RHD新等位基因c.801+2T>G的鉴定及对RhD表型影响的体外功能探究

目的对于在1例血清学初筛为RhD阴性表型标本中鉴定出的RHD新等位基因c.801+2T>G,通过体外微基因剪接系统(minigene splicing assay)分析其对于RhD表型的影响。方法采用血清学方法对患者标本进行RhD血清学检测,并使用单克隆抗-D进行吸收放散试验。采用Sanger测序法对RHD基因进行序列分析,对鉴定出的RHD基因剪接位点新突变,构建pSplicePOLR2G微基因表达质粒,通过体外微基因剪接系统,采用琼脂糖及毛细管电泳对mRNA剪接结果进行检测和分析,预测其对RhD表型的影响。结果血清学检测显示患者血型为RhD阴性,抗-D吸收放散试验为阳性,表明其为Del表型。基因分型检测显示该个体为罕见基因型(RHD∗1227A/801+2G)个体。其中c.801+2T>G为内含子5的5′-端剪接位点新突变。体外微基因剪接分析试验显示该突变导致RHD基因外显子5在mRNA剪接过程中被完全切除,形成不包含外显子5的转录本。结论发现1例携带RHD基因新突变c.801+2T>G的个体,其虽表现为Del表型,但同时携带c.1227G>A的“亚洲型”Del表型特异性突变,所以基于体外微基因剪接试验结果,我们推测c.801+2T>G突变导致RhD抗原不表达或微量表达,可能表现为D阴性或Del表型。

罕见抗-Di^(b)致严重胎儿新生儿溶血病的实验室检测与相关研究

目的对1例高频抗体导致的胎儿新生儿溶血病(hemolytic disease of the fetus and newborn,HDFN)进行检测、鉴定及配血。方法对患儿进行新生儿溶血试验,对母亲进行血清学意外抗体鉴定,并对母亲红细胞进行常见高频抗原鉴定;对检出抗体进行IgG分型检测,并用流式细胞术进行单核细胞体外吞噬致敏红细胞试验,以检测抗体相关的吞噬率;对患儿母亲、父亲及舅舅进行相关红细胞血型基因测序;利用稀释的母亲血浆和抗人球卡法,在献血者中进行大规模相合血液的筛选。结果产妇鉴定为Di(b-)稀有血型,产生了抗-Di b(效价512)并导致了严重的HDFN;抗-Di b亚型分型为IgG1和IgG2型,单核细胞体外吞噬效率为88.83%(74.7/84.09);产妇亲属中没有相合献血者,后续从5520名献血者中筛选到2例Di(b-)相合血液,患儿接收输血治疗后康复出院。后续在51334名献血者中筛查到17名Di(b-)献血者,该数据表明Di(b-)在广州地区献血者中的分布频率约为三千分之一(0.033%,17/51334)。结论综合利用血型血清学及分子生物学方法诊断了抗-Di b所致的严重HDFN,建立了1种有效大规模筛查Di(b-)稀有血型的方法并找到相合血液,为建立Di(b-)稀有血型库奠定了基础。

抗Mur抗体引起的疑难交叉配血1例

MN血型是继ABO血型后被检出的第二个血型系统[1],但其抗体可引起严重输血反应。作者最近遇到1例抗Mur抗体引起的疑难配血,现报告如下。

广州地区无偿献血者抗-Mur筛查及Mur抗原基因型检测

目的了解广州地区无偿献血者中抗-Mur及Mur抗原基因型的频率,为指导临床输血及产前抗体监测提供依据。方法用微柱凝胶卡方法筛查2725名献血者血清中37℃有活性的抗-Mur;采用多重连接依赖的探针扩增技术(MLPA)对91名献血者的Mur抗原基因型进行检测,然后用人源抗-Mur血清检测Mur抗原基因型阳性样本的红细胞表型。结果无偿献血者血清中抗-Mur频率为0.04%(1/2725),Mur抗原基因型阳性频率为6.59%(6/91),经血型血清学方法验证基因型与表型符合率为100%(6/6)。结论广州地区无偿献血者中抗-Mur频率较低,而Mur抗原阳性则相对较常见;通过MLPA方法检测Mur抗原基因型可以准确推断其表型,解决了因缺乏商品化抗-Mur试剂导致Mur抗原鉴定难以开展的难题。

