(5.60±0.64)mg/100g上升至第7d的(17.50±0.37)mg/100g;SDS-PAGE分析显示,牡蛎冷藏过程中四种组织的蛋白质均发生了不同程度的降解。本研究揭示了牡蛎在短期冷藏过程中几种主要蛋白酶和鲜度指标的变化规律,为牡蛎的冷藏保鲜提供了参考。

茶多酚树脂吸附层析法脱咖啡因的性能研究

研究发现不同性质的吸附树脂对茶多酚提取液中的各组分具有明显不同的吸附选择性,极性RS-1树脂对茶叶水提液具有明显脱色除杂效果;具有较高比表面积的弱极性吸附树脂RX-2对咖啡因具有较高的吸附容量和吸附选择性,动态吸附时发生层析分离,是一种较为理想的咖啡因脱除剂。经两级树脂纯化,茶叶水提液中EGCG、ECG的含量可由49.78%、11.56%提高至74.72%、17.45%,收率分别约为78.31%、83.46%,处理后咖啡因含量可降至0.2%以下。