新型H3N8亚型禽流感病毒SQ03株的分离鉴定与免疫原性评价

为研究我国H3N8亚型禽流感病毒(AIV)遗传变异情况,研究从江苏某商品蛋鸡群采集病料进行病原分离鉴定、血凝素(HA)基因遗传进化分析、SPF鸡回归试验,并采用分离病毒制备油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡,评价其免疫原性。结果显示:分离病毒为新型H3N8亚型(AIV),命名为A/chicken/Suqian/SQ03/2022(H3N8),以下简称SQ03株;该分离株HA基因属于欧亚禽分支,HA蛋白的裂解位点为PEKQTR↓GLF,为低致病性AIV,与我国2021—2022年分离的鸡源H3N8亚型AIV同源性最高,核苷酸相似性为98.6%~99.5%,而与我国2005年分离的鸭源毒株核苷酸相似性仅为87.8%,并且HA基因发生了较大的遗传变异;SQ03株按照106.0 EID50/只滴鼻途径感染SPF鸡后第3天出现甩鼻、张口呼吸等临床症状,感染后第5天排毒率达到100%,剖检可观察到鼻甲和气管内有黏液渗出物、肾脏肿大等病变;SPF鸡免疫油乳剂灭活疫苗后14 d HI抗体效价几何平均值达到8.2 log2,免疫后21 d达到10.3 log2,可为免疫鸡提供针对H3N8亚型AIV的完全攻毒保护。研究表明,SQ03株为我国当前流行的新型H3N8亚型AIV,具有较强致病性和良好的免疫原性,可作为新型H3N8亚型禽流感灭活疫苗的效力检验用毒和疫苗候选株。

双黄连口服液对H9亚型禽流感的预防和治疗效果

为了评价双黄连口服液对H9亚型禽流感的预防和治疗效果,分别在SPF鸡感染H9亚型禽流感病毒前和感染后口服双黄连口服液,病毒感染后3、5、7、10 d采集喉头和泄殖腔棉拭子,通过实时荧光定量RT-PCR检测排毒率,并在感染后5、7 d剖检观察组织病变,进行病理组织学观察。结果显示,双黄连口服液可降低H9亚型禽流感病毒感染鸡的排毒率,缩短排毒周期,治疗组和预防治疗组病毒感染后10 d排毒率为0,极显著低于病毒感染组排毒率6/10(60%)(P<0.01);治疗组和预防治疗组SPF鸡在感染后5 d和7 d喉头、气管黏膜、肺脏的组织损伤较小;且与治疗组相比,预防治疗组排毒率更低,喉头、气管、肺脏组织病理损伤更轻微。结果表明,双黄连口服液不仅可降低感染鸡的排毒率,缩短鸡体排毒时间。针对呼吸道病原,双黄连口服液预防治疗效果优于感染后治疗效果。该研究为双黄连口服液更好地应用于临床呼吸道疫病的防控提供了新的策略。

鸭IFN-γ,IL-2 mRNA荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

为评价疫苗免疫对鸭细胞免疫应答反应的影响,本研究提取鸭脾脏组织总RN A,采用鸭IFN-γ、IL-2、GAPDH基因特异性引物,建立了SYBR Green I荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法。结果显示IFN-γ、IL-2、GAPD H基因扩增标准曲线相关系数均高于0.99;3者扩增效率相近,均接近于100%;融解曲线呈特异性单峰;各基因组内和组间变异系数均小于2%。应用该方法检测不同佐剂禽流感灭活疫苗免疫樱桃谷鸭后脾脏组织IFN-γ和IL-2 mRNA的相对表达水平。结合免疫后抗体水平及攻毒保护结果,比较不同佐剂对禽流感灭活疫苗免疫应答的影响。结果显示,金黄色葡萄球菌毒素A重组蛋白(rSEA)佐剂组IFN-γ和IL-2 mRNA表达水平显著高于其他免疫组(p<0.05)。结果表明,建立的qRT-PCR特异性、重复性和稳定性良好,能够快速、准确检测鸭体内细胞因子的表达水平,为进一步评价疫苗免疫效果奠定了基础。

