肝细胞癌患者组织中MAGE-1基因的原核表达及鉴定

目的:克隆MAGE-1基因并对其进行原核表达及鉴定。方法:通过逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)从原发性肝癌的细胞中扩增MAGE-1基因片段,将该片段克隆在原核表达载体PET-32a中,重组克隆转化大肠杆菌BL21(DE3),表达的蛋白以His亲和柱层析纯化,并用Dot-blot和Western-blot对其进行鉴定。结果:经RT-PCR扩增出930bp基因片段,经测序分析后的DNA序列与Genbank中的报道序列同源程度达98%,构建含重组表达载体PET32-M1的工程菌,经IPTG诱导表达、纯化,MAGE-1蛋白浓度为0.48mg/ml,经Dot-blot和Western-blot检测,纯化蛋白可以与商业化的驴抗MAGE-1的多抗结合。结论:成功扩增了肝细胞肝癌中的MAGE-1基因全长cDNA并对其进行了原核表达与鉴定,为进一步研究MAGE-1基因的功能和研制有临床价值的全人抗MAGE-1抗体奠定了基础。

白虎二地汤改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗分子机制的研究

目的研究白虎二地汤对实验性2型糖尿病(T2DM)胰岛素抵抗大鼠炎症信号通路的影响,并探讨其机制。方法采用高糖高脂饲料喂养联合低剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立T2DM胰岛素抵抗大鼠模型,将大鼠分为正常对照组、模型组、罗格列酮组、白虎二地汤高、低剂量组。连续给药6周后,观察其空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、肿瘤坏死因子?α(TNF?α)、白介素-6(IL-6)的变化,采用Western blot法检测大鼠骨骼肌组织IRS-1、p-IRS-1和PI3Kp85蛋白的表达。结果白虎二地汤高剂量组可明显降低2型糖尿病大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、TNF?α、IL-6(P<0.05),使骨骼肌组织IRS-1和p-IRS-1蛋白表达量降低,PI3Kp85蛋白的表达量升高。结论白虎二地汤可以改善STZ诱导的T2DM胰岛素抵抗大鼠炎症反应,减轻胰岛素抵抗。其可能的机制是通过炎症信号通路,减轻炎症反应,提高肌肉组织PI3K蛋白的表达,从而减弱外周胰岛素抵抗。

银杏叶提取物对大鼠实验性重症胰腺炎肠粘膜屏障功能的影响

目的 探讨银杏叶提取物 (EGb)对大鼠急性重症胰腺炎 (ASP)肠粘膜屏障功能的影响。方法 胰胆管内注射 5 %牛磺胆酸钠溶液制作大鼠ASP模型 ,72只SD大鼠随机分为假手术组 (SO组 )、ASP组和EGb治疗组。治疗组腹腔注射EGb 2 0mg·kg 1,每 6h注射一次 ;SO组与ASP组腹腔注射等量 0 9%氯化钠液 ,各组分别在 3、6、12和 2 4h取材并分别作下述检测 :(1)小肠粘膜病理变化 ;(2 )血浆内毒素测定 ;(3)肠道细菌移位检测 ;(4)回肠粘膜细胞原位凋亡 ;(5 )存活时间与存活率观察。结果 术后早期肠粘膜的超微病理损害EGb组较ASP组减轻 ;EGb组血浆内毒素水平于 6、12和 2 4h较ASP组明显下降 (P <0 0 5 ) ;术后 6h肠道菌群易位率ASP组和EGb组分别为 14 3%和 12 5 % ,两组间差异无显著性 ;术后 2 4hASP组和EGb组分别为 6 4 7%和 33 3% (P <0 0 5 ) ;肠粘膜原位凋亡检测EGb组在 6h和 12h细胞凋亡指数较ASP组明显下降 (P <0 0 5 )。ASP组术后 4 8h内全部死亡 ,平均存活时间 2 3 6h ;EGb组术后 72h存活率为 2 9 4 % ,平均存活时间为 4 2 2h(P <0 0 5 )。结论 EGb早期腹腔灌注对大鼠ASP肠粘膜屏障功能具有保护作用 ,从而改善大鼠ASP的预后。

