PRRSV非结构蛋白Nsp1α合成肽多克隆抗体的制备及应用

本研究尝试利用PRRSV Nsp1α合成肽进行多克隆抗体的制备,并对抗体的特性进行了分析。首先,利用生物信息学技术预测获得PRRSV非结构蛋白Nsp1α的抗原肽序列;随后,按照此序列合成获得抗原肽,并将其与KLH载体蛋白进行偶联;接下来,将偶联好的抗原肽与弗氏佐剂混合,通过免疫大白兔制备针对Nsp1α合成肽的多克隆抗体;最后,利用ELISA、Western blot及间接免疫荧光法对多克隆抗体的特性进行了分析。结果显示:该多克隆抗体ELISA的效价超过105;利用Western blot可以检测到特异的Nsp1α表达条带,包括瞬时转染的样品和不同毒株病毒感染的样品;利用间接免疫荧光法分析,该多克隆抗体可有效地区分病毒感染和未感染的样品。结果表明,PRRSV Nsp1α合成肽多克隆抗体可以有效地应用于PRRSV Nsp1α表达检测,为进一步研究PRRSV Nsp1α的功能提供了一个有效的工具。

绵羊清道夫受体A基因启动子克隆及序列分析

为了分析绵羊清道夫受体A(scavenger receptor A,SRA)基因的启动子序列特征,试验根据UCSC数据库和NCBI数据库预测的绵羊SRA基因启动子序列设计特异性引物,以绵羊肺组织基因组DNA为模板进行SRA基因启动子序列PCR扩增、测序,然后对序列进行生物信息学分析,包括预测启动子活性区域、转录因子结合位点、TATA box及CpG岛。结果表明:利用根据UCSC数据库预测的SRA基因启动子序列设计的引物未扩增出目的片段,利用NCBI数据库预测的SRA基因启动子序列设计的引物扩增得到了绵羊SRA基因启动子序列,大小约为1200 bp,与NCBI预测序列的相似性为99%,其中第577位碱基发生了突变(G→A);含有1个潜在活性区域(aaaaatgagctcacattcattttttttttcttaactggc);存在干扰素调节因子(interferon regulatory factor,IRF)1、IRF2、c-Jun、CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT enhancer binding protein,C/EBP)、活化蛋白1(activator protein 1,AP-1)、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)转录因子结合位点,其中IRF1和c-Jun的结合位点出现频率较高;不存在TATA box和CpG岛,只存在3个CpG位点。说明SRA基因的表达可能受IRF1和c-Jun等相关转录因子的调控,不受甲基化的影响。

一株牛源溶酪巨型球菌致病性及全基因组特征分析

目的本研究旨在研究1株牛源溶酪巨型球菌(Macrococcus caseolyticus,M.caseolyticus)的致病性和全基因组特征,挖掘该菌株的毒力和耐药相关基因。方法在新疆石河子市某牛场中采集1例病死牛肺脏,从牛肺脏灌洗液中分离鉴定了1株牛源溶酪巨型球菌,在此基础上进行了药敏试验、动物感染试验;并通过Illumina的二代测序技术对该菌株进行全基因组框架图构建,构建多个管家基因同源进化树,对编码基因、重复序列、非编码RNA等进行预测,并在GO、KEGG、COG、NR和CAZy数据库对基因组的基本功能特征进行注释,结合NR数据库的注释和PHI、CARD数据库注释,明确其基因组中毒力因子、耐药性等相关基因。结果从牛肺中成功分离到一株M.caseolyticus,通过感染兔子试验证实该菌株具有较强的致病性,病理切片结果显示兔子肺泡数量减少,大量炎性细胞渗出,肺泡囊增大,肺泡囊中充满渗出物,红细胞渗出,细支气管管壁塌陷。该菌经平均核苷酸相似度分类和系统发育树确定为溶酪巨型球菌,全基因组大小为2209314 bp,CG%含量为37.22%,平均长度为855 bp,编码2304个基因;其中tRNA有58个、rRNA有8个、sRNA有1个;含有3条CRISPRs序列。在GO数据库中有1028个基因得到注释,分别注释到分子功能、细胞组分和生物过程3大类;在KEGG数据库中共有1420个编码基因得到注释;在COG数据库中,共注释有23种功能的1961个基因;同时,在全基因组测序结果中发现51个毒力因子和对氨基糖苷类、β-内酰胺类和多肽类等抗生素的多种耐药基因,药物敏感性试验中菌株对测试的12类抗生素仅对磺胺类(复方新诺明)、林可霉素类(林可霉素)、青霉素类(氨苄西林)耐药。结论本研究从病死牛肺脏中分离得到1株牛源溶酪巨型球菌并命名为SHZXbov7,该菌具有较强的致病性,含有多种毒力因子和耐药基因,菌株SHZXbov7的基因组测序和注释将丰富溶酪巨型球菌的基因数据库,为溶酪巨型球菌相关疾病的防控提供参考。

