293T细胞生产慢病毒工艺优化

随着细胞治疗的快速发展,大规模慢病毒的生产成为工艺环节中的瓶颈,因此,优化293T高滴度和高纯度的CAR慢病毒载体生产工艺显得至关重要。本研究旨在优化包装慢病毒的293T贴壁细胞,节省时间,节约成本,提高慢病毒包装的能力。同时对优化慢病毒载体中出现悬浮细胞结团生长的现象进行探索,检测其影响结团的因素。分别采用快速、慢速驯化方式将293T贴壁细胞驯化为悬浮培养,并比较其细胞形态、细胞密度、细胞活率、慢病毒包装能力和冻存复苏后稳定一致性,筛选出最优的悬浮驯化条件。通过调节Ca^(2+)浓度和EDTA添加量来研究比较细胞结团生长状况。结果证明,使用无血清培养基OPM-293 CD05溶剂(medium)可以将293T贴壁细胞快速驯化为293T悬浮细胞,并能制备出慢病毒滴度且优于贴壁细胞的包装滴度(^(*)P<0.05)。Ca^(2+)浓度会影响细胞结团大小,添加EDTA能有效分离分散非必要的细胞抱团生长。研究结果显示,传统293T贴壁细胞可以使用无血清培养基OPM-293 CD05溶剂快速驯化成悬浮细胞;在一定范围内,Ca^(2+)浓度越高细胞所结团块及粒径越大,EDTA添加量越高细胞所结团块及粒径变小。这为优化慢病毒载体包装工艺和悬浮培养条件,同时为体外规模化细胞培养放大和生产奠定了理论基础,具有一定的实用价值。

芦台春酱香型白酒酿造过程中真菌菌群多样性及代谢分析

该研究采用高通量测序技术对天津芦台春酱香型白酒发酵过程中不同轮次出窖酒醅的真菌群落结构进行研究,并对其与理化因子、挥发性风味成分相关性分别进行典范对应分析(CCA)及偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。结果表明,随着轮次的增加,真菌菌群的多样性升高,而丰度先升高后降低;酵母菌是白酒发酵过程中的主要真菌,但相对丰度逐步降低,在属水平上以伊萨酵母属(Issatchenkia)为主,其相对丰度由第一轮次的97.48%逐渐下降至第七轮次的3.53%。相关性分析结果表明,总酸、还原糖和酒精度是窖池发酵微生物演替的重要理化因子;伊萨酵母属(Issatchenkia)与乙酸乙酯、乙酸异戊酯、异戊醇等相关性较大;哈萨克斯坦酵母属(Kazachstania)、丝衣霉属(Byssochlamys)、罗萨氏菌属(Rasamsonia)、复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)等与正己酸乙酯、庚酸乙酯、3-羟基丁酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、油酸乙酯、乙醇等相关性较大;而Leiothecium、未分类的酵母目(unclassified_o__Saccharomycetales)、Apiotrichum、Cutaneotrichosporon等则对壬酸乙酯、乙酸苯乙酯、正己醇、2,3-丁二醇、糠醇、糠醛等的形成起到重要作用。

靶向CD99的CAR-T细胞扩增优化研究

背景与目的:嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T,CAR-T)细胞疗法对血液和淋巴系统肿瘤的治疗效果显著,但对实体瘤效果较差,这与靶点选择的因素有关。针对尤因肉瘤(Ewing sarcoma,ES),CD99可作为CAR-T细胞潜在的靶点。由于T细胞自身表达CD99蛋白,靶向CD99的CAR-T细胞存在体外扩增能力有限的问题。本研究旨在通过增加CD99敲低的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)、优化慢病毒转导的感染复数(multiplicity of infection,MOI)、筛选培养CAR-T细胞的培养基及培养容器,以获得CD99 CAR-T细胞制备的最优条件。方法:筛选shRNA序列,提高CD99 CAR-T细胞的扩增能力。采用不同的MOI、培养基和培养容器,分别检测在不同条件下CAR-T细胞的转导效率、细胞存活率、增殖能力、特异性杀伤能力及干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)释放水平等,筛选出最优的细胞制备条件。结果:通过shRNA敲低得到的KO-CD99 CAR-T细胞扩增水平显著高于CD99 CAR-T细胞[(16.40±0.40)vs(6.33±1.53),P<0.01]。转导MOI为0.25~1.0、培养基为OptiVitro时细胞的扩增效果最优。在透气瓶中培养的CAR-T细胞扩增倍数显著高于在培养袋中培养的细胞[MOI=0.25:(50.23±3.32)vs(13.02±4.82);MOI=0.50:(49.96±0.83)vs(18.25±2.88);MOI=1.00:(48.27±5.08)vs(13.16±6.26);P<0.01],且细胞分型更优、特异性杀伤更高。结论:通过shRNA技术得到的KO-CD99 CAR-T细胞可实现稳定扩增。从扩增条件优化结果看,MOI为0.25~1.00,培养基为OptiVitro,培养容器为透气瓶的条件下,KO-CD99 CAR-T细胞可获得更优的扩增能力、更多比例的记忆T细胞,为后续开展CD99 CAR-T细胞治疗ES的临床试验奠定了坚实基础。