腹腔镜脾切除加贲门周围血管离断术(附59例报道)

目的探讨微创技术应用于门脉高压症治疗的利弊。方法5例门脉高压症并食管胃底曲张静脉破裂出血病人施行腹腔镜脾切除加贲门周围血管离断术;结合文献报道一并分析。结果全组59例肝功能均为ChildA或B级,脾脏长径14～28cm。全组均择期手术,其中22例全腔镜下完成手术,33例手助,4例中转开腹,无手术死亡。全腔镜下手术最长耗时5.5h,手助术最长耗时5h;术中出血一般200～500mL,最多达2800mL(腔镜下);术后排气及下床活动时间多在3d左右,7～12d出院。结论微创技术应用于门脉高压症并食管胃底曲张静脉破裂出血的择期治疗可行且有利,但应严格筛选合适的病人。

腹腔镜与开腹脾切除断流术的临床对比研究

目的比较腹腔镜和开腹手术(open splenectomy,OS)治疗门脉高压症脾切除断流术的近期临床效果。方法回顾分析2003年1月～2007年12月腹腔镜脾切除术(laparoscopic splenectomy,LS)断流术14例和同期开腹脾切除断流术18例的临床资料。结果腹腔镜组的平均手术时间明显长于开腹组(205minvs.152min,P<0.05),而术中出血量(620mLvs.915mL)、术后腹腔总引流量(910mLvs.1445mL)、排气时间(77hvs.97h)、术后住院时间(12dvs.16d)均明显减少(P<0.05),术后肝功能、并发症发生率、住院总费用差异均无统计学意义(P>0.05)。结论腹腔镜脾切除断流术的近期效果明显优于传统开腹手术,且安全可行,具有微创的优越性。

腹腔镜胆囊切除术后梗阻性黄疸

目的探讨LC术后早期非损伤性梗阻性黄疸的病因、机制和处理。方法回顾总结2000年5月～2002年5月施行的LC术412例,其中4例术后早期发生非损伤性梗阻性黄疸;复习国内1997年10月～2001年10月部分1000例以上LC术的大宗报道,共计51 444例。结果LC术后非损伤性梗阻性黄疸43例(该组4例及文献报道39例),其中胆道残留结石36例,胆管炎2例,胆管癌1例,Oddi括约肌功能不良1例及原因不明3例。1例Oddi括约肌功能不良导致术后早期梗阻性黄疸属国内首例报道。结论非损伤性梗阻性黄疸是LC术的少见并发症,主要原因是胆道残留结石(占83.7%)。非结石性病因罕见却是临床诊断和治疗的难点。对此类并发证应首选ERCP明确诊断,同时在内镜下作必要的处理。

钙磷脂结合蛋白Ⅱ在人肝细胞癌中的表达

目的:应用抑制差减杂交技术(supressionsubtractivehybridization,SSH)结合cDNA芯片筛选人肝细胞癌中差异表达基因。进一步探讨所筛选出的钙磷脂结合蛋白(annexinⅡ)在肝细胞中的表达及作用。方法:以肝癌组织和非肿瘤肝组织进行SSH,构建正、反向差减杂交文库,差减片断的PCR产物制备cDNA芯片,筛选出肝癌组织中差异表达基因。进一步应用荧光实时定量技术验证芯片结果,免疫组化方法分析annexinⅡ在肝细胞癌和正常肝组织中的表达。结果:成功构建了肝细胞癌差减杂交文库。芯片结果显示annexinⅡ在肝细胞癌中高表达并经荧光实时定量技术证实。免疫组化结果表明annexinⅡ在肝细胞癌和癌旁肝硬化组织中高表达,在正常肝组织中不表达(P<0.05)。在低分化肝细胞癌中annexinⅡ的表达有增高趋势。结论:SSH方法构建的肝细胞癌差减杂交文库富含肝细胞癌差异表达基因。肝细胞癌中高表达基因annexinII可能与肝细胞的恶性转化,肝癌细胞的转移和侵袭能力有关。