靶向严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2的人工microRNAs设计与思考

动植物人工miRNAs(artificial miRNAs,amiRNAs)在抗病毒感染中发挥重要作用。然而,有关amiRNAs靶向抑制重症急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)的相关研究未见报道。目的:本研究旨在设计靶向SARS-CoV-2的amiRNAs,进一步分析amiRNAs对不同变异株的匹配程度。方法:利用Invitrogen Block-iT RNAi Designer成功设计靶向SARS-CoV-2的amiRNAs。结果:分别命名为amiR-Cov23utr-1、2、3、4;其中amiR-Cov23utr-1、3和4在Omicron BA.5/2022中靶向区域序列十分保守;amiR-Cov23utr-2在Omicron BA.5/2022中的靶点缺失。结论:本研初步设计和分析了靶向SARS-CoV-2的amiRNAs,为后续深入研究amiRNAs抗SARS-CoV-2感染提供了重要基础资料。

金银花源miR2911靶向PEDV基因区域分析

金银花源miR2911是一种丰度较高、性质稳定的抗病毒分子,在抗流感病毒感染和SARS-CoV-2感染中发挥着关键作用。然而,有关miR2911靶向PEDV基因区域的研究却鲜有报道。因此,本研究旨在分析miR2911靶向PEDV的基因区域,进一步分析miR2911靶点在不同流行毒株中的保守性。利用miRanda软件成功预测miR2911在PEDV基因组中存在多个靶点,靶向PEDV基因区域保守性很高。为后续深入研究miR2911在抗猪源病毒感染的机理提供了数据支撑。

兽医外科手术学课程思政改革与研究

兽医外科手术学是动物医学专业必修课,也是一门实践性和应用性较强的专业课程。古语曰,‘德为才之帅,才为德之资也’,课程思政是给当代大学生一味良药,课程思政的实施也将促进教师的思想水平不断提高。在新时期不但要注重知识和操作技能的掌握,更要通过挖掘课程中的思政元素,将思政元素与课程知识有机结合,提高学生思想认识水平和道德水平。也就是说,在培养兽医专业人才技能的同时,培养学生要重视医风医德、动物福利和伦理学及兽医法规等,通过对兽医专业思想升华,培养当代大学生懂得当今幸福生活来之不易,要抓住黄金时间刻苦学习,报效祖国,热爱祖国。本文初步挖掘了课程思政元素,为建设课程思政示范课做了重要贮备。

兽医外科手术学综合实验课程改革与研究

兽医外科手术学综合实验是动物医学专业必修课,也是一门实践性和应用性较强的专业课程。过程性考核具有考核内容全面、考核方式灵活、学习效果反馈及时等特点,已经逐步得到越来越多的认可和采用。在兽医外科手术学综合实验教学过程中采用过程性考核,对学生的综合能力的评价更全面、更科学,可以使学生对知识的掌握更全面和扎实,学习效果更佳。