高通量红细胞血型基因分型的多重连接依赖的探针扩增技术在一例抗Di^a新生儿溶血病诊断中的应用

目的运用高通量红细胞血型基因的多重连接依赖的探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)辅助诊断一例罕见的由抗Di^a导致的严重核黄疸新生儿溶血病。方法运用传统的血型血清学方法对导致新生儿溶血病相关红细胞血型抗体进行鉴定,运用MLPA对患儿及其父母的超过40种红细胞血型抗原进行基因分型,对鉴定的抗体进行效价分析。结果血型血清学检测表明患儿体内含有针对某种低频抗原的抗体,MLPA基因分析结果提示母婴红细胞MNS血型系统及Diego血型系统抗原不匹配,可能存在抗N或抗Di^a,经进一步的血型血清学检测,证实母亲及患儿血清中存在抗Di^a,并且其母亲血清抗Di^a效价为1:32。结论抗Di^a可引起包括核黄疸在内的严重新生儿溶血病;高通量红细胞血型基因分型的MLPA技术能够协助并有效解决临床疑难样本稀有血型鉴定;针对国人的Di^a阳性的试剂红细胞应该常规应用于日常的抗体筛查工作中。

混合抗体型自身免疫性溶血性贫血的血型定型和抗体鉴定

【目的】建立合适的方法解决混合抗体型自身免疫性溶血性贫血的血型定型和抗体鉴定。【方法】分离标本的血清和红细胞,将红细胞进行轻度热放散和氯喹放散实验后,用于ABO正定型、Rh血型抗原分型和后续的自身吸收实验;取适量患者血清,加入等量O型红细胞进行抗体吸收,吸收后的血清用于ABO反定型实验;分别采用PEG法和自身吸收法对自身抗体进行吸收,比较两者的吸收时间、吸收次数、吸收后血清抗体鉴定结果;取适量红细胞进行乙醚放散,放散液用于抗体鉴定。【结果】21例患者的ABO血型得到正确鉴定,15例患者的Rh血型进行了正确定型。2种吸收方法处理后的血清抗体检测结果一致:检出自身抗体合并同种抗体7例,其中4例同种抗体得到确认,3例同种抗体特异性未明确;单纯自身抗体14例。PEG法总吸收时间为825 min,平均为39.3 min;总吸收次数55次,平均每例吸收2.6次;自身细胞放散后吸收实验总耗时为2 070 min,平均为98.7 min;总吸收次数66次,平均每例吸收3.1次。【结论】轻度热放散结合氯喹放散法适用于混合抗体型AIHA患者血型定型前的红细胞处理;PEG吸收法快速、简便、吸收效果好,适合用于临床实际工作。

广州地区无偿献血者人群中Jk(a-b-)表型筛选及分子遗传学研究

目的了解广州地区无偿献血者人群中,Kidd血型系统中Jk(a-b-)稀有血型个体的分布频率及分子遗传背景。方法用2 mol/L尿素溶解法,对50 000名广州血液中心无偿献血者中的Jk(a-b-)血型个体进行筛选。用传统的血型血清学方法对筛选到的Jk(a-b-)表型进行确证。随后从静脉血中提取DNA,PCR方法扩增Kidd血型系统编码基因Jk的所有编码外显子,并直接进行测序分析。结果在50 000名无偿献血者中共筛选到10名Jk(a-b-)血型个体,在广州地区无偿献血者人群中其分布频率约为0.02%。在对其中8名先证者基因分型中,共发现了2种基因型,纯合IVS5-1G>A(n=6),杂合IVS5-1G>A/杂合896G>A(299Gly>Glu)(n=2)。结论广州地区无偿献血者人群中,Jk(a-b-)的分布频率高于已报道的北方人群。高频率分布于太平洋波利尼西亚群岛的变异IVS5-1G>A,也是本人群中最常见的基因变异。