重组禽流感病毒二价灭活疫苗对H5N1亚型7.2分支病毒的攻毒保护性研究

为有效防控2006年以来出现的H5亚型7.2分支禽流感病毒(AIV)引起的免疫鸡群高致病性禽流感(HPAI)的流行,我们构建了重组AIV Re-4疫苗株,研制出含有重组AIV Re-4株的H5亚型二价系列灭活疫苗,并在我国北方地区使用,有效地控制了其流行。2012年我国北方地区再次出现7.2分支病毒引起的HPAI疫情。为评估现有H5亚型二价系列灭活疫苗对该分支病毒的免疫保护效力,本研究首先通过SPF鸡进行免疫攻毒试验评估。结果表明,分别以每羽份(0.3 mL/只)的Re-5+Re-4株和Re-6+Re-4株重组AIV H5二价油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡,免疫3周后针对重组AIV Re-4株的HI抗体均达到8 log2以上;经鼻腔接种7.2分支AIV CK/NX/2/12株(100 LD50)攻毒后,免疫鸡均获得完全保护,即无任何临床症状和排毒现象,而对照组SPF鸡全部发病死亡。此外,以哈尔滨当地养殖场中免疫H5亚型AIV灭活疫苗的48只商品蛋鸡进行攻毒试验,结果显示,商品蛋鸡血清中针对重组AIV Re-4株HI抗体平均滴度为8.3 log2,采用相同方式攻毒后也获得完全保护。本研究结果表明,Re-5+Re-4株和Re-6+Re-4株重组AIV H5二价灭活疫苗均能够对H5亚型7.2分支病毒的攻击提供良好的免疫保护效果。

重组禽流感病毒灭活疫苗(H9N2亚型,Re-9株)对2010年～2011年流行病毒株免疫效力的研究

为评价H9N2亚型重组禽流感病毒(AIV)灭活疫苗Re-9株的免疫效力,本研究选取2010年～2011年分离的5株H9N2亚型AIV进行攻毒保护实验。这5个分离株均为类A/CK/Beijing/1/94病毒株,其HA和NA基因与Re-9株及其亲本株的同源性介于90.6%～97.5%和88.1%～98.7%之间,其抗原相关值在66.67%～100%之间。将Re-9株为种毒制备灭活疫苗,免疫4周龄SPF雏鸡后,3周时平均HI抗体效价达9.5 log2;在免疫后3周以2×107EID50的剂量攻击亲本株和5株流行病毒株,攻毒后采集3 d、5 d、7 d的拭子,免疫组拭子样品病毒检测均为阴性;对照组3 d、5 d拭子病毒检测的阳性率均在80%以上,7 d的阳性率在60%以下。以上结果表明灭活疫苗Re-9株抗原针对性强,而且具有良好的免疫效力,能够抵御近年来分离的H9N2亚型AIV,是理想的H9N2亚型禽流感疫苗株。

H9N2亚型禽流感病毒样颗粒制备及免疫原性评价

H9N2亚型禽流感病毒近年来在家禽中普遍发生,可造成蛋鸡产蛋量下降,肉鸡复合型呼吸道疾病,给养禽业造成了巨大的经济损失。本研究筛选保护谱广的H9N2亚型禽流感病毒流行株的HA、NA、M1基因,以共表达的方式构建重组杆状病毒。通过血凝活性检测、Western blot杂交、电镜观察等方法对蛋白表达及病毒样颗粒的组装进行鉴定。结果表明,构建的重组杆状病毒可同时表达HA、NA和M1蛋白,且表达的蛋白具有良好的血凝活性,电镜观察可见约100 nm的病毒样颗粒。将表达的蛋白制备油乳剂亚单位疫苗并免疫SPF鸡,免疫后诱导的HI抗体与全病毒灭活疫苗的HI抗体效价水平相当,且对异源毒株具有良好的交叉保护。