17种中草药体外抗炎作用研究

采用超声提取法利用水和乙醇分别获得17种中草药的水和醇提物,将其作用于脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞模型,通过检测提取物对细胞存活率和炎症介质一氧化氮(NO)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(1L-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响,综合评价其抗炎效果,并研究其作用机制。结果表明:黄花蒿、冷蒿、白头翁、龙蒿、白鲜果皮、多叶棘豆、斜茎黄耆种皮、灵芝菌棒、苍术根须、山韭醇提物和黄花蒿、冷蒿、广布野豌豆、东北珍珠梅、苍耳、茜草水提物无细胞毒性;通过评估无细胞毒性醇和水提物抗炎活性,最终证明冷蒿水提物具有更好的抗炎作用,可显著降低IKKβ、p65和IKKα表达量,揭示了其可通过调控NF-κB通路发挥抗炎作用。本试验结果为冷蒿防治畜禽细菌性肠炎的研发及应用提供理论依据。

基于网络药理学和分子对接分析赤芍抗氧化应激作用的活性成分及其机制

【目的】利用网络药理学及分子对接技术分析赤芍抗氧化应激作用的有效活性成分及其分子机制。【方法】运用TCMSP数据库搜集赤芍的活性成分和靶点,借助UniProt数据库对靶点进行基因名转化;通过GeneCards和OMIM数据库检索氧化应激的相关基因,利用Veeny在线平台获得赤芍与氧化应激的交集靶点,将交集靶点上传至STRING数据库和Cytoscape 3.8.0软件建立蛋白互作(PPI)网络图和赤芍-靶点-氧化应激可视化网络并进行拓扑学分析,筛选关键靶点;运用Metascape数据库对关键靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析,确定赤芍发挥抗氧化应激作用的活性成分和信号通路;运用AutoDock和PyMol软件对赤芍发挥抗氧化应激作用的核心靶点进行分子对接验证。【结果】共筛选到12个赤芍活性成分,包括黄芩素、β-谷甾醇、鞣花酸、豆甾醇、(+)-儿茶素等;赤芍活性成分与氧化应激靶点分别有76和4873个,其中赤芍与氧化应激交集靶点共69个,包括蛋白激酶B(AKT1)、转录因子AP-1(JUN)、细胞肿瘤抗原p53(TP53)、肿瘤坏死因子(TNF)和半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)等;GO功能和KEGG通路富集结果提示,赤芍抗氧化应激与磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)、核因子κB(NF-κB)等多个信号通路有关;分子对接结果表明,赤芍主要活性成分黄芩素、β-谷甾醇与核心靶点有较好的结合能力。【结论】赤芍可能通过黄芩素、β-谷甾醇、鞣花酸等活性成分调控PI3K-Akt、NF-κB、白细胞介素-17(IL17)等信号通路中的关键靶点来发挥抗氧化应激作用。

代谢工程改造大肠杆菌生产氢咕啉酸

维生素B_(12)是唯一含有金属离子的维生素,其合成途径尤为复杂。大肠杆菌工程菌是生成维生素B_(12)的新菌种。氢咕啉酸作为维生素B_(12)合成途径重要的稳定中间体,通过代谢工程提高大肠杆菌氢咕啉酸的产量具有重要意义。经过不同宿主的对比发现BW25113(DE3)是生产氢咕啉酸的合适宿主。利用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术将氢咕啉酸生物合成基因在染色体上表达,氢咕啉酸产量提高12倍,达到6.38 mg/L。增加前体尿卟啉原Ⅲ供应,氢咕啉酸产量再次提高,达到11.61 mg/L。敲除ackA-pta对氢咕啉酸产量提高没有效果。经过引入运动发酵假单胞菌来源的Entner-Doudoroff途径提高还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)水平,1株无抗菌株的氢咕啉酸产量提高到14.60 mg/L。该研究为大肠杆菌高效生产维生素B_(12)奠定了基础。

