甘蔗抗花叶病育种研究进展

甘蔗花叶病是危害甘蔗生产的主要病毒性病害之一,其病原主要包括甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)、高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)和甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)3大主要病原。甘蔗花叶病的发生严重影响甘蔗的品质和产量,防治该病害最经济有效的方法是抗病品种的应用。本文综述了甘蔗花叶病的危害和防治途径、甘蔗种质资源的抗性评价、抗性遗传分析、分子标记、抗性基因的挖掘利用及抗病育种等方面的研究进展,同时指出了甘蔗抗病育种方面存在的问题,并对加强甘蔗抗花叶病育种的研究提出了一些建议。

甘蔗磷酸丙糖/磷酸转运蛋白基因ShTPT的克隆与表达分析

磷酸丙糖/磷酸转运蛋白(triose-phosphate/phosphate translocator,TPT)是一种磷酸丙糖转运蛋白,在植物碳代谢途径以及非生物胁迫中发挥重要作用。蔗糖具有广泛的食用价值和重要的经济价值,甘蔗是制糖的主要原料,蔗糖占中国产糖量的80%以上,因此实现甘蔗高产高抗目标至关重要。本研究以甘蔗品种新台糖22号(ROC22)为材料,克隆获得甘蔗磷酸丙糖/磷酸转运蛋白基因ShTPT,利用生物信息学方法对ShTPT进行蛋白理化性质、保守结构域、跨膜结构预测和蛋白序列比对。结果显示:ShTPT基因CDS全长1221 bp,编码406个氨基酸,蛋白分子量为43.63 kDa,等电点(pI)为9.80,富含丙氨酸、亮氨酸,不稳定系数为42.51,亲水系数为0.583,是一种不稳定的疏水性蛋白;ShTPT蛋白不含信号肽并具有9个跨膜结构域;保守结构域预测显示ShTPT含有1个TPT结构域,符合TPT家族特征;进化分析结果显示,ShTPT与高粱SbTPT(XP_002454867.1)、玉米ZmTPT(NP_001105497.1)聚在一起,同源性分别为97.04%和94.13%。进一步对ShTPT进行亚细胞定位分析发现ShTPT定位在叶绿体。甘蔗组织表达模式分析表明,ShTPT主要在叶片中表达,在根部和茎中的表达量极低。在PEG模拟的干旱胁迫条件下ShTPT的表达量表现出升-降-升的趋势,表明其响应干旱胁迫。该研究结果表明ShTPT是一个定位于叶绿体的跨膜转运蛋白,可能参与甘蔗叶片中的原初碳代谢化合物的转运,响应干旱胁迫。本研究初步确定甘蔗ShTPT基因在叶片中碳同化物的转运和非生物胁迫方面发挥重要作用,为进一步研究其功能提供理论依据。

甘蔗条点病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种快速、灵敏、特异的检测甘蔗条点病毒(sugarcane striate virus,SStrV)的SYBR Green I荧光定量PCR方法。【方法】从SStrV基因组保守区域序列设计特异性扩增引物,构建含有SStrV基因组序列的重组质粒pMD19-T-SStrV-qN作为阳性质粒标准品,以其为模板建立SStrV荧光定量PCR检测方法,并对该方法的灵敏性、特异性、稳定性进行了测试,随后用该方法对甘蔗不同组织部位中SStrV载量进行检测。【结果】将含有SStrV基因组序列的重组质粒按10倍比稀释成标准品,将其作为模板进行荧光定量PCR,获得标准曲线y=-3.337 x+38.197,相关系数r2=0.999,说明Cq值与标准品浓度拷贝数的对数呈线性关系;建立的荧光定量PCR最低可以检测到13拷贝重组质粒/μL,是普通PCR灵敏度的100倍。该方法能特异的检测SStrV,特异性高,组内和组间的变异系数在0.13%-0.94%之间,表明该方法重复性良好。SStrV的载量在甘蔗的不同组织部位中差异较大,+4叶中SStrV的载量最高,与其他组织部位达到了显著差异。【结论】建立了能灵敏特异检测SStrV的SYBR Green I荧光定量PCR方法,明确了+4叶是甘蔗中SStrV检测的最佳采样部位。

康乃馨ACC氧化酶反义基因遗传转化康乃馨的研究

在建立康乃馨从愈伤组织到完整植株的高频再生体系的基础上,用花特异表达启动子驱动的康乃馨ACC氧化酶反义基因通过农杆菌介导法对康乃馨进行遗传转化,获得了3株转基因植株,经多重PCR及PCR-Southem杂交检测,证实康乃馨ACC氧化酶的反义基因已整合进康乃馨的基因组中。