重组SEA增强H5亚型禽流感灭活疫苗对肉鸡的免疫效果研究

为评价重组葡萄球菌肠毒素A(rSEA)对H5亚型禽流感病毒(AIV)灭活疫苗免疫效果的影响,本研究以原核表达的rSEA为免疫增强剂,制备成含有rSEA高(167μg/0.5 mL)、低(16.7μg/0.5 mL)两种剂量的AIV油乳剂灭活苗,分别免疫7 d龄肉鸡,通过检测免疫鸡AIV HI抗体滴度及外周血CD4+/CD8+值评价其免疫效果。HI抗体检测结果显示,免疫后2周高剂量组HI抗体平均滴度为5.6 log2,低剂量组为4.2 log2,而无rSEA疫苗对照组为2.9 log2(p<0.01);同时在免疫后前4周,rSEA免疫组的HI抗体平均滴度及峰值与对照组相比均差异显著(p<0.05)。T淋巴细胞亚群检测结果显示,肉鸡免疫高剂量rSEA的灭活苗后,其外周血CD4+百分含量及CD4+/CD8+值均显著高于对照组(p<0.05)。上述结果表明,rSEA作为AIV灭活苗免疫增强剂,能够快速诱导较高的HI抗体滴度,同时也可增强细胞免疫反应,有效缩短免疫空白期,使肉鸡短时间内产生较强的免疫应答反应。

3株鸡传染性贫血病毒的分离鉴定、VP1基因遗传进化分析及致病性评价

为了解国内鸡场鸡传染性贫血(CIA)的流行状况和鸡传染性贫血病毒(CIAV)的遗传变异规律,以期对CIA的传播流行和预警防控提供技术支持。本试验对2020年在3个省份疑似发生CIA的3个规模鸡场采集10份组织脏器样品,应用鸡胚进行病毒的分离培养,并对培养物进行CIAV PCR检测,进而对CIAV阳性样本进行VP 1基因扩增和测序,应用Lasergene和MEGA 6.0软件,对获得的所有分离毒株结构蛋白VP 1基因序列与GenBank中CIAV参考毒株进行比对,构建系统发育进化树,同时对分离的CIAV毒株进行动物回归试验,评价其对鸡的致病性。结果显示,10份样品中3份为CIAV阳性,共分离到3株CIAV,分别命名为202006-NX-4-2、202006-SD-2-1和202006-JX-016。VP 1基因相似性分析显示,3株CIAV分离株核苷酸相似性介于97.7%~99.6%,且均与国内分离株具有较高同源性;氨基酸序列分析显示,3株CIAV分离株毒力相关位点均与国内强毒株GD-101株一致。遗传进化分析结果显示,3株分离株属于同一进化分支(Ⅱ分支),202006-SD-2-1株和202006-JX-016株与JL15120株进化关系最近,202006-NX-4-2株则与以国内强毒株GD-101株为代表的其他Ⅱ分支参考株进化关系最近。动物回归试验结果显示,3株CIAV均能够引起1日龄鸡发生严重的淋巴器官萎缩、骨髓黄化,为典型的高致病性病毒株特征。本试验结果为当前国内CIAV的流行、毒株的遗传变异分析及相关疫苗研发提供了参考依据。

H9亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗对流行毒株的免疫保护研究

为评价H9N2亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗对流行毒株的免疫保护效果,将禽流感病毒HF株灭活疫苗和商品化鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗分别以0.3 mL/只接种21日龄SPF鸡,3周后采血测定HI抗体效价,并用2018年-2019年分离的4株H9亚型禽流感病毒分别进行攻毒。结果显示,免疫后21 d,HF株灭活疫苗免疫组HI抗体效价达到9.1 log2以上,商品化疫苗HI抗体效价几何平均值则为6.3 log2以内。4株H9亚型禽流感病毒流行毒株以10^(7.0)EID_(50)的剂量静脉攻毒后,HF株灭活疫苗免疫组可抵抗流行毒株的攻击,保护率为100%;而商品化疫苗对流行毒株的攻毒保护率仅为40%~60%。说明H9N2亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗具有较强的免疫原性,能使免疫鸡抵抗流行毒株的攻击。

