吡虫啉的酶联免疫吸附分析方法研究

通过碳二亚胺法将吡虫啉交联于牛血清蛋白(BSA)作为免疫抗原,混合酸酐法将吡虫啉交联于卵清蛋白(OVA)作为包被抗原,免疫Balb/c小鼠,采用B细胞杂交瘤技术,经免疫、融合、筛选、克隆,得到抗吡虫啉单克隆抗体,抗体亚类为IgG1,制备的单克隆抗体效价达1×107,确定了吡虫啉酶联免疫吸附分析方法(ELISA)的最佳工作条件,建立了定量测定吡虫啉的间接竞争ELISA方法。本方法的IC50为(15.12±1.28)μg/L,检出限为(1.76±0.02)μg/L。与其它吡虫啉结构类似物无交叉反应。批内相对标准偏差为4.5%;批间相对标准偏差5.1%,饮用水、重庆理工大学地下水和重庆市花溪河地表水平均添加回收率分别为102%,97%和85%。本研究建立了一种快速检测环境水中吡虫啉残留的方法。

一种新型优化的肺组织羟脯氨酸水平测定方法的建立

目的建立大鼠肺组织羟脯氨酸（HYP）水平测定方法，以评价大鼠肺组织纤维化程度。方法比较不同酸水解时间、氧化时间、显色时间等对大鼠肺组织HYP水平测定结果的影响，据此建立大鼠肺组织HYP水平测定方法，并初步应用于博莱霉素诱导大鼠肺纤维化HYP水平的测定。结果通过优化得出HYP水平测定最佳条件为110℃7．50mol盐酸（HCL）水解16h，常温氧化10min，60℃显色25min。本方法灵敏度为0．067／μg／mL，回收率为88．85％～110．88％，平均CV为4．70％～6．60％。该法应用于博莱霉素诱导大鼠肺纤维化研究中，模型组HYP水平明显高于对照组。结论该法灵敏度与回收率均较高、重现性较好，可用作临床对肺纤维化程度判定的定量方法。

生物技术制药的教学实践

生物制药技术是一门新兴交叉应用学科,要求学生应该具备坚实宽厚的理论基础和解决生产实际问题的能力。文章对生物技术制药课程在教学内容和教学方法上的改进进行了总结;不断更新教学内容,让学生经常接触到学科的前沿知识和融会相关学科内容;充分利用现代化信息技术和教学工具,开展合作研讨性教学活动。

生物制药工艺学教学改革探讨

生物制药工艺学是制药工程(生物制药方向)专业的主干必修课程。文章对生物技术制药工艺学在教学内容和教学方法上进行了改革;不断更新教学内容,让学生经常接触到学科的前沿知识和融会相关学科内容;开展启发式教学,引导学生进行科学思维,充分利用现代化信息技术和教学工具,开展合作研讨性教学活动,结合最新科研成果,运用实例引导学生进行创新药物开发。

HPV 16L1基因的原核表达及表达条件的优化

目的:构建HPV16L1基因的原核表达质粒,并优化其表达条件。方法:根据GeneBank中的HPV序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有HPV全长基因片段重组质粒为模板,经PCR扩增出1 500 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接,转化JM109大肠杆菌,筛选阳性克隆。其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-HPV16L1已构建成功。提取pGEX-KG-HPV16L1质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体,进行SDS-PAGE,Western Blot鉴定。结果:在大肠杆菌中获得HPV16L1基因融合表达,融合蛋白的相对分子量为83kDa;表达的蛋白能与抗HPV16L1抗体发生特异性反应。结论:HPV16L1基因在大肠杆菌中获得高效表达,为HPV16L1疫苗的研制奠定了基础。

发光细菌冷冻干燥条件优化研究与应用

发光细菌用于水质毒性快速检测时,使用冷冻干燥制剂复苏发光细菌非常必要。配制冷冻干燥保护剂时,采用较低浓度脱脂牛奶(质量分数分别为4%、6%、8%、10%、12%)以及NaCl溶液(质量分数分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)进行双因素多梯度的实验,确定发光细菌的最佳冷冻干燥保护剂配方为12%脱脂牛奶以及2.0%NaCl溶液。采用复苏后的发光细菌,检测实际水样的毒性,结果与工业废水毒性评价结果相符。

水中硝基苯胺类化合物酶免疫化学分析技术研究

采用戊二醛法,将4-硝基苯乙胺与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)共价偶联,分别合成了免疫原4-硝基苯乙胺-BSA和包被原4-硝基苯乙胺-OVA,经紫外分光光度计及飞行时间质谱扫描鉴定.用合成的免疫抗原免疫新西兰大白兔,并用合成的包被原进行间接竞争酶联免疫(ELISA)试验,获得的抗血清效价达1∶32000.方阵实验确定了包被抗原最佳浓度(0.5mg/L)及抗血清最佳稀释度(1∶6000),并建立了间接竞争ELISA方法.工作曲线表明在1～1000μg/L浓度范围内呈良好的线性关系,该法IC50值为(52.73±2.67)μg/L,检测限为5.12μg/L.其它类似结构不干扰硝基苯胺的测定.成功地建立了硝基苯胺类化合物的间接竞争酶免疫化学分析方法.