RhD变异型个体的表型类型和基因突变机制研究

目的:探讨RhD变异型个体的表型类型和基因突变机制。方法:收集2013年1月至2015年10月间经我中心用血清学方法确证的48例RhD变异型孕妇和献血者的血液标本,应用常规血清学方法进行Rh抗原分型后,提取血样DNA,用多重连接依赖探针扩增(multiple ligation-dependent probe amplification,MLPA)对入选的48例受检者的RHD进行检测,分析RHD的杂合性和外显子突变情况,并将MLPA检测结果与常规血清学结果进行对比。对比结果不一致的标本进行RHD外显子全长测序,并对其中新发现的等位基因进行克隆测序。结果:48例标本中,CcDee 20例(41.7%)、ccDEe 12例(25%)、CCDee 11例(22.9%)、CcDEe 5例(10.4%)。MLPA检出RHD单条等位基因突变(即杂合性为Dvd型)的38例,其中包含点突变18例、RHD/CE杂交替换20例;涉及两条等位基因突变(即杂合性为DvDv型)的10例,其中包含点突变合并RHD/CE杂交替换9例、碱基缺失合并RHD/CE杂交替换1例。MLPA能够明确其RhD变异型别的有41例(85.4%,41/48),包括弱D15型(845A)等位基因14例、RhDⅥtype 3等位基因22例;7例通过测序分析得以明确。发现2例新的等位基因,分别为79-81del CTC、689G>A。结论:CcDee是RhD变异型人群的主要表型,弱D15和RhDⅥtype 3是受检人群的主要RhD变异型,点突变和RHD/CE的杂交替换是主要的分子机制,79-81del CTC和689G>A为本研究发现的2个新等位基因。

广州地区汉族人群Diego血型系统多态性调查

目的了解广州地区汉族人群中Diego血型系统DI1(Dia)和DI2(Dib)、DI3(Wra)和DI4(Wrb)两对抗原的基因频率分布,为指导临床输血提供依据。方法随机收集广州地区献血者200名,从静脉血提取基因组DNA。采用红细胞血型系统多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术对DI1和DI2、DI3和DI4两对抗原进行基因分型。采用测序法对MLPA基因分型结果做进一步确认。结果广州地区汉族人群中DI1、DI2、DI3和DI4抗原的基因频率分别为0.040 0、0.960 0、0.000 0和1.000 0。MLPA基因分型结果与测序法分型结果完全一致。DI1和DI2、DI3和DI4抗原在广州地区汉族人群随机输血中抗原不配合率分别为3.84%和0.00%。结论 DI1和DI2抗原在广州地区汉族人群随机输血中不配合率较高,具有一定临床意义。通过MLPA方法可以对DI1和DI2抗原进行基因分型从而推测其表型,解决了因抗体来源困难导致抗原鉴定难以开展的难题。

多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术在广州地区RhD阴性献血者基因分型研究中的应用

目的采用新型Rh血型系统的MLPA检测试剂盒,对广州地区收集的200名RhD阴性献血者进行基因分型。方法采用传统的血型血清学方法,对RhD阴性献血者进行RhD表型鉴定。提取基因组DNA,采用MLPA检测试剂盒对收集的200名RhD阴性献血者进行RHD基因分型。对于不能明确分型的标本,进行RHD基因直接测序分析。结果在200名RhD阴性献血者中,采用MLPA方法对196名进行了明确的基因分型。其中,127名为RHD基因缺失(占63.5%);仅检测到包含RHD1227A突变的DEL等位基因有41例,其中38例包含杂合等位基因,其余3例包含纯合等位基因;仅检测到RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10)等位基因的有23例,其中19例杂合,4例纯合;3例包含2种不同的RHD等位基因(1条为RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10),另1条为RHD1227A);其余2例分别包含杂合的DFR-2(RHD-CE(4)-D)及弱D15型(RHD845A)等位基因。在其余4例直接测序分析的标本中,2例包含杂合的RHD711delC突变;1例1条等位基因为MLPA检测到的包含RHD1227A突变的DEL等位基因,另1条为包含711delC突变的RHD等位基因;其余1例的1条等位基因为MLPA检测到的RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10),另1条为包含新突变的RHD等位基因(1154G>T,385Gly>Val)。结论 MLPA检测试剂盒是适用于中国人群的1种快速、有效的高通量基因分型方法,能够对中国人群常见的各种RHD基因型进行明确分型,适用于参比实验室相关疑难标本的基因分型检测。也可应用于中国人群常见的Del表型检测,使Del表型患者不必再输注RhD阴性血液,节约稀有的RhD阴性血液资源。