H9亚型禽流感病毒HF株的分离鉴定和免疫原性评价

2015年,从安徽合肥某养鸡场分离出一株H9N2亚型禽流感病毒(AIV),命名为HF株。该毒株鸡胚半数感染量(EID50)为10^9.17/0.1 mL,最小致死量的平均死亡时间(MDT)为87 h。对其HA基因分析发现,其氨基酸裂解位点为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV特征;HA基因的遗传进化分析结果表明,该分离株属于h9.4.2.5谱系,符合当前毒株流行趋势。将HF株与2006-2018年分离自全国各地的10株H9N2亚型AIV分离株同时制备灭活疫苗,免疫SPF鸡,制备阳性血清,通过交叉血凝抑制试验分析病毒抗原性,结果显示HF株与2014年之前毒株抗原相关性介于0.50~0.56之间,与2014年及之后毒株抗原相关性介于0.89~1.00之间,表明该分离株与2014年之后的流行毒株具有良好的抗原相关性。用0.2%甲醛灭活HF株病毒液,其HA效价在灭活前后未发生变化;用灭活抗原制备油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡,免疫后21 d HI抗体效价几何平均值达到9.0log2以上,可使免疫鸡完全抵抗H9亚型AIV的感染,提供100%的攻毒保护。研究结果表明,HF株具有良好的免疫原性,可作为疫苗候选株用于H9N2亚型禽流感疫苗的研制。

鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗在商品肉鸡上应用效果评价

为了评价鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(以下简称新流二联苗)的实际应用效果,试验将30 000只8日龄AA肉鸡分为2组,29 900只经颈部皮下注射新流二联苗(0.15 mL/只),作为免疫组,另外100只鸡不免疫作为对照组。AA肉鸡免疫新流二联苗后观察鸡群精神状态、采食、饮水等情况及注射部位反应和疫苗吸收情况,于免疫当天、免疫后第14天、第31天(出栏当天)对鸡只称重,进行安全性评价;在免疫当天和免疫后第7,14,21,31天测定免疫组和对照组鸡新城疫病毒(NDV)和H9亚型禽流感病毒(AIV)HI抗体,并于免疫后第14天进行NDV和H9亚型AIV攻毒保护试验,进行有效性评价。结果表明:安全性评价中,鸡群免疫后无任何不良反应,免疫后对肉鸡体重无明显影响,注射部位剖检观察均未见异常,免疫后14天疫苗吸收良好。免疫效力方面,试验鸡免疫后至出栏NDV和H9亚型AIV HI抗体仍然保持在较高水平。免疫后第14天进行攻毒保护试验,NDV攻毒后免疫组鸡无发病死亡,病毒分离阳性率为0;H9亚型AIV攻毒后免疫组病毒分离阳性率为0。说明新流二联苗在肉鸡上使用安全性和免疫效果均较好,且与传统疫苗相比,具有免疫剂量低、疫苗吸收快、抗体产生快的优势。

鸡减蛋综合征病毒EDSV-HX株的分离鉴定与免疫原性评价

为研究某发病鸡群病料中所分离病毒的遗传特性、致病性及免疫原性,通过流行病学、基因序列测定、血凝和血凝抑制试验,确定所分离的病毒为鸡减蛋综合征病毒(EDSV),并命名为EDSV-HX株。随后制备该毒株的油乳剂灭活疫苗,分别以不同剂量免疫蛋鸡,并根据HI抗体效价将免疫蛋鸡重新分为不同的抗体水平组进行攻毒试验。结果显示:当免疫鸡HI抗体效价不低于7log2时,可为免疫蛋鸡提供有效攻毒保护,且产蛋不受影响。研究表明EDSV-HX株具有高致病性和良好的免疫原性,可作为效力检验用毒及灭活疫苗的候选株。

新城疫基因Ⅶ型多联灭活疫苗的研究

本研究旨在研制鸡新城疫(NDV)基因Ⅶ型多联灭活疫苗。利用基因Ⅶ型N7a株病毒液浓缩适当倍数后灭活制备抗原,与浓缩的鸡传染性支气管炎(IB)等抗原等比混合,制备新流二联、新支流三联和新支流法四联苗,免疫SPF鸡评价其近期免疫效力和免疫持续期。结果显示:用浓缩N7a抗原制备的联苗ND HI为8.1~8.4log2,高于未浓缩N7a抗原制备的新支流法四联苗(ND HI为7.4log2);浓缩与未浓缩N7a抗原制备的四联苗IB、AI和IBD抗体无明显差异,浓缩N7a抗原制备的新支流法四联苗免后6个月各组分抗体水平依然达到保护标准。综上,基因Ⅶ型NDV N7a株可用于制备新流二联苗、新支流三联苗和新支流法四联苗,不同组分之间抗原相容性好,且新支流法四联苗的免疫持续期可达6个月。