喉癌中HPV不同亚型的检测及测序

目的:检测人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)各型DNA在喉癌组织中的表达,探讨HPV在喉癌发生中的作用。方法:用PCR检测123例喉癌组织及123例喉粘膜上皮组织中HPV各型DNA。同时进行DNA测序,结果:在123例喉癌标本中,HPV-L1,-16E6/E7,-18E6/E7阳性率都明显高于其他各型。123例喉粘膜PCR结果表明:低危型HPV的阳性率与喉癌相近;高危型HPV的阳性率虽远远低于喉癌,但随着组织病变程度加重阳性率逐渐升高;HPV-L1的阳性率高于HPV-16E6、E7,随着组织病变程度加重,HPV-L1的检出率逐渐增高。结论:HPV-16感染会增强喉上皮病变的风险,而HPV-18有协同作用;L1片段适合用于检测HPV感染。

LAPTM4B新基因在肿瘤细胞中的表达及其免疫学检测技术的建立

目的利用制备的鼠抗人肝癌相关LAPTM4B蛋白的单克隆抗体,检测LAPTM4B蛋白在不同肿瘤细胞中的表达。方法重组质粒pGEX-KG-LAPTM4B-N1-99经酶切及测序鉴定正确后,1 mmol/L IPTG 37℃诱导获得融合蛋白。利用亲和层析方法纯化抗人LAPTM4B单抗,免疫印迹法进行单抗鉴定,免疫细胞化学染色法检测5种肿瘤细胞中LAPTM4B的表达。结果经western b lot分析抗LAPTM4B单抗可与LAPTM4B-N1-99编码的融合蛋白以及肿瘤细胞中的天然蛋白特异性结合。免疫细胞化学染色(IHC)检测到肝癌、肺癌等5种肿瘤细胞均表达LAPTM4B蛋白。IHC和免疫印迹分析证明了LAPTM4B蛋白在肿瘤细胞中的表达。结论该单抗能特异识别原核及真核细胞表达的LAPTM4B蛋白,为进一步探讨LAPTM4B蛋白的生物学效应提供了条件。

3-硝基酪氨酸人工抗原的合成与鉴定

通过戊二醛法将3-硝基酪氨酸与卵白蛋白(OVA)偶联,制备人工抗原,并用作免疫抗原。用紫外扫描法和聚丙烯酰胺电泳法对其进行鉴定,用BCA法测定二者结合物的质量体积分数,并测得结合物的偶联率。3NT与OVA结合物的质量体积分数为1.69 mg/mL。SDS-PAGE电泳测定其分子量大于43KD。紫外分光光度法测定二者结合物与游离的3NT与游离的OVA之间存在漂移,说明3NT偶联到结合物上,估算其偶联率为5.4。用结合物免疫BALB/C小鼠,间接ELISA测定多抗上清(pAb)效价,获得了高效价的pAb。

LAPTM4B启动子荧光素酶报告基因重组体的构建

目的:LAPTM4B基因是肝癌中高度表达的新基因。为下一步LAPTM4B启动子的活性分性,本文构建了LAPTM4B基因启动子调控的报告基因重组表达质粒。方法:以LAPTM4B基因组cDNA为模板扩增翻译起始位点上游DNA序列。PCR产物定向克隆到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,并经限制性内切酶消化鉴定。结果:通过酶切鉴定和基因测序,证明成功地构建了三种不同长度的pGL3-LAPTM4B-Luc荧光素酶表达质粒,形成了系列的LAPTM4B启动子重组体。结论:充分利用生物信息学资源,利用已知基因的启动子序列,可快速,准确地克隆已知基因启动子序列并构建启动子载体。LAPTM4B启动子荧光素酶报告基因重组体的构建为LAPTM4B启动子的活性分析奠定了基础。

抗氨甲酰化蛋白抗体的制备及其ELISA检测方法的建立

为了制备抗氨甲酰化蛋白抗体,探讨了氨甲酰化与瓜氨酸化之间的关系,开发氨甲酰化蛋白检测试剂盒。以牛血清白蛋白(BSA)和氰酸钾(KCNO)为原料合成人工完全抗原(Hcit-BSA),然后免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠,获得抗血清,间接ELISA测定抗体效价,用方阵实验确定抗体最佳稀释倍数和包被抗原的最佳包被浓度,间接竞争ELISA检测抗体特异性。结果表明:抗体效价大于1∶8 000,抗体最佳稀释倍数为1∶4 000,包被原最佳包被浓度为0.25μg/mL,抗体能特异性识别氨甲酰化产物(carbamylation-derived products,CDPs)。Hcit-BSA具有较强免疫原性,使BALB/c小鼠产生抗氨甲酰化蛋白抗体,也为建立一种简便、快速、特异性强的免疫分析方法奠定了基础,为一些疾病的早期快速检测提供了可能。