罕见p表型家系的分子遗传基础研究

目的研究1例广东籍罕见p表型的血清学特点及其家系的分子遗传基础。方法先用血清学方法鉴定p表型,再提取先证者及其家系成员的静脉血基因组DNA,采用PCR方法扩增α-1,4半乳糖基转移酶[α-（1,4）galactosyltrans-ferase,A4GALT]基因外显子3,并对扩增产物进行直接测序分析。结果先证者及其家系成员中有5人为p表型,A4GALT基因有纯合的点突变c.100G】A（p.34Val】Ile）及组合缺失插入突变c.418428ins-del（p.140fs,211X）;家系成员中只有1人为P2表型,携带有上述杂合突变。

Rh血型系统新生儿溶血病的实验诊断及特殊反应分析

目的探讨Rh血型系统新生儿溶血病的实验诊断和特殊试验结果分析。方法收集Rh系统新生儿溶血病标本12例,母血标本12例,测定其ABO和Rh血型。新生儿标本行溶血病3项实验,新生儿血清、放散液、母血清行不规则抗体筛选和鉴定实验,并测定相应抗体的效价。结果有1例患儿标本RhD血型放散前定型为阴性,放散后为阳性;患儿标本溶血病3项实验均阳性;引起溶血病的抗体中,IgG抗-D 9例,IgG抗-E检出2例,IgG抗-c合并抗-D1例;母血清中的IgG抗-D效价介于128~2048,IgG抗-E效价介于64~256;患儿血清中游离的IgG抗-D效价介于2~512,IgG抗-E效价介于4~32。结论直接抗人球蛋白实验和放散实验对于诊断Rh系统溶血病具有重要意义;特殊反应要综合分析处理,获取真实结果;临床输血或换血治疗时,要根据患儿体内的抗体情况进行血液选择。

产生抗D的DVI type 3型孕妇免疫血清学和RHD基因型分析

目的:对部分D表型孕妇进行免疫血清学和RHD基因型分析。方法:采用常规血型血清学方法鉴定孕妇RhD血型,并进行血型特异性抗体筛查和鉴定;采用序列特异性引物聚合酶链反应(polymerase chain reactionsequence specific primer,PCR-SSP)鉴定孕妇RHD基因型;采用多重连接依赖的探针扩增技术(multiplex ligationdependent probe amplification,MLPA)对孕妇及其配偶和女儿的RhD血型抗原进行基因分型及遗传分析。结果:该孕妇血清中检测出IgG抗-D,其抗体效价为1∶8。PCR-SSP结果显示,该孕妇RHD基因第3-6外显子缺失,经鉴定该孕妇RHD基因型为DVI type 3型。MLPA分析显示,该孕妇只有1条RHD等位基因,且缺失3-6外显子,其基因型为CDVIe/cde,其配偶为CDe/CDe纯合子基因型,女儿为CDe/CDVIe基因型。结论:准确的RhD血型鉴定对制定安全有效的临床输血策略和对育龄妇女采取恰当措施及预防新生儿溶血病具有重要意义。

32名RhD变异型献血者分子遗传背景研究

目的对广州地区收集的32例RhD变异型献血者进行基因分型,以了解RhD变异型在广州献血者中的分布情况。方法采用传统血清学方法,对2016年6月—2017年1月的RhD变异型献血者进行RhD表型鉴定。提取基因组DNA,采用MLPA检测试剂盒对收集的32例RhD变异型标本进行RHD基因分型。对于不能明确分型的标本,使用Sanger测序法对RHD基因进行测序分析。使用D-Screen试剂盒对RhD变异型标本的RhD抗原表位行进一步检测。结果在32例RhD变异型标本中:检出RHD~*DVI.3/01N.01 8例、RHD~*DVI.3/DVI.3 1例、RHD~*weak partial 15/01N.01 7例、RHD~*960A/01N.01 3例、RHD~*weak D type 25/01N.01 3例、RHD~*weak D type 72/01N.01 2例、RHD~*D-CE(4)-D-CE(10)/01N.01 1例、RHD~*95A/01N.01 1例、RHD~*710T/01N.01 1例、RHD~*DVI.3/01EL.01 1例、RHD~*weak partial 15/01EL.01 1例、RHD~*weak D type 25/01EL.01 1例、RHD~*DVI.3/D-CE(3-9)-D 1例和RHD~*538A/D-CE(2-9)-D 1例。结论弱部分D15和部分DVI.3是广州地区献血者人群中最常见的RhD变异型。MLPA基因分型方法是1种有助于检出这2种不同RHD突变型等位基因的方法。