香荚兰细胞培养及产香兰素研究初报

香荚兰的幼茎在MS＋BA1μg／mL＋NAA5μg／mL培养基上培养40d，其表面形成白色、块状的愈伤组织。愈伤组织在MS＋2，4－D1μg／mL＋BA1μg／mL＋NAA4μg／mL＋2．5％sucrose的半固体培养基上快速增殖培养，培养4周后培养物的重量增加7倍左右；在相同培养基的悬浮培养中，培养4周后培养物的重量增加6～8倍。从不同的培养物中分离出香兰素并测定其含量。

康乃馨ACC氧化酶cDNA的克隆及其反义植物表达载体的构建

以康乃馨 (DianthuscaryophyllusL .)花瓣为材料 ,用改进的异硫氰酸胍一步法提取总RNA ,根据已报道的康乃馨ACC氧化酶 (1 aminocyclopropane 1 carboxylicacidoxidase ,ACO)基因的序列设计并合成一对引物 ,通过RT PCR方法获得一约 1 2kb特异片段 ,把该片段连接到pGEM(R) Teasyvector上进行测序 ,其全长共 115 6bp ,编码区 915bp ,共编码 30 4个氨基酸残基。序列分析结果表明该序列与GenBankL35 15 2中的康乃馨ACC氧化酶基因的cDNA序列完全相符 ,推断该基因在康乃馨种内可能是完全或高度保守的。随后将此片段反向插入植物表达载体pBI12 1的 35S启动子和NOS终止子之间 ,构建了一反义植物表达载体pBO ;又把花特异表达启动子PchsA插入pBI12 1的HindIII +Xbal位点构建中间载体pCHB ,再把康乃馨ACC氧化酶基因反向插入中间载体pCHB的XbaI +Sst1位点构建成另一反义植物表达载体pCBO。

康乃馨ACC氧化酶cDNA的克隆及其序列分析

以康乃馨(DianthuscaryophyllusL.)花瓣为材料,用改进的异硫氰酸胍一步法提取总RNA,根据已报道的康乃馨ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylicacidoxidase,ACO)基因的序列设计并合成一对引物,通过RT-PCR方法获得一约1.2kb特异片段,把该片段连接到PGEM-Teasyvector上进行测序,其全长共1156bp,编码区915bp,共编码304个氨基酸残基。序列分析结果表明该序列与国外SavinKw报道的康乃馨ACC氧化酶基因的cDNA序列完全相符。推断该基因在康乃馨种内可能是完全或高度保守的。

基因枪介导甘蔗遗传转化研究初报

将从灰树花（Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ）中分离克隆到的海藻糖合酶ｃＤＮＡ以正向插入植物表达载体ｐＢＩ１２１／ＢａｍＨＩ＋Ｓｓｔ１位点，获得一植物表达载体ｐＢＴ：又用Ｕｂｉ－Ｌ启动子插入植物表达载体ｐＢＩ１２１／ＨｉｎｄⅢ＋Ｘｂａｌ位点，获得重组质粒ｐＵＢ，再把海藻糖合酶ｃＤＮＡ正向插入ｐＵＢ／ＢａｍＨＩ＋ＳｓｔＩ位点，获得另一植物表达载体ｐＵＢＴ。然后通过基因枪法分别用植物表达载体ｐＢＴ和ｐＵＢＴ转化甘蔗。再生植株的点杂交和ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交表明海藻糖合酶基因已整合进甘蔗的基因组中。

依兰香细胞离体培养及其精油成分分析

以依兰香（Canangaodorata）的花瓣及雄蕊群为外植体，在1／2MS＋2，4－D1－2＋Kt0．2的培养基上分别诱导出白色和红色的两种愈伤组织，建立了依兰香细胞的大量培养（包括固体培养，悬浮培养及发酵罐培养）体系和单细胞克隆，通过化学方法进行高产油细胞系的初步筛选，从培养细胞中分离出依兰油，对油成分作了详细的分析。

植物耐旱的分子基础及植物耐旱基因工程的研究进展

对植物耐旱的分子基础。

海藻糖合酶基因的克隆及其植物表达载体的构建

从担子菌灰树花的菌丝体中提取总 RNA,并纯化出 m RNA,m RNA经反转录合成c DNA第一链 ,以 c DNA第一链为模板经 PCR扩增海藻糖合酶 ( Tsase)基因 ,获得一长约2 .2 kb的片段 ,把该片段连接到 p GEM○R- T- easy vector上进行测序 ,其全长共 2 1 99bp.随后将此片段以正向插入植物表达载体 p BI1 2 1的 35S启动子和 NOS终止子之间 ,构建了一植物表达载体 p BT;又把 ubi- L启动子插入 p BI1 2 1的 H ind + Xbal位点构建 p UB,再把海藻糖合酶基因以正向插入载体 p UB的 Bam H1 + Sst1位点构建了另一植物表达载体 p UBT.