HPV L1和16/18 DNA在喉癌组织中的表达

目的检测HPVL1和16/18DNA在喉癌组织中的表达,探讨HPV在喉癌发生中的作用。方法用PCR检测123例喉癌组织及123例喉粘膜上皮组织中HPVL1和16/18DNA。结果在123例喉癌标本中,HPV-L1阳性率为76.42%;HPV-16E6阳性率为54.47%;HPV-16E7阳性率为58.54%;HPV-18E6阳性率为42.28%;HPV-18E7阳性率为48.78%.123例喉粘膜PCR结果表明:低危型HPV的阳性率与喉癌相近;高危型HPV的阳性率虽远远低于喉癌,但随着组织病变程度加重阳性率逐渐升高;HPV-L1的阳性率高于HPV-16E6、E7,随着组织病变程度加重,HPV-L1的检出率逐渐增高。结论 HPV-16感染是重庆地区喉癌的重要发病因素;HPV-16感染后E6/E7片段的保留并持续表达与喉组织的癌变进程密切相关;HPV-16感染会增强喉上皮病变的风险,而HPV-18有协同作用;L1片段适合用于检测HPV感染。

免疫分析法在吡虫啉农药检测中的应用进展

对吡虫啉残留免疫分析检测方法进行综述。介绍了各种免疫分析方法,比较了这些方法的优劣,在此基础上展望了免疫分析法在吡虫啉农药残留检测的应用前景和发展方向。

枇杷叶有效成分的研究进展

综述了枇杷叶的化学成分、药理作用及其应用研究进展,指出枇杷叶含有挥发油、三萜酸类、倍半萜类、皂苷类、黄酮类、多酚类、有机酸类等多种化学成分,具有止咳祛痰、降血糖、抗病毒和抗肿瘤等药理活性,有重要的开发利用价值.

肺弹性蛋白降解肽段人工抗原的合成与鉴定

目的制备和鉴定肺弹性蛋白降解肽段人工抗原,为进一步研制慢性阻塞性肺疾病(COPD)免疫检测试剂盒打下良好基础。方法以Sulfo-SMCC为偶联剂,钥孔血蓝蛋白(KLH)为载体蛋白制备免疫原;经紫外扫描和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)电泳鉴定偶联情况;以免疫原免疫Balb/c小鼠制备特异性抗体,间接竞争酶联免疫吸附实验(ELISA)法评价抗血清效价及特异性。结果紫外扫描和SDS-PAGE电泳确认了肺弹性蛋白降解肽段人工抗原合成成功,其蛋白浓度为1.181mg/mL,抗血清效价高于1∶64 000,IC50为13.7ng/mL,抗血清与无关肽段无交叉反应。结论本实验成功制备了肺弹性蛋白降解肽段人工抗原,其具有较好的免疫原性,为建立快速准确检测COPD免疫检测方法奠定基础。

(2S,3S)-1,2-环氧-3-(叔丁氧基羰基氨基)-4-苯丁烷的合成及表征

以Boc-L苯丙氨酸和苯酚为原料,由DMAP-DCC催化生成苯酯,再制备β-酮硫叶立德化合物,然后得到α-氯酮中间体,再经还原、环合最终合成目标化合物(2S,3S)-1,2-环氧-3-(叔丁氧基羰基氨基)-4-苯丁烷,总收率约为49%(以Boc-L苯丙氨酸计)。目标产物的结构经IR,MS和1H NMR表征。

阴炎净洗液的药效学研究

为了验证阴炎净洗液的抑菌效果,用纸片扩散法测定了该药物是否对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌和绿脓杆菌敏感,再对敏感的细菌用试管法测定其最低抑菌浓度和最小杀菌浓度.

溶酶体跨膜蛋白

介绍了溶酶体膜蛋白的分类,以及各类溶酶体跨膜蛋白的结构、生化性质和功能.特别是对四次跨膜超家族(TM4SF)的膜蛋白(CD63)结构、功能,以及相关的研究现状进行了分析.

硝基苯胺多克隆抗体的制备及鉴定

用合成的免疫抗原硝基苯胺-BSA免疫新西兰大白兔,获得了特异性的硝基苯胺多克隆抗体.最佳包被抗原实验确定了包被抗原最佳浓度(1μg/mL),用间接酶联免疫吸附试验测得抗体效价达1∶12 800.以所获得的抗体建立间接竞争酶联免疫吸附分析法,交叉反应表明,硝基苯胺的特异性抗体与其他类似结构的类似物无明显交叉反应.