邻近既有轨道交通区间隧道深基坑施工技术研究

以某办公大楼深基坑工程为例,较详细地介绍了邻近既有地铁区间隧道超深基坑的设计、施工、监测的一些关键技术,以及在施工过程中的注意事项,为苏州地区相类似的工程提供参考借鉴。

用新法制备K88ac基因探针

由于遗传工程技术的发展,基因探针被广泛应用。探针的DNA大都来自于大肠杆菌的重组质粒,这样制备的探针易污染该菌的染色体和载体DNA,作菌落杂交时易出现假阳性。为了克服这些缺点,用枯草杆菌质粒作载体克隆K88ac基因的EcoRI小片段。以枯草杆菌重组质粒作探针,与含K88ac基因的菌株杂交呈阳性,而不含K88ac基因的菌株呈阴性,且阴阳性有明显区别。

人α干扰素基因在家蚕细胞和家蚕中的高表达及药学试验

用生物技术大规模生产药物已形成产业化,取得了令人鼓舞的结果。

中国家蚕抗菌肽人工合成类CMⅣ基因在甜菜夜蛾虫体中的表达

将人工合成的中国家蚕抗菌肽类CMⅣ基因与抗菌肽信号肽基因连接 ,经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切后 ,克隆于pFASTBacⅠ的EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点之间 ,得到重组转座载体pFASTBac ABP ,经测序证明阳性克隆正确。将重组转座载体转化HD1 0Bac大肠杆菌 ,得到重组Bacmid ABP。将重组Bacmid转染sf2 1细胞及感染甜菜夜蛾 (Laphygmaexigua)幼虫 ,在培养细胞上清及虫体血淋巴中均测到抗菌活性。经Northernblotting证明感染甜菜夜蛾幼虫中有类CMⅣmRNA的存在。且表达产物在酸性电泳中电泳行为与天然抗菌肽CMⅣ组分相似。为进一步利用昆虫细胞及虫体生产抗菌肽药物打下了基础。

重组人α2b型干扰素的纯化与鉴定

采用超声波裂解菌体 ,硫酸铵沉淀 ,酸化处理 ,再经离子交换层析和单克隆抗体亲合层析 ,使表达产物纯化了 10 2 9倍 ,比活性达 2 .14× 10 8IU/ mg蛋白 ,SDS- PAGE呈单一条带 ,HPL C纯度 >95% ,回收率达 59.1%。表达产物 N端 2 5个氨基酸序列分析结果与 IFN- α2 b c DNA推导的序列相符合。

用杆状病毒载体在家蚕细胞中表达HBeAg基因

以ＰＣＲ技术扩增含有ＰｒｅＣ信号肽序列及完整的ＨＢｅＡｇ基因的序列（即ＨＢｃＡｇ基因５′端４４７ｂｐ），在５′端加上合适的酶切位点，克隆到家蚕核多角体病毒转移载体ｐＢｍ０３０上，与野生型ＢｍＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕ＢｍＮ细胞，空斑纯化后得到多角体基因失活的重组病毒。ＥＬＩＳＡ法测定表明培养液上清中ＨＢｅＡｇ效价达１∶３２０００，细胞内ＨＢｅＡｇ效价为１∶２０００，培养液及细胞内的ＨＢｃＡｇ含量极低（＜１∶１６０）。研究结果表明，ＢｍＮ细胞能正确识别与切割ＨＢｅＡｇ信号肽序列，所表达的ＨＢｅＡｇ效价高，纯度好。