香荚兰体细胞培养再生植株的研究

香荚兰幼茎在ＭＳ＋ＢＡ１＋ＮＡＡ５培养基上培养４０ｄ，其表面形成白色、团状的愈伤组织，这类愈伤组织可继代培养而增殖。愈伤组织在ＭＳ＋ＢＡ２－３＋ＮＡＡ（０．５）培养基上培养３０ｄ后形成许多颗粒状原球茎，原球茎可进一步继代增殖。将原球茎接种在１／２ＭＳ＋ＢＡ１＋ＩＢＡ（０．５）培养基上培养约３０ｄ，原球茎即可发育形成小植株，小植株进一步增殖形成丛生芽。无根苗在１／２ＭＳ＋１ＡＡ１培养基上培养２０ｄ后生根，移栽成活率达１００％。

大花蕙兰的组织培养

大花蕙兰的茎尖先诱导形成原球茎，再通过原球茎→原球茎→丛生芽→完整植株，可在短期内获得大量种苗。在原球茎或丛生芽的继代增殖过程中，在培养基中加入０．５～１．０ｇ／Ｌ活性炭，可抑制培养物产生红色的多酚氧化物，从而提高繁殖速度。

番茄种质的随机扩增多态性DNA指纹分析

建立番茄的RAPD反应体系。从 65个随机引物中筛选出 5个 (H11,H15,K6,G3,G5)建立 10个番茄种质的RAPD指纹图谱 ,共产生 4 8条带 ,大小在 30 0～ 30 0 0bp之间 ,其中 ,2 3条带 ( 4 8% )为公共带 ,2 5条带 ( 52 % )具有多态性。结果表明 ,G1与S2 。

植物分子育种概述

对植物分子育种的起源、分子育种技术途径、分子育种的研究进展及其技术的评价等进行了综合性概述，并对其未来做了初步的探讨。

海藻糖的研究进展及其应用前景

综述海藻糖的理化性质、来源、相关的酶及其对生物分子的保护特性、作用机理和可能的应用前景。

香兰素在香荚兰植物体中的分布

用气相色谱法分别对香荚兰幼苗的气生根、茎干、叶片及成龄植株的气生根、茎干、叶片、幼果及成熟果荚进行香兰素含量的测定。结果表明,在香荚兰植株的不同器官组织中，均有香兰素的存在，其含量由高到低的顺序为：成熟果荚、幼果、气生根、叶片、茎干。

黄花美冠兰的组织培养

利用黄花美冠兰的块茎和茎尖在ＭＳ培养基上先诱导出无菌芽，再通过丛生芽的途径不断继代增殖，最后诱导生根形成完整植株，达到快繁的目的．

甘蔗根癌农杆菌介导转化海藻糖合酶基因获得抗渗透胁迫能力增强植株

由双拷贝CaMV35S启动子驱动担子菌灰树花 (Grifolafrondosa)的海藻糖合酶基因 (TSase)构建植物表达载体 pBBBT ,通过三亲交配法将 pBBBT导入根癌农杆菌EHA10 5菌株 ,经根癌农杆菌介导转化甘蔗 (Saccha rumhybrid)栽培品种 ,以增强甘蔗的抗旱能力。结果表明 ,甘蔗胚性愈伤组织对EHA10 5菌株敏感 ,甘蔗外植体开始大量形成胚性愈伤组织时是感染的适宜时期 ,用膦丝菌素 (PPT)筛选 ,抗性植株发生频率平均为 4 .5 %。经PCR及dot Southern检测证明 ,TSase已经整合到甘蔗基因组中。部分转化植株根叶畸形、株型异常、生长缓慢。移栽到含PEG80 0 0 17.4 % (w/v)的MS培养基后 。

甘蔗花叶病和宿根矮化病多重PCR检测方法的建立

【目的】建立能同时检测甘蔗花叶病(sugarcane mosaic virus,SCMV)和宿根矮化病(ratoon stunting disease,RSD)的多重PCR检测方法。【方法】以病株带鞘叶组织总核酸反转录物为模板,根据中国甘蔗花叶病的主要致病病原高梁花叶病毒SrMV和甘蔗花叶病毒中国大陆优势株系SCMV-A,结合B、D、E和SC株系的外壳蛋白核苷酸序列的保守区设计PCR引物对和已有的检测甘蔗宿根矮化病病原木质部赖氏杆菌木质部亚种(Leifsonia xyli subsp.Xyli,Lxx)的PCR引物对,在SCMV RT-PCR和RSD单一PCR体系的基础上,建立并优化可同时检测SCMV和RSD的多重PCR检测方法。【结果】此检测方法可特异地从感染SCMV和RSD的样品中扩增出SCMV(400 bp)和RSD(265 bp)2个条带,扩增产物测序结果表明,SCMV扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为81%～99%,RSD扩增产物与GenBank中其它株系或分离物的核苷酸序列同源性为91%～99%。【结论】应用此检测方法可稳定、特异地检测出蔗株中是否有导致甘蔗花叶病和宿根矮化病的单一或混合的病原。