猪圆环病毒病

猪圆环病毒病主要以消瘦、呼吸困难、皮肤苍白、生长停滞、腹泻、淋巴结先肿大后萎缩等为特征,且和多种综合病症有关。鉴于其呈世界性分布的态势和对养猪业已经造成的严重影响,文章简介了猪圆环病毒引起的相关的疾病,鉴别诊断方法以及预防控制的研究进展和成果。

近年西尼罗热在美国爆发流行对我国的启示

西尼罗热是由西尼罗热病毒 (west nilevirus,WNV)引起的 ,临床以发生脑脊髓炎为特征的一种人和动物共患的虫媒病毒病。在欧洲、中东、西亚、中亚和非洲均有发生 ,其对人类健康和畜牧业生产安全 ,以及生态环境造成了极大的威胁和影响 ,美国自 1 999年 8月从多种死亡野鸟、马、蚊子和人脑炎病例中分离出病毒以来 ,已经投入几亿美元用于开展此病的调查研究和防制 。

警惕北美新发现的疫病-犬流感

美国相关机构和养犬者正在担心一种新出现的犬流感病毒会在北美蔓延.该病毒引起急性呼吸道感染,在赛犬场、保护动物协会的犬庇护所、宠物寄养园和兽医诊所等犬活动的场所发生流行,有些赛犬场和宠物饲养园被强令关闭几周进行清洗消毒.美国目前已经出现此病的有阿拉巴马、阿肯色、亚利桑那、科罗拉多、佛罗里达、爱荷华、堪萨斯、麻省、罗得岛、德克萨斯、纽约和西弗吉尼亚等地区,引起世界广泛关注.

牛传染性胸膜肺炎的研究进展

牛传染性胸膜肺炎(CBPP)由霉形体引起,以肺小叶淋巴结缔组织和肺泡组织发生浆液纤维素性炎症和发生浆液纤维素性胸膜炎为特征.由于其引起的经济损失非常重大,国际兽疫局(OIE)将其定为A类疾病.该病目前在非洲的撒哈拉地区许多国家流行,在乌干达、肯尼亚等70年代已消灭了此病的国家又重新出现,对其他国家构成严重威胁.

2006-2008年江苏地区不同宿主感染空肠弯曲菌及其耐药性

目的检测2006-2008年江苏地区鸡、水禽、奶牛、丹顶鹤、猪、实验猴等标本感染空肠弯曲菌及其耐药性。方法采用APICampy System进行生化与分类鉴定,结合弯曲菌多重PCR检测方法对来自江苏地区的禽、牛、猪、猴3 010份标本,检测分离株及其耐药性。结果共检测样本3010份,402份空肠弯曲菌阳性,阳性率13.36%,其中家禽样阳性率15.83%(258/1630);水禽10.40%(52/500);奶牛7.65%(39/510);猪18.75%(30/160);猴15.00%(15/100);丹顶鹤12.50%(10/80);糜鹿0%(0/30)。选择不同宿主来源的108株对10大类27种抗生素高度敏感率的是:氯霉素100%、阿莫西林99.07%、阿米卡星92.59%、头孢噻肟91.67%、阿齐霉素90.74%;高度耐药率的是:头孢哌酮99.07%、复方新诺明99.07%、头孢孟多99.07%、磺胺甲基异噁唑97.22%、头孢拉丁91.67%。结果显示,108株分离株的耐药主要集中在9耐～20耐,占85.19%,猪分离株的多重耐药性较其它宿主来源分离株严重。结论江苏地区空肠弯曲菌的流行和耐药状况呈现多样化和复杂化,不同宿主来源分离株耐药性和多重耐药性存在差异。

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒多重PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因序列、猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因和猪博卡病毒(PBoV)NP1基因序列,设计合成3对引物。通过优化反应条件,对TGEV、PEDV RNA反转录获得的cDNA模板和PBoV的DNA模板进行多重PCR扩增,同时得到3条与试验设计相符的1 060bp(TGEV)、462bp(PEDV)及258bp(PBoV)特异性条带,建立了同时检测TGEV、PEDV和PBoV的多重PCR方法。结果表明,在同一PCR反应体系中,可以同时检测这3种病毒核酸片段,而对其他病毒的检测均为阴性;敏感性分析表明,该方法的最低检测限分别为35、20、10pg的核酸。采用该方法对60份临床样品进行检测,TEGV阳性率为1.6%,PEDV阳性率为6.7%,PBoV阳性率为21.7%,表明建立的方法可以应用于临床检测。

实时荧光RT-PCR检测冷冻草莓中诺如病毒

目的建立冷冻草莓中的GI、GII型诺如病毒实时荧光RT-PCR检测方法,并应用于实际样品的检测。方法对草莓样品进行前处理、病毒富集、病毒RNA的提取和纯化,然后采用实时荧光RT-PCR进行检测。结果核酸提取方法能够有效地去除抑制因子,同时对104份送检样品进行检测,结果均为阴性。结论所建立的核酸提取与实时荧光RT-PCR结合的检测体系适合于草莓样品中诺如病毒GI、GII型的检测。

牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)保守基因gB和gE序列,分别设计两对引物及其相应的TaqMan探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释的病毒进行扩增以检测其灵敏度,同时对伪狂犬病病毒(PRV)、马立克病病毒(MDV)、鸭瘟病毒(DPV)进行特异性检测。结果显示,建立的扩增gB和gE基因的荧光PCR可用于检测IBRV,其灵敏度为0.02 TCID50,而与PRV等非IBRV无交叉反应。本研究所建立的荧光PCR具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,可用于IBRV的检测。

口蹄疫病毒实时RT-PCR检测方法的建立

目的用TaqMan技术建立了一种实时RT-PCR的方法,用于检测口蹄疫病毒,并优选出最佳检测样品。方法设计合成一套引物和TaqMan探针,通过反应条件的优化,建立实时RT-PCR的方法,以扩增口蹄疫病毒的3D基因,并用该法检测患病仔猪的气管、前肢肌肉、皮肤、舌、颈浅淋巴结、脾脏、喉头、食管、腹股沟淋巴结、肺脏、扁桃体、肝脏、肾脏、胸肌、心脏、鼻黏膜、后肢肌肉、脑、骨髓、软腭和血清等样品。结果(1)该方法检测FMDV下限为0.01TCID50,其敏感性比普通RT-PCR高100倍,并具有较好的特异性和重复性,(2)FMDV感染仔猪血清、淋巴结、扁桃体和肝脏中病毒含量较高是检测口蹄疫病毒很好的样品。结论建立了一种实时RT-PCR检测口蹄疫病毒的方法。

牛传染性鼻气管炎病毒套式PCR检测方法的建立

利用套式PCR技术建立一种快速检测牛传染病鼻气管炎病毒(bovine infectious rhinotracheitis virus,IBRV)并能区分野毒株和gB基因缺失疫苗的方法。根据基因库中牛传染性鼻气管炎病毒的gB和gE基因序列,应用pri mer5.0软件设计了gB/BN和gE/EN的2套套式PCR引物,分别对IBRV标准株进行PCR扩增,结果表明,这2套引物均能扩增出与设计目的片段大小一致的特异性条带;用此引物对同属的伪狂犬病毒、马立克氏病毒、鸭瘟病毒进行扩增,具有良好的特异性。引物gB/BN和gE/EN的检测灵敏度分别为0.01TCID50和0.1TCID50。

鉴别牛5种重要病毒的LAMP-基因芯片方法的建立

为建立牛的主要疫病的快速、准确及高通量鉴别诊断技术,以赤羽病病毒(AKV)、牛白血病病毒(BLV)、蓝舌病病毒(BTV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和小反刍兽疫病毒(PPRV)5种牛传染病病原为研究对象,将LAMP技术与微流控芯片技术有机结合,建立了相应的基因芯片检测技术,并优化了该基因芯片的反应条件。结果表明,建立的基因芯片可同时检测上述5种病原,特异性好,60 min反应时间即可给出检测结果。其中AKV和PPRV的敏感性为10~3 copies/μL,BLV的敏感性为10~5 copies/μL,BTV和BVDV的敏感性为10~2 copies/μL,与LAMP检测的敏感性一致。成功建立了基于LAMP技术的5重RT-LAMP基因芯片,可同时快速准确检测上述5种病毒,为口岸检疫探索出一种能快速、高通量检测动物疫病的方法。

多重PCR检测PRV、PPV、PCV方法的建立及其应用

根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病病毒(PRV)的gE、gI基因序列、猪细小病毒(PPV)的E蛋白的基因序列、II型猪圆环病毒(PCV-2)的ORF2基因序列,分别设计并合成3对能特异性扩增PRV、PPV、PCV-2的引物,通过DNAstar软件分析这3对引物不存在cross d im er。建立了PCR方法分别检测PRV、PPV、PCV-2,然后通过条件的优化,建立了PCR同时检测PRV、PPV、PCV-2的方法并研制出试剂盒。对试剂盒的特异性和有效期进行了研究。结果表明,该试剂盒具有很好的特异性,有效期在-20℃至少可以保存1年。

猪胸膜肺炎放线杆菌血清8型菌株的分离鉴定及耐药性研究

为了确定引起2018年5月江苏泰州某规模化养猪场育肥猪发病死亡的病原,本试验无菌采取病死猪肺脏组织,通过病原分离培养、染色观察、生化试验、PCR扩增等方法进行鉴定,随后对分离菌株进行致病性和耐药性试验。结果显示,该分离菌株在病原分离培养过程中,需在含有NAD的培养基中才能生长;该分离菌通过革兰氏染色,显微镜观察细菌呈红色,可判定新分离的菌株为革兰氏阴性菌;根据生化试验和PCR结果可判定该分离菌株为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌;PCR血清型分型结果显示,分离菌株为猪胸膜肺炎放线杆菌血清8型菌株;小鼠毒力试验结果显示,当分离株菌液浓度达到3×10^8 CFU/mL时便可引起BALB/c小鼠死亡,浓度为2×10^9 CFU/mL时对BALB/c小鼠的致死率达到100%,表明该分离菌株对BALB/c小鼠有较强的致病力及致死性;药敏试验结果表明,该分离菌株对头孢噻吩、头孢噻肟、氨曲南、头孢吡肟、头孢曲松、氧氟沙星等14种抗菌药物高度敏感,对氨苄西林中度敏感,对链霉素耐药。综合以上试验结果表明该猪场存在猪胸膜肺炎放线杆菌血清8型菌株感染情况。