人源抗EB病毒潜伏膜蛋白1特异性基因工程抗体Fab的筛选与特性

目的:应用噬菌体展示技术制备抗EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(latert membrare protern 1,LMP1)特异性、高亲和力的全人抗体Fab片段。方法:利用稳定转染表达LMP1的SUNE-1细胞及原核表达的LMP1胞外区蛋白作为抗原对大容量人源Fab抗体库进行差减筛选及固相筛选,经过5轮细胞筛选和3轮固相筛选,随机挑选30个克隆经酶联免疫吸附法鉴定,阳性克隆进行可溶性表达,用LMP1阳性表达的人鼻咽癌细胞株HNE2/LMP1鉴定抗LMP1抗体Fab的结合活性。结果:Western blot、免疫荧光结果显示,从大容量人源Fab抗体库中筛选出1株抗LMP1抗体Fab,细胞ELISA、荧光激活细胞分类术、免疫荧光分析、免疫组化检测结果显示Fab与人鼻咽癌细胞表面LMP1分子有较好的结合活性。结论:从人源Fab抗体库中筛选的Fab抗体能够与鼻咽癌细胞表面LMP1分子特异性结合,为研制用于EBV相关肿瘤如鼻咽癌生物治疗的靶向药物,提供了候选分子。

miR-335启动子活性鉴定及药物干预

目的：探讨miR-335上游片段是否具有转录活性以及罗格列酮和胰岛素对miR-335启动子区域转录活性的影响。方法：利用PCR技术克隆位于MEST内含子中miR-335上游区域的不同片段,采用双荧光素酶报告基因系统鉴定其转录活性。使用1μmol/L的罗格列酮及不同浓度的胰岛素进行干预并观察转录活性有无变化。结果：不同的miR-335启动子区域转录活性不同,在miR-335上游约600个碱基区域活性最高。未使用药物干预组细胞中,miR-335启动子区域活性的表达与基础值相比差异无统计学意义（P〉0.05）;使用1μmol/L罗格列酮干预后,miR-335启动子区域活性显著升高（P〈0.01）,使用10~12 mol/L的胰岛素干预时,启动子活性升高,但当胰岛素浓度上升后,启动子活性变化并没有统计学差异。结论：miR-335上游约600个碱基为启动子关键区域,同时,miR-335有可能通过自身的转录调控机制参与肥胖与胰岛素抵抗的发生发展。

体外siRNA靶向抑制PI3Kp85α基因对人胃癌AGS细胞株的作用

目的探讨小干扰RNA(siRNA)技术沉默PI3Kp85α基因表达对人胃癌细胞株AGS增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法设计3条靶向抑制PI3Kp85α基因的siRNA片段(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3),分别转染人胃癌AGS细胞,并设阴性对照组及空白组。Western blotting检测siRNA序列对PI3Kp85α蛋白表达的影响。利用MTT实验、划痕迁移实验和Transwell侵袭实验检测下调PI3Kp85α水平对AGS细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果转染siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3的AGS细胞中PI3Kp85α蛋白水平均低于阴性对照组及空白组(P<0.05)。转染siRNA-3的AGS细胞PI3Kp85α蛋白表达降低最明显,抑制率达80%,故选择siRNA-3进行后续实验。转染24h后,PI3Kp85αsiRNA转染组细胞增殖能力明显低于对照组细胞(P<0.05)。24h体外划痕实验显示,PI3Kp85αsiRNA转染组的划痕愈合能力明显低于对照组(P<0.05)。Transwell实验显示,PI3Kp85αsiRNA转染组细胞的细胞穿膜数明显低于对照组(P<0.05)。结论通过siRNA能明显下调PI3Kp85α蛋白在胃癌细胞AGS中的表达,并抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。

