血红蛋白源抗菌肽hemocidins研究进展

血红蛋白及其降解片段在人和动物体内有着多种多样的生理功能。血红蛋白降解后产生的具有抗菌活性的片段被称为hemocidins。hemocidins是一类重要的内源性抗菌肽,其来源宿主广泛、抗菌谱广。根据抗菌肽的构效关系,计算机辅助设计的hemocidins类似肽也具有较好的抗菌活性。文章主要对hemocidins及其类似肽的抗菌活性和抗菌机制进行了简要综述,以期为深入研究和开发hemocidins及其类似肽提供一些参考,进而为防治人与动物病原菌感染提供理论依据。

基因Ⅱ型猫杯状病毒XA20-2023株的分离鉴定及基因组序列分析

为了解猫杯状病毒(FCV)的生物学特性及遗传规律,本研究对从陕西西安地区采集的17份疑似FCV感染的口鼻咽样品经PCR检测,并经PCR扩增FCV阳性样品的VP1基因并测序。采用SnapGene软件分析GenBank中国内外23株FCV参考株与所测VP1的氨基酸序列,结果显示,17份拭子样品中有6份呈FCV阳性,阳性率为35.3%。氨基酸序列分析结果显示,所测VP1序列中有一条与GⅡ型FCV VP1氨基酸序列存在3处相同的变异,分别为N^(377)K、A^(539)V、G^(557)S,其余5条VP1氨基酸序列的变异与GI型FCV的VP1一致。表明所测VP1基因序列对应的FCV属于GⅡ型。将该FCV阳性样品接种CRFK细胞进行病毒的分离与传代,并在传代过程中观察细胞的CPE。将传至5代的病毒分别采用PCR与间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,结果显示连续传5代后,每代CRFK细胞均产生稳定且典型的CPE,并能观察到FCV的特异性绿色荧光,表明分离到一株GⅡ型FCV并命名为XA20-2023株。经PCR分段扩增第5代分离病毒的全基因组序列,测序拼接后显示XA20-2023株全长7 687 bp。采用MegAlign软件分析该株病毒与GenBank中10株FCV的全基因组、非结构蛋白、VP1及VP2编码基因序列的同源性。采用MEGA 11软件中的NJ法构建XA20-2023株与GenBank中85株FCV参考株全基因组序列的系统发育树。同源性分析结果显示,XA20-2023株与GenBank中10株FCV全基因组序列的同源性为76.4%~84.2%,与GⅡ型FCV SH株全基因组序列的同源性最高为84.2%,与GI型疫苗株F9、F4及FCV 255株全基因组序列的同源性分别为76.4%、77%及77.1%。非结构蛋白编码基因序列的同源性差异最大的是NS2(74.6%~94.2%),差异最小的是NS6(77.3%~82.9%)。VP1及VP2编码基因序列的同源性分别为73.7%~83.8%及76.0%~87.5%。进化树结果显示XA20-2023株与GⅡ型分离株处于同一分支,与GI型疫苗株F9和F4的遗传距离较远。上述结果进一步表明,XA20-2023株为GⅡ型FCV,与FCV代表株尤其是GI型疫苗株的同源性较低,且其变异程度较高。本研究丰富了西安地区流行的GⅡ型FCV基因库,并为后续揭示国内GⅡ型FCV的流行状况、遗传变异及其所致疫病的防制具有重要意义。

嵌杯病毒主要衣壳蛋白的研究进展

嵌杯病毒(calicivirus)是无囊膜的单股正链RNA病毒,具有广泛的宿主范围因而严重威胁着人和许多其他脊椎动物的健康。由于该病毒种属流行株多变、极易传播且呈现区域性感染,致使全球范围内因杯状病毒引起的公共卫生疾病频繁暴发,近年来,其感染发病率呈明显增加的趋势。不同属成员虽然感染不同种类的宿主,但其主要衣壳蛋白的结构类似。嵌杯病毒主要衣壳蛋白中含有免疫原性关键区域,能与宿主受体结合并可能介导感染过程,且氨基酸相关的免疫原性及受体结合位点的变异是公认的病毒进化的驱动力。本文就嵌杯病毒主要衣壳蛋白的基因组结构、免疫原性、受体结合情况以及遗传演化规律等方面的研究进展进行综述,以期为后续科学研究以及该病的有效防控提供参考。