新佐剂新流二联浓缩苗与常规新流二联苗肉鸡免疫效果比较

为比较新型油佐剂鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联浓缩灭活疫苗(以下简称“新佐剂新流二联浓缩苗”)与常规油佐剂鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(以下简称“常规新流二联苗”)在商品肉鸡上的免疫效果,本研究用7日龄AA肉鸡对两种疫苗的安全性和有效性进行评价。安全性评价结果表明,商品肉鸡免疫新佐剂新流二联浓缩苗和常规新流二联苗后无任何不良反应,两种疫苗对肉鸡生长无影响,但新佐剂新流二联浓缩苗使用剂量免疫后14 d疫苗即可完全吸收,而常规新流二联苗免疫后28 d疫苗才能完全吸收。效力评价结果表明,与常规新流二联苗相比,新佐剂新流二联浓缩苗免疫后抗体产生速度快、滴度高、均匀度好,免疫后7 d即可为免疫鸡提供针对NDV和H9亚型禽流感的完全攻毒保护,保护效果优于常规新流二联苗。研究结果显示,新佐剂新流二联浓缩苗在肉鸡上安全、有效,具有疫苗粘度低、免疫剂量小、抗体产生快、疫苗吸收快的优势,适合大范围应用于肉鸡。

基因Ⅶ型新城疫病毒分离鉴定及免疫原性研究

旨在分离筛选免疫原性好的新城疫病毒(NDV)流行毒株。从发病鸡组织中分离到4株病毒,经血凝和血凝抑制试验鉴定为NDV,进而完成致病指数测定、F基因高变区测序和遗传进化分析,并通过鸡胚交叉中和试验和攻毒试验研究PLK-N-06株对比La Sota疫苗株的抗原差异和免疫保护效力。结果显示,4个分离株的致病指数均属速发型NDV范围,且PLK-N-06株毒力最强;F蛋白裂解位点均为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株特征。遗传进化分析表明,分离株均为Ⅶd亚型。交叉中和试验结果显示,PLK-N-06株和La Sota株存在显著的抗原性差异。用PLK-N-06株油乳剂灭活苗免疫接种SPF鸡后产生的HI抗体效价几何平均值为1∶338,显著高于La Sota疫苗(1∶69),且其对PLK-N-06株感染的排毒率为0/10,明显低于La Sota株油乳剂灭活苗的4/10,结果表明PLK-N-06株具有良好的免疫原性,为新城疫基因Ⅶ型新型疫苗的研发奠定了基础。

人新型冠状病毒与禽冠状病毒遗传进化关系简析

2019年底暴发的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情对全球人类健康构成了严重威胁。为研究其病原(SARS-Co V-2)与禽冠状病毒之间的关系,将两者进行了基因序列比对、遗传进化分析、蛋白结构比较及交叉血清学检测。结果显示:SARS-Co V-2与禽冠状病毒的基因组序列相似性仅为44.7%~50.7%,遗传进化距离较远;两者S蛋白空间结构相似度低;SARS-Co V-2 S蛋白与禽冠状病毒阳性血清无交叉反应。表明这两种病毒在基因和蛋白水平均存在较大差异。研究提示:这两种冠状病毒可能很难突破人类与禽类的种间屏障实现跨种传播,SARS-CoV-2通过感染家禽并进一步威胁公共卫生安全的风险甚小。