重组病毒/家蚕细胞系统稳定高效表达HBeAg基因的研究

以 HBe Ag(乙型肝炎病毒 e抗原 )基因置换家蚕核多角体病毒 (Bm NPV)中多角体蛋白基因编码序列 ,获得高效表达 HBe Ag的重组病毒 r Bm HBe。在重组病毒复制过程中 ,家蚕 Bm N细胞的病理变化与野生型病毒的感染相同 ,但不能形成多角体。重组病毒的复制为典型的一步生长曲线 ,感染后 2 4 h～ 36h,病毒效价递增并达到最高。感染后 2 4 h,培养液中可检测到表达产物HBe Ag,72 h达到高峰。病毒感染复数的改变对 HBe Ag表达的影响是时限性的。低感染复数时HBe Ag产量较高。细胞接种密度及病毒接种时间对 HBe Ag的表达有较大的影响 ,最适的细胞接种密度为 3.2～ 6.4× 1 0 5 细胞 /瓶 ,在细胞指数生长前期 (48h～ 60 h)接种重组病毒 ,对于获得较高的重组病毒复制效价和 HBe Ag的产量都是有利的。在采用最佳技术参数组合的条件下 ,ELISA法检测细胞培养液中 HBe Ag滴度可达 1∶ 32 0 0 0。以上研究结果有助于在生产中高效稳定地制备HBe Ag,以满足供应配套乙肝 HBe Ag/抗

用微载体技术培养家蚕BmN细胞的实验研究

观察了家蚕ＢｍＮ（从Ｓｉｌｋｗｏｒｍ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ获得的细胞系）细胞在微载体Ｃｙｔｏｄｅｘ３上的贴壁分布，提出其分布符合Ｐｏｉｓｓｏｎ规律，并由此估计了不同细胞接种浓度时裸球的百分比，与实际观测结果基本符合；研究了不同接种浓度与微载体浓度时细胞的生长情况，家蚕ＢｍＮ细胞在Ｃｙｔｏｄｅｘ ３上生长的临界接种数为一珠粒６．４个细胞。当微载体浓度为３ｇ／Ｌ时，最低的接种浓度为１．０×１０＾５／

人β神经生长因子在大肠杆菌中的高表达

将编码人β神经生长因子(Huβ-HGF)的基因克隆到由T7噬菌体启动子控制的pET11c大肠杆菌表达载体中,重组质粒经鉴定含有Huβ-NGF基因,未解聚的表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),结果显示出二聚体27kD的蛋白带。而完全解聚的表达产物SDS-PAGE显示出一条13β5kD单体带。经凝胶电泳扫描,表达带占菌体总蛋白的14.5％。用兔抗鼠β—NGF的多克隆抗体进行的Western-Blot的结果表明,二聚体同单体都有免疫原性。在生物活性的鉴定中,菌体表达产物可以使小鸡鸡胚的背根神经节产生神经元突起,由此可以证明该表达产物有较高的生物活性。

含有马立克氏病病毒糖蛋白B基因重组质粒的构建及其鉴定

将马立克氏病病毒(MDV)GA 株基因文库中 BamH I I_3和 K_3克隆片段分别用 BamH I 加 Sal I 和 BamH I加 EcoR I 双酶切消化。含有编码 MDV 糖蛋白 B(gB)部分 DNA 的2.B kb、BamH I-Sal I 片段和1.1kb、BamH I-EcoR I 片段与 Sal I-EcoR I 消化的载体 pUR 222通过三聚体连接方式相连接。限制性核酸内切酶分析表明,重组质粒含有 MDV gB 基因,并且 MDV GA 株 gB 基因克隆在 EcoR I,Hind,Ⅲ,Xba I 和 Sal I 切点与 MDVRBIB 株相同。

乙肝病毒e抗原基因在大肠杆茵中高表达

取pZD 8703质粒DNA(本室构建的高表达乙肝核心抗原基因质粒)用Ava Ⅰ酶切开,Bal 31酶消化,加四种核甘酸dNTP、DNA聚合酶大片段酶补平后,用T_4 DNA连接酶连接,再用EcoRI酶消化,回收EcoRI小片段连接到pJLA 503的EcoRI位点,转化受体菌JM103,获得在P_RP_L启动子控制下,由温度调节CIts 857开启和关闭的高表达乙肝e抗原(HBeAg)的重组体。用抗HBe-β)单克隆酶标抗体配套的ELISA双抗体夹心法测定经超声波处理的细菌原液,HBeAg的终效价在1:10240以上,只含少量HBeAg。可以代替血清HBeAg用作配套检测试剂。