弱D25变异型血型抗原表位分析及输血策略探讨

目的对1例输注阳性血液的D变异型患者进行Rh血型血清学及分子生物学鉴定,并对其进行不规则抗体检测,探讨该D变异型的输血策略。方法采集患者标本,用2种不同的单克隆抗-D试剂鉴定D抗原,并用试剂盒检测D变异体抗原表位,Rh CE抗原分型,红细胞直接抗球蛋白试验,不规则抗体筛查;采用多重链接酶依赖的探针扩增（MLPA）方法检测RHD及RHCE基因型,对于MLPA检测不到的RHD突变型等位基因,对RHD基因全部10个外显子进行PCR扩增及产物直接测序分析。结果该患者初步D抗原鉴定结果显示为D抗原弱表达,且直接抗球蛋白试验阴性;D抗原表位检测结果显示其红细胞与D抗原ep D5.4、ep D2.1和ep D3.1表位特异性单克隆抗体产生弱凝集反应,与其余表位抗体均无凝集反应,大量输注D阳性血液后的168 d及232 d抗体筛查结果均为阴性;Rh CE抗原分型为cc Ee,MLPA结果显示其基因型为RHD/d,RHCE基因MLPA基因分型结果与血清学表型一致;RHD基因外显子直接测序发现其第3外显子携带纯合的c.341G〉A（p.Arg114Gln）错义突变。结论患者为弱D25变异型,对弱D25型的D抗原进行表位分析的显示其部分抗原表位缺失。该患者大量输注阳性血液后未产生抗-D,为制定该血型患者的临床输血策略提供数据。

100例RhD初筛阴性孕妇D放散型表型筛查及基因型分析

目的对100例Rh D阴性孕妇进行D放散型（Del）表型筛查及基因型分析,同时进行抗体筛查和鉴定,以指导Del血型孕妇的产前监测。方法 2016年2月—2016年11月期间,收集100例多次妊娠且初筛为Rh D阴性的孕妇外周血标本,采用抗球蛋白凝胶卡法检测Rh D血型,抗球蛋白凝胶卡法进行直接抗球蛋白试验;采用Rh血型分型卡检测Rh CE抗原;抗球蛋白凝胶卡法进行不规则抗体筛查及抗体鉴定。采用吸收放散试验进行Del血型表型鉴定,同时采用序列特异性聚合酶链反应（PCR-SSP）进行RHD＊01EL.01（RHD＊1227A）等位基因检测,应用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）对Del表型标本RHD基因合子型进行进一步分析;对D变异型标本,进行D抗原表位检测（D-Screen）和RHD基因10个外显子的PCR扩增及直接测序分析。结果 100例标本中检出Del表型27例（27%）,均没有产生抗-D,其中21例Rh CE抗原分型为Ccee（77.8%）,4例为CCee（14.8%）,2例为Cc Ee（7.4%）;25例RHD基因型为RHD＊01EL.01/01N.01（92.6%）,2例RHD＊01EL.01/RHD＊01EL.01（7.4%）。此外还检出D变异型4例（4%）,其中包括2例部分DⅥ3,1例弱D25和1例弱D15,均未产生抗-D。检出Rh D真阴性血型69例,其中产生抗-D 9例（12.7%）,且有2例合并抗-C;产生抗-c E合并抗-Jkb1例。结论携带有RHD＊01EL.01等位基因的＂亚洲型＂Del血型孕妇在Rh D阳性胎儿的免疫刺激下,很可能不会产生抗-D,属于完全性Del（complete Del）血型。

