重组DT/bFGF融合蛋白基因表达载体的构建及表达产物的纯化

目的构建重组DT/bFGF融合蛋白表达载体,制备高纯度的DLF融合毒素。方法PCR扩增DT389和bFGF的编码DNA序列,经酶切和连接,克隆至表达载体pET-30a,转化E.coliBL21(DE3),鉴定阳性克隆菌落,经IPTG诱导表达融合蛋白DLF,镍离子螯合层析纯化,用Westernblot分析其抗原性。结果测序表明,插入片段可编码含545个氨基酸残基的融合蛋白DLF。SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白可在大肠杆菌中表达,其表达量约占菌体总蛋白的20%,表达形式主要为包涵体。纯化后纯度达90%以上。Westernblot证实,该融合蛋白同时具有DT和bFGF两种抗原性。结论已成功构建DT/bF-GF表达载体,并获得较纯的DLF融合毒素。

白喉毒素抗肿瘤研究进展

白喉毒素(DT)是一种由感染β棒状噬菌体的白喉杆菌的外毒素。完整的DT分子由535个氨基酸组成,分子量为58.4kD。根据其结构和功能特点,自N端向C端可将其分为3个结构区:催化区(C区),由1～193氨基酸残基组成;跨膜区(T区),由205～378氨基酸残基组成;受体结合区(R区),由386～535氨基酸残基组成。R区能与真核细胞表面DT受体结合。T区在R区与受体结合后插入细胞膜中,使c区进入细胞内。C区含有ADP依赖的核糖体转移酶活性,能催化NAD+的ADP核糖基向延长因子(EF-2)转移,生成烟酰胺,使EF-2失活,阻断细胞蛋白质的合成。

人用马免疫血清制品质量控制

本文介绍了2020年版《中国药典》第三部中人用马免疫血清制品总论的制定情况,并从生产工艺和产品检定两方面对人用马免疫血清制品质量控制的要点进行了阐述,便于使用者对人用马免疫血清制品的质量控制全面、整体的理解和认识。

趋势分析在疫苗产品批签发管理中的应用

目的趋势分析作为生产企业和国家监管当局/国家质量控制试验室(NRA/NCLs)控制产品质量和一致性的手段是十分重要的,WHO在批签发指南中以及我国的《药品生产质量管理规范》(2010年修订)中均明确要求:生产企业和NRA/NCLs应对所有的关键质量控制参数进行趋势分析。本研究通过对趋势分析方法的论述为趋势分析方法在疫苗批签发中的应用提供参考。方法应用趋势分析方法对疫苗批签发实际工作中发现的问题进行阐述。结果与结论通过实际应用趋势分析的手段对产品质量进行了持续性分析,发现影响产品质量趋势的一些因素,并对产生的原因进行分析。结果证明趋势分析是有效的分析产品质量的手段之一,趋势分析可以显示在一定生产周期内产品的质量变化,可以发现产品质量的偏差,是企业及NRA/NCsL对生物制品日常监管的重要质量控制分析方法,对保证产品的质量和生产过程的一致性具有重要的价值。

血清白喉和破伤风抗体检测方法的建立及应用

目的建立定量检测抗白喉抗体、抗破伤风抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。方法分别用纯化的白喉类毒素、破伤风类毒素作为包被抗原,白喉、破伤风人源血清抗体标准品作为标准品,对供试品和标准品的剂量反应曲线进行拟合,以平行线法建立定量检测抗白喉抗体(Anti-DT)、抗破伤风抗体(Anti-TT)的ELISA方法。并进行方法学验证和应用研究。结果两种定量检测ELISA方法的验证结果均符合规定。定量检测Anti-DT的ELISA方法的定量限为0.084 mU/mL,回收率为97.6%,批内变异系数(CV)≤3.40%,批间CV≤5.05%;检测Anti-TT方法的定量限为0.175mU/mL,回收率为97.5%,批内CV≤2.42%,批间CV≤5.58%。应用上述两种ELISA方法,对白喉破伤风疫苗用于婴儿基础免疫后的免疫原性进行了检测分析和评价。结论所建立的白喉、破伤风血清抗体ELISA检测方法,准确度高,重复性好,适合于一般实验室开展工作,可用于白喉破伤风疫苗免疫接种后的血清学效果评价和白喉破伤风疾病的流行病学研究。