1株牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定

在对进口种用奶牛隔离检疫期间,从1头IBRV中和抗体阳性奶牛中分离出1株病毒。该分离株表现类似于IBRV特征的细胞病变,细胞圆缩,聚集成葡萄串样群落,在单层细胞上形成空洞。用特异性抗IBRV阳性血清与其进行中和试验,发现IBRV标准阳性血清对分离株的中和抗体滴度为27,与IBRV标准株的中和抗体滴度相差不到1个滴度。用OIEV推荐的IBR特异性引物对分离病毒进行PCR扩增,获得与设计基因片段大小一致的特异性条带,表明分离到的病毒为IBRV。

欧洲控制猪圆环病毒病项目简介

猪圆环病毒病（Porcine Circovirus Diseases，PCVD）在欧洲每年使养猪业损失6亿欧元，在北美造成的损失是每周l千万美元。为此，欧盟第六个框架纲要的食品质量和安全分计划资助项目（项目号513928）“猪圆环病毒病的控制：促进食品质量和安全（The Control of Porcine Circovirus Diseases，PCVDS）：

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的遗传变异分析

从GenBank中随机选取25株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的全基因序列进行同源性分析并构建了基因进化树,同时对PRRSV ORF7基因序列进行遗传变异分析,发现PRRSV美洲株之间或欧洲株之间的ORF7基因相对保守,但美洲株和欧洲株的ORF7基因的核苷酸及氨基酸同源性较低。说明建立的针对N蛋白的多种检测方法在高致病性PRRSV肆虐的现今仍具有实用性。

猪繁殖与呼吸综合征病毒实时PCR检测方法的建立

设计合成了一套引物和TaqMan探针,以扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒的核衣壳蛋白基因,通过反应条件的优化,在国内首次建立了快速定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的实时PCR方法,并用该法检测患病猪的肺脏等样品。结果表明该方法具有较好的特异性和重复性,对PRRSV细胞培养物的检测下限为0.01TCID50,敏感性比常规RT-PCR高100倍;对10份PRRS疑似猪肺脏样品检测5份为阳性,与病毒分离的阳性符合率为100%。该方法具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,在PRRSV的早期检测、预防控制、进出口检疫及基础研究中会起到重要作用。

含GFP-Lac Z基因的伪狂犬病病毒上海株缺失株的构建

在伪狂犬病病毒 (PRV)上海株gI和gE基因克隆鉴定的基础上 ,用BamHⅠ +BstpⅠ去掉gE基因的 5′端 36 3bp ,在缺失位置插入绿色荧光蛋白 (GFP)和LacZ基因 ,构建含双报告基因的PRV SH转移载体pgEI GFPZ。将pgEI GFPZ转染PRV SH的BHK 2 1细胞 ,待出现 80 %病变后收获病毒 。

空肠弯曲菌鞭毛蛋白单克隆抗体的制备

目的为获得空肠弯曲菌鞭毛蛋白单克隆抗体,用于空肠弯曲菌的检测和研究。方法用空肠弯曲菌ATCC29428株灭活全菌作为抗原,免疫BALB/c小鼠,待抗体水平达到1∶51 200时,取脾细胞与生长良好的对数期Sp2/0进行融合。同时以粗提天然鞭毛蛋白和人工表达重组鞭毛蛋白包板,用间接ELISA方法筛选,多次克隆化培养后获得的单抗用Western blot进行生物学特性鉴定。结果获得3株持续、稳定分泌抗空肠弯曲菌鞭毛蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G8、1G9和3F2。结论获得的空肠弯曲菌鞭毛蛋白单克隆抗体为建立空肠弯曲菌的蛋白检测及后续研究奠定基础。

西尼罗病毒荧光RT-PCR检测方法的建立

目的用TaqMan技术建立荧光RT-PCR方法,用于检测西尼罗病毒(WNV)。方法从GenBank上调取WNV的基因序列,设计WNYA、WNYB、WNYC三套荧光RT-PCR,经优化后用于WNV灭活苗、乙型脑炎病毒(JEV)、黄热病毒(YFV)等11种病毒核酸的检测,同时用10倍倍比稀释的双链DNA、质粒DNA、cDNA、RNA进行扩增,以检测其灵敏度。结果建立的WNYA、WNYC荧光RT-PCR检出WNV灭活苗阳性,而JEV等10种非WNV病毒均为阴性,能检出30个拷贝和65个拷贝的双链DNA、420个拷贝和460个拷贝的质粒DNA;WNYB的反转录效率明显低于WNYA和WNYC。结论建立的WNYA、WNYC荧光RT-PCR可作为检测WNV的技术储备。