动脉瘤性蛛网膜下腔出血潜在生物标记物的研究进展

动脉瘤性蛛网膜下腔出血是一种常见的神经系统急症,有着极高的致死率和致残率,目前对于动脉瘤性蛛网膜下腔出血的检查及预后评估主要通过影像手段如CT、CTA、MRA、DSA来实现,但是这些检查手段有着严格的适应症、禁忌症、潜在造影剂和辐射威胁,此外术后患者需进行长期随访,观察脑动脉瘤的生长及预后情况,部分患者受到医疗、经济等条件限制。因此,寻找快捷、实用、有效和经济的评估方法来检测动脉瘤性蛛网膜下腔出血的治疗效果和预后是非常有必要的。

绵羊肺炎支原体不同分离株的致病性比较

为研究不同绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)的致病性差异,筛选出致病性强的Mo菌株。通过间接免疫荧光技术检测不同Mo分离株(XJ15、XJ13、XJ22、1412、XJN)、标准株(Y98)对山羊气管上皮细胞(goat tracheal epithelial cells,GTEC)的黏附力强弱,将不同Mo菌株以109 CCU/mL浓度,0.2 mL/只,接种到7日龄SPF鸡胚的卵黄囊中,设阴性对照组和空白对照组,检测并观察Mo感染鸡胚致死率以及死亡鸡胚病理变化,记录鸡胚死亡时间,取死亡鸡胚的尿囊液进行PCR鉴定,同时对各个感染组的卵黄囊液进行PCR检测。结果显示,6株Mo均能黏附GTEC细胞,其中XJ15黏附力最强,XJN黏附力最弱。在鸡胚感染试验中,6株Mo均能引起鸡胚死亡,且不同Mo感染组鸡胚死亡数差异显著(P<0.05)。其中,XJ15感染组致死率为90%,1412和XJN感染组致死率为20%。感染组死亡鸡胚表面有出血,充血症状,尿囊液PCR检测均为阳性。表明,筛选出XJ15为致病性较强的Mo分离株,为后期Mo人工感染模型的建立奠定基础。

金银花源miR2911基因靶向猪伪狂犬病毒基因区域分析与验证

金银花源miR2911是一种丰度较高、性质稳定的抗病毒分子,在抗流感病毒感染和SARS-CoV-2感染中发挥关键作用。然而,有关miR2911靶向猪伪狂犬病毒基因区域的研究鲜有报道。因此,本研究旨在分析miR2911靶向PRV的基因区域,进一步分析miR2911靶点在不同流行毒株中的保守性,以验证miR2911对靶向区域的结合作用。利用miRanda软件成功预测miR2911在猪伪狂犬病毒基因组中存在多个靶点,靶向猪伪狂犬病毒UL34基因区域保守性很高,利用报告基因系统证实miR2911可通过结合UL34靶向区域发挥抑制作用。这为后续深入研究miR2911在抗猪伪狂犬病的机理方面提供了重要支撑资料。

绵羊MSR1克隆及其序列分析

为了解绵羊巨噬细胞清道夫受体1(Macrophage Scavenger Receptor 1,MSR1)基因的生物学信息特征,本研究对绵羊MSR1进行了克隆鉴定,与其他物种的MSR1氨基酸序列进行比对、构建进化树,并进行生物信息分析,预测了MSR1的理化性质。结果显示:绵羊MSR1基因ORF区全长1362 bp,编码453个氨基酸,分子量约为50 kDa,构建了MSR1真核表达载体;绵羊MSR1与山羊、羚羊、马鹿、水牛、白鲸、猪、人、家兔、小鼠的同源性分别为98.90%、96.03%、93.16%、93.16%、81.28%、78.81%、74.17%、73.51%、63.77%,同属于牛科动物的序列同源性在90%以上,进化树上在同一分支;该蛋白分子式为C_(2188)H_(3473)N_(629)O_(680)S_(19),理论等电点为6.00,蛋白质性质为弱酸性,51~73号氨基酸为跨膜结构,有7个潜在的糖基化位点和多个磷酸化位点,存在2个棕榈酰化位点和5个乙酰化位点,169~180位氨基酸序列区域为优势抗原决定簇。研究结果为以后研究绵羊MSR1的功能奠定了基础。