Ⅱ型B族链球菌表面免疫相关蛋白基因的克隆和原核表达

目的重组表达Ⅱ型B族链球菌表面免疫相关蛋白(Surfaceimmunogenicprotein,SIP)基因,为进一步免疫学研究提供目标蛋白。方法用PCR的方法从GBSⅡ型标准株的基因组DNA中扩增出SIP基因,用T/A克隆法将其插入pMD18T载体,构建原核表达载体pET32aSIP,用BL21(DE3)/pET系统表达TrixSIP融合蛋白,SDSPAGE和质谱分析鉴定表达产物,并对表达蛋白进行初步纯化。结果PCR扩增产物经测序,证实与GenBank中Ⅰa/c型GBS的SIP的基因序列同源性为99%。SDSPAGE显示,经IPTG诱导后BL21(DE3)/pET32aSIP总蛋白中出现一条相对分子质量为66000的新蛋白带。质谱分析和蛋白质库的比较证实其为B族链球菌表面免疫相关蛋白(SIP)的可能性分数为74。结论已成功表达并初步纯化SIP,为SIP在细菌致病中的作用研究以及相关疫苗的制备奠定了基础。

酒精性肝病的流行病学

国际疾病分类第9次修订版(ICD9)将与酒精相关的死亡原因分为慢性肝病和肝硬化、酒精依赖综合征、酒精性精神病、酒精中毒、酒精滥用、酒精性心肌病、酒精性胃炎和酒精性多发性神经病等.

百日咳杆菌分子分型方法研究进展

百日咳是由百日咳杆菌引起的一种急性呼吸道传染病，人群普遍易感，其中尤以婴幼儿多见。百日咳疫苗是预防百日咳最有效也是最经济的手段，然而，尽管世界上大多数国家自上世纪五十年代起就开始实施百日咳疫苗的免疫接种，使百日咳感染率和病死率大大下降，但据WHO统计报道，2008年全世界仍有高达i9．5万的儿童死于百日咳及其并发症，且90％的病例来自不发达国家和发展中国家。即便是发达欧美国家或百日咳疫苗接种率很高的国家，百日咳发病率也有上升的趋势，即所谓的“百日咳再现”[1]。

SEA为载体蛋白的A/C群脑膜炎奈瑟菌结合物初步免疫效果评价

目的对以金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A,SEA)为载体蛋白的A/C群脑膜炎奈瑟菌结合物的免疫效果进行初步评价。方法采用1-氰基-4-二甲氨基-砒啶四氟硼酸(1-cyano-dimethylamino pyridiniumtetrafluoroborate,CDAP)活化法,将SEA、破伤风类毒素(tetanus toxin,TT)分别与A群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖(group A N.meningitidis capsular polysaccharide,GAMP)、C群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖(group C N.meningitidis cap-sular polysaccharide,GCMP)结合制备结合物;将结合物分别免疫BALB/c小鼠,腹部皮下免疫3次,于第1针免后第9天、第19天、第27天眼眶采血,分离血清备用;检测体液免疫及细胞免疫反应水平。结果 SEA与GAMP结合后能增强抗-GAMP Ig G抗体水平,第3次免后GAMP-SEA组多糖抗体水平达到1∶12 800,高于GAMP组1∶400,但GCMP-SEA组结果不理想。SEA与GAMP结合后均能激发细胞免疫反应,IFN-γ和IL-4的SFC与GAMP组比较均升高,且IFN-γ高于IL-4。SEA与GAMP、GCMP结合后Th1/Th2细胞亚群比值分别达到23.48和22.19,高于GAMP组(14.09)和GCMP组(16.73),差异有统计学意义(P<0.05),提示SEA与GAMP、GCMP结合后可激发细胞免疫。结论 SEA与GAMP、GCMP结合后既能增强GAMP、GCMP的免疫原性,提高体液免疫反应,又能激发细胞免疫反应,提示SEA具备作为A/C群脑膜炎奈瑟菌结合疫苗载体蛋白的可行性。