人甲状旁腺素的基因表达及活性的初步研究

从人甲状旁腺瘤组织中分离到ｍＲＮＡ，逆转成ｃＤＮＡ后，设计带有突变碱基的引物，通过聚合酶链式反应，扩增ｈＰＴＨ基因，使Ｎ端前５氨基酸的碱基富含腺嘌呤核苷（Ａ）．将该基因克隆到表达载体ＰＥＴＩＣ上，转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）表达，实验证实ｈＰＴＨ的表达量占菌体蛋白总量的１１％；细胞粗步处理产物经腺苷环化酶的生物鉴定实验证实，重组ｈＰＴＨ具有生物活性，粗产物５００倍稀释后，ｈＰＴＨ的放免活性为２０６．５ｎｇ／Ｌ。

人α_1－干扰素基因真核表达载体的构建及其活性

选用与ＨｕＩＦＮ－α１基因及其信号肽相应的引物，采用ＰＣＲ技术，从中国人血白细胞染色体中分离带有信号肽ＩＦＮ－α１基因片段，分别克隆到质粒Ｍ１３ｍｐ１９和Ｍ１３ｍｐ１８中，通过序列分析进行鉴定，然后克隆到家蚕多角体病毒（１３０ｍｂｙｘｍｏｒｉＮｕｃｌｅａｒＰｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓＶｉｒｕｓ，ＢｍＮＰＶ）载体ＰＢＦ５的ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ之间，用合成的相应寡核苷酸片段为引物进行双链测序，鉴定为阳性重组转移载体后，将其ＤＮＡ和ＢｍＮＰＶ基因组ＤＮＡ共转染家蚕细胞，筛选出重组病毒，再将其感染家蚕细胞，测得细胞培养上清中ＩＦＮ活性为１．０×１０６ＩＵ／ｍｌ。

人胰岛素样生长因子I基因的半合成及其克隆表达

将人胰岛素样生长因子 Ⅰ（ＩＧＦ－ Ｉ）基因克隆到 ｐＥＴ１１Ｃ中，构建成 ｐＥＴＩＧＦ－ Ｉ表达载体，完成人ＩＧＦ－Ｉ基因在大肠杆菌中的高表达。方法：利用固相亚磷酸三酯法化学合成人ＩＧＦ－Ｉ基因的２条寡核苷酸片段，通过互补配对和Ｋｌｅｎｏｗ酶促补平成完整的ＩＧＦ－Ｉ双链ＤＮＡ片段，然后经酶切克隆于ｐＴＶ１１８Ｎ载体中，构建ｐＴＶＩＧＦ－Ｉ克隆载体并测定ＤＮＡ序列后，构建ＰＥＴＩＧＦ－Ｉ表达载体。结果：合成的人ＩＧＦ－Ｉ基因经测序证明与设计的一致，人 ＩＧＦ－ Ｉ基因在大肠杆菌中表达量高于 １０％。结论：选用大肠杆菌偏性密码子，小分子的人 ＩＧＦ－

家蚕BmN细胞的微载体培养及HBeAg的高效表达

选择微载体Ｃｙｔｏｄｅｘ３对家蚕ＢｍＮ（从ＳｉｌｋｗｏｒｍＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉ获得的细胞系）细胞进行高密度培养，并获得成功。观察了家蚕ＢｍＮ细胞在微载体Ｃｙｔｏｄｅｘ３上的贴壁分布，研究了不同接种浓度与微载体浓度时细胞的生长情况，并筛选出最佳的技术参数。在１０００ｍＬ滚瓶中用微载体Ｇｙｔｏｄｅｘ３培养家蚕细胞，在合适的培养条件下（细胞接种浓度３．６×１０５细胞／ｍＬ、微载体浓度５ｇ／Ｌ），５ｄ后，细胞的终密度达到２．８×１０６细胞／ｍＬ，细胞增长指数为７．９。在细胞指数生长期（传代后４８～６０ｈ）用载有ＨＢｅＡｇ基因的重组病毒（ｒＢｍＨＢｅ）接种（感染量为０．４ＰＦＵ／细胞），５ｄ后，培养上清中ＨＢｅＡｇ滴度为１∶９．６×１０４，是用方瓶静止培养的家蚕细胞表达量的３倍。