猪TRIM32分子的克隆、表达及其功能分析

TRIM32作为TRIM家族中的一员,在宿主先天性免疫防御中起着重要的作用。然而,现今对猪TRIM32分子的研究鲜有报道。首先,利用RT-PCR从猪肺中扩增获得了猪TRIM32分子,并将其克隆入真核表达载体p3xFlag-CMV-14,构建重组真核表达载体pFlag-porTRIM32。随后,在Marc145细胞上利用过表达猪TRIM32,鉴定其在PRRSV感染中的作用。此外,为了进一步验证其在PRRSV感染中的作用,在沉默Marc145细胞中内源性TRIM32表达的情况下,检测了PRRSV的感染情况。结果显示:成功构建了pFlag-porTRIM32真核表达载体;Western blot的结果显示,Flag抗体能识别瞬时表达的融合蛋白Flag-porTRIM32;在Marc145细胞上过表达猪TRIM32分子,可显著地抑制PRRSV的复制;相反,在Marc145细胞上干扰TRIM32的表达,可明显增加PRRSV的复制。因此,我们的研究结果初步揭示了猪TRIM32分子具有抗PRRSV感染的作用,为进一步探究猪TRIM32抗HP-PRRSV感染的机制奠定基础。

局部晚期非小细胞肺癌患者不同新辅助治疗方案中TAMs的水平变化和疗效相关性分析

目的:分析局部晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者不同新辅助治疗方案中肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)的水平变化和疗效相关性。方法:收集我院2018年01月01日至2022年06月30日接受新辅助治疗及手术治疗的患者163例,按照新辅助治疗方案不同分为新辅助免疫联合化疗组及新辅助化疗组,进行MPR计算,并对影响MPR的因素进行分析;同时对其中具有治疗前后配对标本的37例患者进行TAMs相关分子(CD68、CD86、CD163)的免疫组化染色,分析治疗前后指标变化与临床疗效间的相关性。结果:新辅助免疫联合化疗组MPR明显高于新辅助化疗组(58.6%vs 21.3%,P<0.001)。新辅助免疫联合化疗组中,治疗后CD86的阳性表达率高于治疗前(75%vs 16.7%,P=0.039);CD163、CD68的表达水平在治疗前后无明显差异(P>0.05)。新辅助化疗组中,治疗后CD68、CD86的阳性表达率均高于治疗前(64%vs 28%,P=0.035)、(68%vs 28%,P=0.021);CD163的表达水平在治疗前后差异无明显差异(P>0.05)。CD68、CD86、CD163的表达在新辅助免疫联合化疗及化疗组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。新辅助免疫联合化疗组中,CD86治疗前后表达的变化与MPR呈正相关(r s=0.577,P=0.046);但CD68与CD163治疗前后表达的变化与MPR之间无显著相关性(P>0.05)。新辅助化疗组中,CD68、CD163、CD86治疗前后表达的变化与MPR之间均无显著相关性(P>0.05)。结论:可切除局部晚期NSCLC患者新辅助免疫联合化疗相比于新辅助化疗能够为患者带来更高的MPR率;M1型(CD86)TAMs的变化可作为新辅助免疫联合化疗疗效预测的潜在生物标志物。

高电压故障穿越仿真测试技术研究

基于硬件在环仿真测试平台,采用阻抗、阻容分压原理开展高、低电压故障穿越测试是检验新能源场站发电单元电压耐受能力的重要技术手段。随机投入阻容升压支路易导致并网点电压骤降,进而触发低电压穿越逻辑,降低高电压故障穿越测试效率。为此,提出阻容升压支路柔性投退控制策略及控制策略集成建模方法,实现高电压故障一键顺控模拟,提升了测试效率。仿真结果表明,所提方法可以准确、有效、快速完成高电压故障模拟。