抗破伤风类毒素单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗破伤风类毒素单克隆抗体,并对其进行鉴定。方法:用破伤风类毒素免疫BALB/c小鼠,经细胞融合及筛选,将阳性杂交瘤细胞株扩大培养后免疫BALB/c小鼠,收获的腹水用Protein G柱纯化;对获得的单克隆抗体进行鉴定,对杂交瘤细胞株进行稳定性检测。结果:筛选出5株稳定分泌抗破伤风类毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为T1、T2、T3、T4、T5,其分泌的单克隆抗体分别为IgG1、IgG2b、IgG1、IgG2b和IgG1亚类,轻链均为к型;均与百白破疫苗中的T抗原具有较好的反应,与D抗原、PT抗原、FHA抗原和PRN抗原无交叉反应;其中2株单克隆抗体为中和性抗体。结论:获得5株抗破伤风类毒素单克隆抗体,其中2株为中和性抗体,为破伤风疫苗效价检测新方法的建立等奠定了基础。

重组金黄色葡萄球菌肠毒素A协同增强破伤风类毒素的免疫原性研究

目的重组超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)与Al(OH)3佐剂联合应用协同增强破伤风类毒素(TT)的免疫原性观察。方法将高、低两个剂量的TT分别与高、中、低3个剂量的重组SEA同时吸附一定浓度的Al(OH)3作为样品组,同时设置高、低剂量TT分别与同样浓度Al(OH)3的吸附组作为对照;各组分别腹部皮下免疫NIH小鼠8只,0.5ml/只;免疫4周后,摘眼球采血,分离血清,检测各组抗TT抗体的IgG水平。结果在TT高剂量组,高、中剂量的SEA均能增强抗TT抗体的IgG水平(P<0.05),而低剂量SEA组与对照组相比未能增强TT的免疫原性;在TT低剂量组,3个剂量的SEA均能显著增强TT的免疫原性,P<0.05。结论 TT联合重组SEA及Al(OH)3佐剂能诱导免疫后小鼠产生更强的体液免疫应答,SEA及Al(OH)3佐剂对TT具有协同免疫增强效应。

肺炎链球菌蛋白PspC的制备与鉴定

目的对肺炎链球菌表面蛋白C(PspC)进行全基因合成、重组表达、纯化制备和鉴定。方法根据Gen Bank中Psp C的基因序列和氨基酸序列,通过密码子优化和全基因合成的方式获得目的蛋白基因,构建无标签、高效重组表达菌株,建立重组蛋白的纯化制备方法,并进行抗原鉴定及免疫原性检测分析。结果人工合成的Psp C基因序列经鉴定与预期一致,目的蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量在30%以上,经两步纯化后纯度达到95%。重组蛋白能与肺炎链球菌阳性血清产生特异性抗原抗体反应,免疫小鼠后可诱导产生较高水平的蛋白特异性抗体。结论获得了重组肺炎链球菌蛋白Psp C,其具有与天然抗原相似的抗原性和免疫原性,为今后开展疫苗研制、载体蛋白应用等研究奠定基础。

A型肉毒毒素ELISA鉴别试验方法的建立

目的建立鉴定A型肉毒毒素的ELISA鉴别试验方法以替代传统的动物试验法。方法采用现代免疫学技术,制备马源性和兔源性抗A型肉毒毒素多克隆抗体,建立了双抗体夹心ELISA,并就此初步进行方法学验证。结果所建立的ELISA具有良好的特异性、灵敏度、精密度和耐用性,具有替代动物试验方法的良好前景。结论在进一步验证和确认之后,该方法有望正式成为可用于鉴定A型肉毒毒素的试验方法以替代动物试验法。