长链非编码RNA MALAT1的研究进展

长链非编码RNA(Long noncoding RNAs,lnc RNAs)是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子,它们并不编码蛋白质,而是以RNA的形式在转录水平、转录后水平、表观遗传学修饰等多种层面上调控基因的表达。肺癌转移相关转录本1(Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)首先在非小细胞肺癌被发现,并引起学者关注。MALAT1定位于染色体11q13.1,具有高度保守性。近年来,研究发现,MALAT1能特异性招募SR蛋白家族成员,并参与表观遗传调控以及细胞周期调控等;MALAT1高表达于多种肿瘤中,促进肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭。此外,最近发现MALAT1在血管生成过程中发挥重要作用。主要对MALAT1的特性、作用机制,以及在肿瘤和血管系统的作用作一系统综述。

益生菌的分类、生理功能与有效性评价研究进展

益生菌是对宿主健康有益的活的微生物,大量研究结果表明益生菌在消化道、免疫和心血管系统等诸多健康方面发挥了作用。综述了益生菌的分类与生物学特性,以及益生菌调节血脂、降血压、降血糖、抗过敏和调节免疫功能的研究进展,并对其黏附或定植评价、活性保护技术及代表性商业产品进行了介绍,以期为开展益生菌相关研究开发工作提供一定的帮助。

双频超声对红薯淀粉结构和性质的影响

研究了单频40 kHz、80 kHz以及双频40 kHz+80 kHz超声处理对红薯淀粉结构和性质的影响。扫描电镜分析表明,超声处理能够使淀粉颗粒表面出现损伤甚至有孔洞出现。红外光谱分析表明,超声作用没有改变淀粉的分子基团,但破坏其结晶结构,使红外结晶指数下降。淀粉-碘复合物吸收光谱分析表明,超声破坏淀粉支链结构和淀粉长链,直链淀粉含量增加。Brabender曲线表明,淀粉经超声处理后黏度降低,双频超声处理后的淀粉峰值黏度比原淀粉降低15.66%。此外,超声处理后淀粉的透明度提高,双频超声处理30 min时,透射比最大,比原淀粉增加5.3%,但是随着超声时间继续增加,透明度呈现减小的趋势。单频40 kHz、80 kHz和双频40 kHz+80 kHz比较,双频超声处理对淀粉的结构和性质影响效果最明显,80 kHz次之,40 kHz影响程度最小。

元宝枫油的超声提取及其萌发前后神经酸含量分析

以元宝枫种仁为研究对象,油脂得率为评价指标,通过超声功率、超声时间、料液比单因素实验,建立元宝枫油超声提取方法。同时优化元宝枫种子萌发温度,利用气相色谱法分析了萌发前后种仁油中神经酸含量的变化,并通过MTT法分析了萌发前后元宝枫种仁油对神经细胞的影响。结果表明:通过单因素确定的最佳提取工艺条件为:超声功率200 W、超声温度25℃、料液比1∶12。元宝枫种子人工萌发的最佳温度是4℃,气相色谱分析显示萌发后元宝枫种仁油中神经酸含量显著上升,可达萌发前的1.5倍。结果显示元宝枫种仁油能够促进神经细胞的增殖,且萌发后的种仁油作用更强。

MALAT1通过竞争miR-124上调SMYD3并促进乳腺癌细胞增殖与迁移

为了探究lncRNA MALAT1是否会通过与组蛋白甲基化酶SMYD3间的相互调控对乳腺癌细胞的增殖和迁移产生影响,采用siRNA敲低MCF-7、MDA-MB-231乳腺癌细胞中的内源性MALAT1后,然后应用划痕和MTT法检测细胞迁移和增殖情况;实时定量PCR(RealtimePCR)、免疫蛋白印迹(Westernblot)等方法检测si-MALAT1对miRNA-124、SMYD3及其下游基因mRNA及蛋白质水平的影响。结果显示:siRNA靶向敲低MALAT1后可降低乳腺癌细胞的迁移和增殖速度,同时抑制SMYD3及其下游靶基因N-cadherin、MYL9、MMP9、CYR61等的转录表达,并上调miR-124。miR-124的过表达可降低SMYD3在乳腺癌细胞中的表达,且MALAT1的敲低可以缓解miR-124抑制剂对SMYD3蛋白质水平表达的促进作用。此外,转染外源质粒使SMYD3过表达可激活MALAT1转录,反之siRNA干扰SMYD3后则会下调MALAT1。研究结果表明:lncRNAMALAT1可以作为miR-124的ceRNA调控SMYD3,同时SMYD3可反馈性激活MALAT1的转录,这一相互调控作用将影响到乳腺癌细胞的增殖与迁移能力。