利用杆状病毒表达载体研制兽用重组疫苗的进展

利用杆状病毒表达载体研制兽用重组疫苗的进展罗满林，张林元，陈溥言，蔡宝祥（南京农业大学动物医学系）昆虫杆状病毒正受到人们的日益重视。这不仅因为它可以作为安全、有效、无害的生物防治剂，而且由于Ｓｍｉｔｈ和Ｓｕｍｍｅｒｓ［１］创立并发展起来的昆虫杆状病毒...

地高辛核酸探针用于马立克氏病病毒分型鉴定

地高辛核酸探针用于马立克氏病病毒分型鉴定李光富，陈溥言，蔡宝祥，张林元，邓小昭，刁振宇（南京军区军事医学研究所２１０００２）马立克氏病毒（ＭＤＶ）不同毒株在毒力和产生组织病变方面有明显差异。最早是英国的Ｂｉｇｇｓ根据ＭＤＶ对鸡的致病和致瘤特性将的ＤＶ...

重组病毒－家蚕细胞系统表达人α_1－干扰素的纯化研究

用重组家蚕核多角体病毒（ｒＢｍＮＰＶ－ＩＦＮ－α）感染家蚕细胞，经ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析柱及单克隆抗体亲和层析，从细胞培养液中分离纯化α－干扰素，纯化倍数为１０１０，比活性为５．８７×１０８ＩＵ／ｍｇ蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电冰呈单一条带，并用激光解离电离飞行质谱分析测定其分子量为２０４６５Ｄ，毛细管电泳鉴定纯度为９９．１％。表达产物Ｎ端１５个氨基酸分析结果与ＩＦＮ－α１ｃＤＮＡ推导的序列相同。

马立克氏病病毒糖蛋白B基因克隆及其在家蚕细胞中的表达

将马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＧＡ株基因文库中的ＢａｍＨＩＩ３和Ｋ３克隆质粒分别用双酶切消化，获得２．８ｋｂ的ＢａｍＨＩ－ＳａｌⅠ片段和１．１ｋｂ的ＢａｍＨＩ－ＥｃｏＲＩ片段，然后将这２个片段定向克隆于载体ｐＵＲ２２２中，构建了含ＭＤＶ糖蛋白Ｂ（ｇＢ）基因的重组质粒。为了基因操作方便和高效表达，设计了１对带有酶切位点的引物，用ＰＣＲ扩增了ＭＤＶｇＢ基因部分片段，并按正确方向插入去磷酸化的载体质粒中，得到起始密码子前带有ＥｃｏＲＩ酶切位点的ＭＤＶｇＢ基因克隆，再将该基因插入去磷酸化的家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）转移载体ｐＢＦ１４中，ＤＮＡ序列分析确证了克隆基因及阅读柜架的正确性。以重组转移载体与野生型ＢｍＮＰＶ共转染家蚕细胞，用有限稀释法点杂交结合空斑技术纯化重组病毒。用荧光抗体试验检查重组病毒感染的家蚕细胞。

K88ac基因工程苗及免疫仔猪腹泻的试验小结

一、大肠杆菌K88ac基因工程苗的构建 80年代以来,国内外许多学者都在研究预防仔猪腹泻的基因工程疫苗,且均有不同程度的进展。本文猪源性产肠毒素大肠杆菌K88ac菌株是从上海奉贤县仔猪腹泻粪便中分离出来的大肠杆菌。采用两个重组质粒,一个是粘附素基因重组质粒pMM032,编码合成K88ac抗原;另一个是热敏毒素(LT)基因重组质粒pPMC4或pPMC5。