白花蛇舌草总黄酮对TGF-β1诱导的肝癌MHCC97-H细胞EMT的逆转作用及其机制

目的探讨白花蛇舌草总黄酮(FOD)对TGF-β1诱导肝癌细胞MHCC97-H上皮细胞间质转化(EMT)的逆转作用及其相关机制。方法用TGF-β1诱导MHCC97-H细胞建立EMT模型,再将其分为5组:正常对照组、TGF-β1组、TGF-β1+FOD组、TGF-β1+5-FU组及TGF-β1+FOD+5-FU组,分别干预48h,Transwell侵袭小室法检测细胞体外侵袭能力,Western blot法检测各组细胞中E-cadherin、vimentin蛋白的表达。结果与正常细胞形态相比,TGF-β1诱导后细胞呈现明显的长梭形,且侵袭能力增强(P=0.02);给予药物处理后,TGF-β1+FOD组、TGF-β1+5-FU组细胞的穿透能力较TGF-β1组减弱(P=0.03、P=0.02),且联合用药组减弱程度更加明显(P=0.01);Western blot结果显示,TGF-β1组细胞中E-cadherin蛋白表达显著降低(P=0.01),vimentin蛋白的表达显著增加(P=0.01),TGF-β1+FOD组、TGF-β1+5-FU组E-cadherin蛋白表达有所上调(P=0.03、P=0.02),vimentin蛋白的表达有所下调(P=0.04、P=0.03),且联合组变化更为显著(P=0.01)。结论 FOD能够逆转TGF-β1诱导的肝癌MHCC97-H细胞的上皮间质转化,其机制可能与其抑制TGF-β1诱导的E-cadherin蛋白下调及上皮细胞间质转化相关。

miR-135b促进肝癌细胞侵袭和转移

目的探讨miR-135b对肝癌细胞浸润转移的影响及其分子机制。方法分别在肝癌细胞系中过表达和下调miR-135b,通过Transwell^(TM)实验检测肿瘤细胞迁移和侵袭能力,利用肝癌移植瘤模型检测肝癌细胞的体内增殖能力和成瘤能力;采用Western blot法结合双荧光素酶基因报告系统预测miR-135b的下游靶基因。结果 miR-135b在高侵袭性的MHCC97肝癌细胞系中高表达;过表达miR-135b能够增强HepG2和Bel-7402肝癌细胞的体外侵袭和转移能力,促进肝癌细胞的体内转移能力;通过靶向miR-135b的干扰载体pcDNA-miR-135b-Sponge下调miR-135b的表达,MHCC97肝癌细胞的体外侵袭转移能力及移植瘤的转移能力明显受到抑制;双荧光素酶基因报告系统和Western blot实验结果显示miR-135b能够靶向Hippo信号通路中的关键分子,包括大型肿瘤抑制因子同源蛋白2(LATS2)、含β转导素重复序列蛋白(β-TrCP)、N-myc下游调节基因2(NDR2)和亮氨酸拉链肿瘤抑制基因1(LZTS1)等。结论 miR-135b可能通过靶向Hippo信号通路相关基因促进肝癌细胞的侵袭和转移。

白花蛇舌草总黄酮对肝癌MHCC97-H细胞增殖的抑制作用

目的:观察白花蛇舌草总黄酮(FOD)对肝癌MHCC97-H细胞增殖和凋亡的影响。方法:将生长良好的细胞分为空白组、FOD组、5-FU组及联合组四组,分别干预48小时,观察细胞的形态,MTT法检测其对肿瘤细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测FOD对MHCC97-H肝癌细胞凋亡的影响。结果:FOD对肝癌MHCC97-H细胞有显著的抑制作用,并且具有剂量和时间依赖性,不但能使细胞密度减少,细胞变小,核固缩,而且能显著抑制人肝癌MHCC97-H细胞的增殖并诱导该细胞的凋亡(P<0.05)。结论:白花蛇舌草总黄酮能够通过抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡,明显抑制肝癌MHCC97-H细胞的增殖。