六株乳杆菌胃肠道定植能力分析

目的分析确定Lactobacillus Acidophilus(L.acidophilus)1.1等六株乳杆菌胃肠道定植能力强弱。方法通过模拟人体胃酸环境(pH 3)和高胆盐环境(胆盐含量:0.1%～0.3%),及用胶原蛋白和人结肠癌细胞SW-480模拟人肠道黏附环境,利用MTT法分别测定六株乳杆菌在酸性和高胆盐环境下37℃作用4 h后的存活菌率及与黏附介质作用1 h后的黏附率。结果六株乳杆菌均具有一定的耐酸和耐胆盐能力,以及不同程度的胶原蛋白及肠道细胞黏附能力,其中以L.acidophilus 1.2相对最为突出。结论 L.acidophilus 1.2等六株乳杆菌均能够不同程度的黏附定植在胃肠道中,发挥其益生作用,是较为理想的胃肠道微生态制剂候选菌株。

黑曲霉糖化酶基因的克隆及其在毕赤酵母X33中的表达

[目的]以毕赤酵母（Pichia pastoris）X33为宿主菌高效表达黑曲霉（Aspergillus niger）糖化酶,为进一步扩大糖化酶在工业上的应用奠定基础。[方法]利用RT-PCR技术,提取黑曲霉总RNA进行反转录,以得到的cDNA为模板,根据NCBI数据库中A.nigerCBS513.88糖化酶的cDNA序列（glaA）设计引物,通过PCR扩增得到去除天然信号肽的糖化酶成熟肽编码基因glaAm,并将其克隆到pUC19载体中,序列分析表明,glaAm的开放阅读框由1 879个核苷酸组成,编码625个氨基酸。以此片段构建了pFLDα-glaAm重组表达载体,经NsiI线性化后,电击转化毕赤酵母X-33。摇瓶培养中通过添加终浓度为0.5%的甲醇诱导糖化酶的分泌。[结果]SDS-PAGE和Starch-PAGE显示,糖化酶得到正确的分泌表达,且具有较高的生物活性,发酵上清液中酶活最高达到380.78 U/ml（发酵液）。重组糖化酶的最适反应温度和最适pH分别为6065℃和4.0,在pH2.55.5范围内均保持90%以上的酶活力。该酶具有较高的热稳定性,pH4.0条件下,该酶在50℃下稳定;60℃处理60 min,仍能保持90%以上的酶活力;65℃下的半衰期约为44 min。[结论]黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母X33中得到了异源高效表达。

功能因子角鲨烯胞内抗氧化作用的研究

通过添加脂质过氧化诱导剂对细胞内部的抗氧化研究。细胞培养36 h和0 h时加入双氧水,cumenehydroperoxide(CHP),t-butyl hydroperoxide(t-BuOOH)和茉莉酸甲酯等可引发脂过氧化的诱导剂,运用硫代巴比妥反应物法测定细胞中的丙二醛(MDA)含量,平板计数的方法计算细胞存活率。结果表明:低浓度的诱导剂均未引发脂质过氧化现象,高浓度的诱导剂导致细胞死亡。细胞内部没有发生脂质过氧化反应,说明破囊壶菌富含的角鲨烯发挥了抗氧化作用,同时可以证明脂质过氧化并不是导致破囊壶菌细胞死亡的原因。

新型数字化高灵敏度荧光显微镜及其在生物学中的应用

尽管普通荧光显微镜已广泛应用于生物医学领域，其性能上还存在一些不足，为了克服它的弱点，借助于像增强器和ＣＣＤ，将倒置生物显微镜改造为数字化高灵敏度荧光显微镜，并增加动态图像获取功能。改进后的荧光显微镜具有以下优点：（１）灵敏度极高，可探测微弱的荧光图像；（２）运用图像融合技术，实现荧光准确定位；（３）适合于观察切片和活细胞；（４）可研究细胞荧光图像的动力学特征；（５）能够给出图像上各点的坐标和对应的发光强度，具有定量显示特点；（６）图像处理软件功能完善，操作方便。利用该荧光显微镜，以吖啶橙为荧光标记物观察正常细胞和凋亡细胞的不同状态，获得良好的实验效果。