血清14型副猪嗜血杆菌的分离与多克隆抗体制备

【目的】探明引起猪副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)病发病的病原菌,并制备分离病原菌的多克隆抗体,为该病的治疗及疫苗的研发提供技术支撑。【方法】从送检病料分离出保育猪发病病原菌,并对其进行形态观察、生化鉴定与PCR鉴定,明确分离病原菌的类型及血清型;同时使用甲醛对分离病原菌进行灭活后再与弗氏佐剂乳化制备灭活菌体抗原,经肌肉和皮下免疫BALB/C小鼠,制备该分离病原菌的鼠源多克隆抗体;采用饱和硫酸铵沉淀法对制备的多克隆抗体进行纯化,利用SDS-PAGE方法鉴定纯化抗体的纯度,通过免疫荧光进一步检测抗体与抗原的结合效果。【结果】从病料中分离得到1株革兰氏阴性短小杆菌,经形态学观察、生化鉴定与PCR鉴定,分离到的病原菌为血清14型副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS);灭活后的HPS与佐剂乳化后免疫BALB/C小鼠制备得到分离病原菌的多克隆抗体,阳性菌液与纯化后稀释500倍和2000倍的多克隆抗体结合并加入荧光二抗后于显微镜下观察,病原菌发出红色荧光;经Western blot检测,制备多克隆抗体在约13 ku、30 ku和50 ku处有3条清晰条带,Western blot和免疫荧光试验均证实制备的多克隆抗体可与分离病原菌发生特异性反应。【结论】制备的血清14型HPS多克隆抗体可与分离病原菌发生特异性反应。

两种中草药化妆品配方的抗氧化活性比较及化妆水和乳液的制备

论文以多种中草药提取物复配而成的两种不同功效的化妆品配方为研究对象,对总酚与总黄酮含量、DPPH自由基清除能力、还原能力进行测定,并对其抗氧化活性进行比较.美白配方的含总酚、总黄酮量分别为720.25 mg GAE/g、18.17 mg QE/g,保湿配方的含总酚、总黄酮量分别为538.88 mg GAE/g、4.34 mg QE/g,美白配方和保湿配方的EC50值分别为106.44μg/mL、98.27μg/mL.试验结果表明,美白配方的总酚、总黄酮含量都大于保湿配方的总酚、总黄酮含量,美白配方的EC50大于保湿配方的EC50,且美白配方的还原能力大于保湿配方.比较这几项指标可知美白配方的抗氧化能力强于保湿配方.同时,该试验还以这两种中草药配方为原料,分别将其加入化妆水和乳液的制备工艺,制备出了性能良好的具有美白和保湿功效的化妆水和乳液.

一例犬膀胱结石的诊断与治疗

临床接诊一例犬膀胱结石病例,采用临床检查、实验室检查和影像学检查。检查结果显示该犬患有膀胱结石。依据诊断结果,采取膀胱切开术成功取出膀胱结石,术后患犬配合药物治疗后效果良好,康复后未复发。

猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。

新城疫病毒核衣壳蛋白基因在大肠埃希菌中的表达、纯化及其活性分析

构建新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)基因的原核表达载体,并将其在宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中表达。以NDV La Sota株NP基因序列为模板,设计特异性引物,通过PCR扩增获得NP蛋白全长基因片段,定向插入原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-NDV NP;将构建的重组质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,表达出目的蛋白,并采用亲和层析的方法纯化表达蛋白;表达蛋白采用Western blotting方法检测其反应原性。结果显示,成功克隆了新城疫病毒NP基因全长,片段序列1470bp;构建的pET-NDV NP载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误;转化表达宿主菌后经SDS-PAGE检测结果显示目的基因得到成功表达,且表达蛋白经Ni-NTA镍离子亲和层析法被成功纯化,蛋白质浓度为3mg/mL;Western blotting检测结果显示表达蛋白具有良好的反应原性。试验结果表明,成功构建了含有新城疫病毒核衣壳蛋白基因的原核表达载体,成功表达、纯化得到了NDV NP蛋白。