乳腺癌患者化疗前后肿瘤异常蛋白表达变化及临床意义研究

目的探讨肿瘤异常蛋白(TAP)在乳腺癌患者化疗前、后表达情况及其与患者临床特征的关系和临床价值。方法选取2017年6月至2020年10月在南京医科大学第二附属医院确诊为乳腺癌的患者107例。采集其外周末梢血并涂片,检测TAP最大凝聚物面积及乳腺癌患者血清TAP阳性率,分析其不同临床病理特征、化疗前后血清中TAP的相对表达量,评价在乳腺癌中的临床价值。结果乳腺癌患者化疗前TAP阳性表达率72.0%(77/107)高于化疗后的16.8%(18/107),腋窝淋巴结转移的患者TAP阳性表达率84.0%(42/50)高于无淋巴结转移的61.4%(35/57),肿瘤直径大的患者TAP阳性表达率84.5%(49/58)高于肿瘤直径小的患者的57.1%(28/49),Ki-67高表达的患者TAP阳性表达率82.1%(64/78)高于Ki-67低表达的患者的44.8%(13/29),比较差异均有统计学意义(P<0.05)。不同年龄、激素受体水平、人类表达生长因子受体、E-cad、CK5/6、临床分期、远处转移的乳腺癌患者TAP阳性表达率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。化疗前患者的TAP凝聚物面积相对表达量为[158.4(142.2,180.6)]μm 2高于化疗后患者的[112.6(106.4,116.6)]μm 2,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论TAP是乳腺癌诊断的敏感指标,在乳腺癌化疗前后疗效及预后判断中具有一定的临床应用价值,其作用机制尚未明确,需要进一步研究。

全人源抗Met双价抗体的制备与特性分析

目的以抗HGF受体Met特异性的全人抗体Fab基因为模板,合成并表达双价抗体Diabody。方法以天然抗体库中筛选出的Fab基因为模板,分别扩增抗体的重链可变区与轻链可变区基因,经重叠拼接合成Diabody基因,克隆于原核表达载体pBAD/gⅢA中表达。在不同的培养条件下,阳性克隆经IPTG诱导表达,ELISA、SDS-PAGE、Western-blot和细胞免疫荧光分析。结果培养基成分和诱导剂的浓度对目的蛋白的表达未见有明显的影响,低温诱导能够促进可溶性蛋白的产生;但电泳与印迹分析表明,在29kD出现预期大小蛋白条带。双价抗体经表达、变性与复性和IMAC亲和纯化后,用细胞免疫荧光分析表明,Diabody能够与S114细胞表达Met的胞外区特异性结合。结论本研究制备的双价抗体能够与其抗原特异性结合,该抗体有望与其他抗体分子结合,制备双特异性抗体,为肿瘤临床诊断或治疗提供候选分子。

白虎二地汤改善2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠糖脂代谢的实验研究

目的研究白虎二地汤对实验性2型糖尿病(T2DM)胰岛素抵抗大鼠血糖、血脂的影响,并探讨其机制。方法采用高糖高脂饲料喂养联合低剂量链脲佐菌素腹腔注射建立T2DM胰岛素抵抗大鼠模型,将大鼠分为正常对照组、模型组、罗格列酮组、白虎二地汤高、低剂量组。治疗前后检测空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、游离脂肪酸(FFA)。显微镜观察五组大鼠肝脏、骨骼肌、脂肪的病理变化。结果白虎二地汤可明显降低2型糖尿病大鼠FBG、FINS、HOMA-IR及血清TC、TG、LDL-C、FFA水平,升高血清HDL-C浓度,减少肝脏组织脂肪浸润,且以高剂量白虎二地汤组效果最佳。结论白虎二地汤可以改善STZ诱导的T2DM胰岛素抵抗大鼠糖、脂代谢异常,减轻胰岛素抵抗。其可能的机制是通过降低脂毒性,增强胰岛组织对胰岛素的敏感性,发挥其改善糖脂代谢紊乱和降糖降脂作用。