呼吸道综合征的猪肺中支气管败血波氏杆菌的分离、鉴定及特性分析

临床上猪呼吸道综合征(porcine respiratory disease complex,PRDC)大多为多种病原微生物共感染所致,支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)为PRDC的常见病原,但其在PRDC发生中的作用还不十分清楚。为了研究Bb在PRDC中的作用,本研究聚焦于PRDC的猪肺中Bb的分离、鉴定及特性分析。首先,利用16S rRNA基因序列对分离的细菌进行鉴定,结果从15头已鉴定为PRDC的猪肺中共获得5株Bb分离菌株。随后,对Bb相关毒力因子包括皮肤坏死毒素(dermonecrotic toxin,DNT)、百日咳杆菌粘附素(bordetellaad hesin,PRN)以及鞭毛蛋白(flagellin,fla B)进行PCR鉴定,结果发现所有分离株上述毒力因子都为阳性。最后,对Bb分离株进行18种抗生素的药敏实验,发现所有分离株对阿莫西林、头孢噻呋、链霉素、氨苄西林等8种药物高度耐药,而对卡那霉素、美罗培南以及庆大霉素高度敏感;此外,部分菌株对红霉素、氟苯尼考、强力霉素以及阿米卡星耐药。总之,本研究从PRDC的猪肺中分离到5株支气管败血波氏杆菌,这些分离株显示出不同的耐药特性,同时,分离株含有的与毒力相关的毒力因子,暗示了其致病特性。

金银花源miR2911靶向非洲猪瘟病毒基因区域分析

金银花源miR2911是一种高丰度、性质稳定的抗病毒分子,在抗流感病毒感染、SARS-CoV-2感染中具有一定效果。然而,对于miR2911靶向ASFV基因区域的研究却鲜有报道。由此,本研究旨在分析miR2911靶向ASFV的基因区域,从而进一步分析miR2911靶点在不同流行毒株中的保守性。利用miRanda软件成功预测了miR2911在ASFV基因组中存在的多个靶点,且靶向ASFV基因区域保守性很高。为后续深入研究miR2911在抗猪源病毒感染机理方面提供理论依据。

白花蛇舌草总黄酮对肝细胞癌干细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨白花蛇舌草总黄酮(FOD)对Huh7来源的肝细胞癌干细胞增殖及凋亡的影响。方法培养Huh7细胞系,通过流式分选技术筛选出Huh7细胞系中CD133阳性的干细胞(CD133^(+)-Huh7);流式分析术检测分选后CD133阳性细胞比例;Western blotting实验检测分选纯化前后细胞干性指标Nanog、Oct4、Sox2的表达。分别用0、50、100、400μg/mL FOD分别作用CD133^(+)-Huh7肝细胞癌干细胞24、48、72、96 h,应用CCK8(Cell Counting Kit-8)法检测其对细胞增殖的影响;平板克隆实验检测各组细胞增殖能力变化;Annexin V-PE/7-AAD法检测各组细胞凋亡比例,并用Western blotting法检测p53、FAS-FADD、抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax及凋亡指标Cleaved-Caspae3等凋亡通路蛋白的表达。结果纯化后的Huh7细胞的干性标志物Nanog、Oct4、Sox2表达更高。100μg/mL FOD刺激CD133^(+)-Huh7干细胞72 h,CCK8实验结果显示其细胞增殖较阴性对照组(0μg/mL处理组)降低(P<0.05),平板克隆实验亦显示其细胞增殖变弱;细胞凋亡比例较阴性对照组显著升高(P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低而促凋亡蛋白Bax以及凋亡指标Cleaved-Caspae3的蛋白表达升高,p53、FAS、FADD通路显著上调。结论FOD可显著抑制CD133^(+)-Huh7肝细胞癌干细胞增殖,并显著促进细胞凋亡。