三氧化二砷诱导细胞凋亡对线粒体的影响

线粒体作为细胞能量的“动力工厂”，在细胞的生理过程中起着重要的作用，本文采用三氧化二砷（Ａｓ２ Ｏ３） 诱导ＭＧＣ－ ８０３ 细胞凋亡，通过罗丹明１２３ 和Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３２５８ 对细胞进行荧光标记，利用具有光子计数成像能力的超高灵敏度荧光显微镜观察凋亡细胞与未加入Ａｓ２ Ｏ３ 的对照组细胞的区别，发现Ａｓ２ Ｏ３

放大培养对岩黄连细胞悬浮培养的影响

为了优化岩黄连细胞悬浮培养的条件,研究了在放大培养过程中,岩黄连细胞生长与主要营养成分的代谢动力学,以及生物碱的产生情况。结果表明,在不同培养体系下,细胞生长曲线均呈现"S"型。随着培养体积从50、100 mL放大到500 mL和1 L,培养液中碳源、氮源和磷源的消耗减慢,细胞生物量减少,生物碱产量降低。其中100 mL培养体系所获生物量最高,达到15.2 g/L,生物碱产量也最高,脱氢卡维丁为8.35 mg/mL,小檗碱为4.58 mg/mL。根据本文结果,提出了岩黄连细胞培养条件的优化和大规模细胞培养生产岩黄连生物碱应采取的策略。

嗜碱芽孢杆菌PB92碱性蛋白酶基因启动子的克隆及应用

利用TAIL-PCR方法从嗜碱芽孢杆菌PB92基因组中扩增出碱性蛋白酶基因上游启动子活性片段,测序分析后登录GenBank(EU130686)。此序列具有多个启动子特征区域,且在-538～-370 bp和-275～-128 bp两个区域存在反向读码框。对启动子片段进行功能缺失的分析结果表明,TSS上游105 bp片段具有明显启动子活性,但以长为414 bp～619 bp时活性更为显著。此外,对PB92碱性蛋白酶的信号肽分析结果表明,此信号肽具有典型分泌型(Sec-type)信号肽结构。将PB92碱性蛋白酶基因启动子和信号肽序列克隆入pBE2,构建成表达载体pBEAC,并以其为载体实现了植物甜蛋白monellin基因在枯草芽孢杆菌1A751中的高效表达。

表皮生长因子受体及PI3K在硫酸锌诱导人呼吸道上皮细胞间粘附分子-1表达过程中的作用

目的探讨硫酸锌对上皮细胞内细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的影响及其分子生物学机制。方法应用PCR与蛋白质免疫印迹试验检测硫酸锌诱导人呼吸道上皮细胞ICAM-1mRNA与蛋白的表达,以及表皮生长因子受体(EGFR)及PI3K的活化。结果硫酸锌可诱导ICAM-1mRNA与蛋白的过量表达。在同一试验条件下,硫酸锌可诱发EGFR及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)下游激酶Akt的磷酸化或活化。用EGFR抑制剂(PD153035)及PI3K抑制剂(LY294002)预处理上皮细胞,可明显抑制硫酸锌对ICAM-1表达的诱导作用。结论硫酸锌可激活EGFR与PI3K/Akt信号传导通路,进而上调ICAM-1的表达。

PKCα抑制剂Calphostin C抑制TNF-α诱导的骨髓间充质干细胞迁移

肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)可以诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的迁移,但其促进迁移机制尚不清楚.研究使用Calphostin C抑制剂来抑制PKCα的活性,从而研究TNF-α诱导MSCs迁移的作用是否通过激活PKCα来完成.利用50,ng/m L的TNF-α处理MSCs,划痕实验和Transwell实验表明TNF-α可以诱导MSCs的迁移.加入PKCα的抑制剂Calphostin C后,可以抑制TNF-α对MSCs迁移或侵袭的诱导,并降低迁移标志基因MYL9(Myosin light chain 9,MYL9)、CYR61(Cysteine rich 61,CYR61)的表达.以上结果表明,PKCα抑制剂Calphostin C可以抑制TNF-α诱导的MSCs迁移.