弱D72血型的血清学特征及分子生物学分析

目的了解广州地区人群中弱D72血型的血清学特征及分子遗传背景。方法从广州血液中心献血者人群中收集了62人份D变异型标本,采用多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术做RHD及RHCE基因分型;对于MLPA检测不到的RHD突变型等位基因,对其10个外显子做直接测序分析,并采用D抗原表位分析试剂盒(DScreen)及其他7种单克隆抗-D做D抗原表位血清学检测。结果在62例D变异型标本中,共发现26例弱D表型,其中弱D72突变型等位基因5例[占8.1%(5/62)],4例为RHD*weak D type 72/RHD*01N.01(RHD基因缺失)和Ccee,1例为RHD*weak D type 72/RHD*DVI.3和CCeee。取1例RHD*weak D type 72/RHD*01N.01的红细胞标本做D抗原表位血清学检测:其与D-Screen试剂盒的9种单克隆抗-D均呈阳性反应,反应强度为1+~2+,与其余7种单克隆抗-D也均呈阳性反应,反应强度为w+~1+。结论血型血清学分析初步提示弱D72血型D抗原表位完整,但该血型个体在免疫刺激下是否不会产生抗-D仍需进一步临床证据证实。

高通量MLPA基因分型技术在1个D^(el)表型家系基因鉴定中的应用

目的对1个Del表型家系作基因鉴定。方法运用血型血清学方法对先证者及其家系的3名成员作RhD及相关血型抗原鉴定;提取先证者及其父母和妹妹的静脉血DNA。运用高通量红细胞血型基因的多重连接依赖探针扩增技术(MLPA)对先证者及其他成员血型基因作定性及定量分型;用PCR产物直接测序方法对发现的变异作确认。结果血型血清学检测:先证者为Del表型,其他3名家系成员为正常的RhD阳性个体。MLPA基因分型:先证者有2条包含1227G>A突变位点的RHD等位基因,而3名家系成员有1条包含1227G>A突变位点的RHD等位基因及1条正常的RHD等位基因。结论高通量红细胞血型基因分型的MLPA技术能够对Del表型作明确的基因鉴定,有助于节约宝贵的RhD阴性血液。

疑难配血中混合抗体鉴定1例

目的探讨疑难配血过程中混合抗体的鉴定方法。方法首先鉴定红细胞血型,并对血清进行抗体筛查及鉴定,再利用特定细胞对患者血清进行吸收放散实验分离抗体,最后分别对分离后的抗体进行鉴定。结果患者血型为O型,Jka+b-,CCDee;用O型CCDee,Jkb+的细胞与患者血清进行吸收放散,分离抗体后鉴定结果为抗-cE、抗-Jkb的混合抗体。结论选择合适的细胞进行吸收放散实验分离抗体,可以实现对混合抗体的鉴定,为患者选择相应抗原阴性的血液,保证临床输血安全。

广州地区人群中RHD* 960A突变型等位基因的鉴定及血型血清学与分子生物学特征分析

目的分析广州地区人群中RHD*960A突变型等位基因个体的血型血清学与分子生物学特征。方法收集RhD变异型标本,采用2种不同的单克隆抗-D试剂鉴定RhD血型,抗球蛋白凝胶卡法进行直接抗球蛋白试验,并用RhD抗原表位检测试剂盒(D-Screen)检测RhD抗原表位;此外,采用Rh血型分型卡检测Rh CE抗原;采用多重连接酶依赖的探针扩增(MLPA)方法检测RHD及RHCE基因型;对MLPA方法无法给出检测结论的标本,进行RHD基因全部10个外显子的PCR扩增及产物直接测序。结果发现3例RhD变异型标本,直抗阴性,初步血清学结果显示RhD抗原弱阳性表达,RhD抗原表位检测结果显示其红细胞与RhD抗原epD6.6、epD8.2和epD9.1表位特异性单克隆抗体无凝集反应,与其余表位抗体呈弱阳性凝集反应;RHCE抗原分型1例为CCee,其余2例为Ccee;RHD基因的MLPA基因分型显示其基因型为正常的RHD/d(即未鉴定出其携带的突变型RHD等位基因),后续RHD基因外显子直接测序发现其第7外显子携带c.960G>A(p.Leu302Leu)同义突变,RHCE基因MLPA基因分型结果与血清学表型一致。结论首次在广州地区人群中发现了RHD*960A突变型等位基因个体,并进行血清学抗原表位和基因型检测,其血清学表现为部分D。