生物制品病毒安全性控制

本文阐述了《中国药典》2020年版新增通则“生物制品病毒安全性控制”的原则和框架起草考量以及该通则的作用、地位和意义。

流感疫苗

本文阐述了当前应用的流感疫苗的安全性及有效性等问题 ,并简要介绍了新批准的佐剂处理疫苗和细胞培养疫苗 ,同时对流感疫苗今后的发展方向提出了新思路。

b型流感嗜血杆菌奈瑟球菌荚D蛋白作为载体的膜多糖C群脑膜炎-蛋白结合物的免疫效果评价

目的对b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)D蛋白(protein D,PD)作为载体的C群脑膜炎奈瑟球菌荚膜多糖(group C meningococcal polysaccharide,GCMP)-蛋白结合物进行免疫效果评价,以确定PD作为GCMP蛋白载体的可行性。方法采用1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸(CDAP)活化法,将重组PD、破伤风类毒素(tetanus toxin,TT)分别与GCMP结合制备结合物;将GCMP及结合物分别经腹部皮下免疫雌性BALB/c小鼠,分为GCMP、GCMP-PD、PD、GCMP-TT、TT及阴性对照(生理盐水)组,每组12只,共免疫3次,分别于每次加强免疫前及末次免疫后7 d,经眼眶采血,分离血清,用于抗体水平检测及血清杀菌力试验(serum bactericidal assay,SBA);同时在末次免疫后7 d取脾脏,进行细胞免疫水平检测。结果蛋白与GCMP结合后能增强抗-GCMP抗体IgG水平,第3次免疫后,与单独GCMP组相比,GCMP-PD和GCMP-TT组小鼠血清抗-GCMP IgG水平均显著升高(F分别为5.294、14.917,P均<0.05),且产生免疫记忆,诱导IgG1产生,但GCMP-PD组低于GCMP-TT组(F=5.828,P<0.05);CMP-PD、PD组小鼠血清抗-PD IgG抗体水平各次免疫后均显著增长,第3次免疫后,GCMP-PD组抗-PD IgG抗体水平显著高于PD组(F=15.426,P<0.01),而GCMP-TT组低于TT组(F=211.207,P<0.001)。SBA结果显示,GCMP-PD组杀菌抗体滴度高于GCMP组(F=11.797,P<0.05),但低于GCMP-TT组(F=8.688,P<0.05)。流式细胞术结果显示,GCMP-PD组Th1、Th2细胞亚群比值与GCMP及GCMP-TT组相比,差异均无统计学意义(F分别为0.073、3.021,P均>0.05)。结论重组PD与GCMP结合后,既能增强多糖疫原性,提高体液免疫反应能力,也能激发细胞免疫反应,同时免疫后血清杀菌效果显著,提示PD具备作为GCMP蛋白载体的可行性。

不同类型细胞对A型肉毒毒素效价检测的可行性分析

目的 分析4种连续细胞和1种人神经元细胞对A型肉毒毒素(botulinum neurotoxin type A,BoNT/A)效价检测的适用性,为高敏感性BoNT/A细胞检测方法的建立提供依据。方法 采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(quantitative reverse transcriptase chain reaction, qRT-PCR)对4种连续细胞中BoNTs毒性相关蛋白受体和N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor, SNARE)进行定量检测,并用Western blot评估4种连续细胞和1种人神经元细胞对BoNT/A的敏感性。结果 qRT-PCR结果显示,4种连续细胞中除突触囊泡蛋白2B(synaptic vesicle protein 2B,SV2B)不表达或表达量较低外,其他BoNTs相关蛋白受体和SNARE蛋白均有较高的表达。Western blot结果显示,4种连续细胞对BoNT/A的敏感性依次为人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)、大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12)、人神经母细胞瘤细胞(SH-5Y5Y)、人神经母细胞瘤细胞[BE(2)-M17]。在SK-N-SH中,孵育0.1 mg/mL的三唾液神经节苷脂GT1b(Trisialoganglioside GT1b, GT1b),5 000 U/mL BoNT/A可切割45%突触小体相关蛋白25(synaptosome-associated protein of 25 000,SNAP25)。Western blot检测发现,1种人神经元细胞对BoNT/A较敏感,在约100 U/mL时达到50%的SNAP25裂解。结论 人神经元细胞敏感性优于其他4种连续细胞,在建立BoNT/A细胞学检测方法中具有一定的潜力。

脂肪肝的流行病学研究进展

脂肪肝是一种常见的临床现象,但不是一种独立的疾病.正常人的肝脏中,脂质含量占肝湿重的2%～4%,其中磷脂占50%以上,甘油三酯(TG)占20%,游离脂肪酸(FFA)占20%,胆固醇约占7%,其余为胆固醇酯.当肝细胞内脂质蓄积超过肝湿重的5%,或组织学上每单位面积有 1/3以上肝细胞脂肪变时,称为脂肪肝[1].