禽流感H7N9亚型病毒样颗粒疫苗的制备与免疫效果评估

为了获得能代替商品化灭活苗的禽流感H7N9亚单位疫苗,试验将H7N9亚型禽流感病毒的HA基因跨膜区进行点突变,构建同时表达HA、NA和M1基因的供体质粒;然后将供体质粒转化至DH10Bac感受态细胞中,获得重组杆粒(Bacmid);将鉴定正确的重组Bacmid转染Sf9细胞,对重组杆状病毒表达的蛋白进行血凝试验、Western-blot、SDS-PAGE、透射电镜、免疫原性等一系列评价。结果表明:重组杆状病毒表达的蛋白液HA效价可达1∶2048;Western-blot显示出现3条特异性条带;透射电镜可见与禽流感病毒结构类似的颗粒物;表达的病毒样颗粒(VLPs)蛋白制备成疫苗,HI效价略高于商品化疫苗。说明3种蛋白能自我组装成VLPs,该VLPs疫苗具有良好的免疫原性。

2022年上半年我国主要家禽养殖地区常见疫病的病原检测与结果分析

为了解当前我国家禽养殖业中疫病流行情况,分析疫病流行趋势、制定防控策略,本研究对2022年1~6月份来自全国主要家禽养殖地区的病料送检情况和检测结果进行统计分析。分子生物学核酸检测结果表明,鸡群中低致病性禽流感H9亚型病毒和传染性支气管炎病毒(IBV)检测阳性率相对较高,分别为20.36%、41.03%,也是呼吸道疾病的主要病原;序列检测表明,H9亚型AIV和IBV的优势流行分支分别为h9.4.2.5和QX型;水禽中鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鹅/番鸭细小病毒(GPV/MDPV)、鸭圆环病毒(DuCV)、鸭甲型病毒性肝炎3型(DHAV-C)、新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)检测阳性率较高。病原分离和16s rRNA基因测序表明,家禽送检样品中大肠杆菌、沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、滑液囊支原体检出率较高。组织病理学检测表明,由禽白血病病毒(ALV)和禽网状内皮组织增生病病毒(REV)引起的肿瘤性疾病依然是目前家禽养殖业防控的重点和难点。

G1-like型禽H9N2亚型重组流感病毒的拯救及免疫原性评价

为拯救具有高复制特性的G1-like型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)疫苗候选株,利用反向遗传操作技术,将高复制特性H9N2亚型CZ株(Y280-Like)的6个内部基因(PB2、PB1、PA、M、NP、NS)与H9N2亚型40926株(G1-like)的HA和NA基因进行重配,构建G1-like型重组病毒。通过HA、HI试验及基因测序对拯救病毒进行鉴定,并对病毒在鸡胚上的复制能力、遗传稳定性及免疫原性进行评价。结果表明,利用6+2质粒系统成功拯救出G1-Like型H9N2亚型重组流感病毒,并具有良好的复制特性和遗传稳定性;将拯救的重组病毒株灭活后免疫SPF鸡,能刺激产生较高的HI抗体,为防控G1-like型AIV流行提供了技术和疫苗候选株储备。

鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗的安全性和有效性

为研究鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感(H9亚型)三联灭活疫苗(N7a株+M41株+SZ株)(以下简称"三联苗")的应用效果,使用14日龄AA肉鸡和210日龄蛋鸡进行安全性和有效性研究。安全性研究结果表明,三联苗免疫肉鸡后鸡群精神、采食等状况无任何异常,注射部位无溃烂、肿胀、发炎等症状,各时间点体质量与对照组无明显差异,出栏当日疫苗完全吸收;三联苗免疫蛋鸡后鸡群无任何不良反应,产蛋率与对照组无明显差异。有效性研究中,肉鸡免疫后抗体HI效价持续升高,出栏当日NDV、IBV和H9 AIV HI抗体效价达到高峰,分别为8.8 log2、6.7 log2、9.3 log2;攻毒保护结果表明,免疫后21 d,三联苗能对新城疫和禽流感(H9亚型)提供完全保护。蛋鸡免疫后21 d NDV、IBV和H9 AIV HI抗体效价达到最高,分别为11.6 log2,8.9 log2,12.1 log2,而后逐渐降低,但免疫后6个月仍然保持在较高的水平。本研究表明,三联苗免疫肉鸡和蛋鸡安全、有效。