《动物免疫学实验技术》课程教学改革

结合河南科技学院硕士研究生动物免疫学实验技术课教学现状,从教学内容、教学手段、教学考核等方面探讨动物免疫学实验技术课程教学改革,通过开展以课题研究为模式,综合运用免疫学实验技术的实验课教学方法,培养研究生独立思考问题以及系统性科研设计的意识,进而将学到的免疫学实验技术知识用以解决实际问题,最终提高硕士研究生动物免疫学实验技术课程的教学质量。

利用CMV启动子构建PRRSV感染性克隆的研究

【目的】建立一种利用CMV启动子获得拯救猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒提供操作平台。【方法】根据PRRSV的基因序列特征和CMV启动子的序列特征,对pBluescprictⅡSK(+)载体进行多克隆序列改造;设计特异性引物,分6段扩增、组装出PRRSV的全长cDNA并扩增CMV真核启动子序列;采用酶切、连接、转化等方法将连接成功病毒的全长cDNA置于CMV真核启动子序列的下游,获得含有CMV启动子和猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1A株全长cDNA克隆的重组质粒pSK-CH-1A;再将重组质粒直接转染MARC-145宿主细胞,得到猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1A株病毒的拯救病毒。【结果】成功获得了19 112bp含CH-1A全长cDNA的pSK-CH-1A载体,将其直接转染MARC-145宿主细胞后,经细胞体内转录合成病毒基因组RNA,获得了拯救病毒(rCH-1A);病毒生长特性试验结果显示,拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性,且拯救病毒序列含有不同于亲本病毒的分子标记MluⅠ酶切位点。【结论】建立了一种方法简单,操作方便,节约时间和成本的PRRSV感染性cDNA克隆的体外拯救方法。

1株血清7型副猪嗜血杆菌的分离与鉴定

研究旨在确定河南省南阳市一猪场送检样品中的病原,对病例进行流行病学调查和临床症状观察,对送检病料进行细菌分离、纯化、鉴定和基因测序分析等检测。结果显示,送检病料中分离得到一株革兰氏阴性短杆菌,分离菌在常用细菌鉴别培养基上无法生长,在含有NAD的TSA培养基上呈露珠状;纯化得到的分离菌NY2020株和金黄色葡萄球菌共同培养具有"卫星现象";采用副猪嗜血杆菌16S rRNA鉴定引物和血清7型引物均能够扩增出特异性条带。序列分析表明,该分离菌NY2020株与7型副猪嗜血杆菌处于同一进化树分支。研究表明,该分离菌为血清7型副猪嗜血杆菌。

犬细小病毒新乡株的分离鉴定及其VP2基因的序列分析

【目的】探究河南省新乡地区犬细小病毒(Canineparvovirus,CPV)的流行和遗传变异进化情况,为有效防控区域性CPV流行提供参考。【方法】对从新乡地区宠物医院收集的23份疑似患犬细小病毒病的病犬粪便样品和眼、鼻、口、肛拭子预处理后进行PCR检测。将PCR检测结果为阳性的样品采用浸泡、过滤除菌处理后接种于单层猫肾细胞CRFK进行病毒增殖培养,将分离的病毒置于透射电子显微镜下观察。参考GenBank中已收录的国内外CPV不同亚型的毒株序列,经PCR分段扩增、测序后拼接获得病毒全长基因,利用分子生物学软件对病毒基因进行序列分析和氨基酸序列同源性分析。【结果】从送检的样品中成功分离出1株CPV,命名为XX-2022株。该病毒株能使CRFK细胞产生明显病变,导致细胞出现变圆、拉网和脱落。通过透射电镜可观察到典型的病毒粒子,呈圆形或六边形,直径约25 nm,无囊膜。通过PCR分段扩增拼接后获得的病毒全基因组序列全为长4588 bp,CPV系统进化分析结果显示,XX-2022株与Canine/SH/1/2019(MN840830.1)株的亲缘关系较近。利用MegAlign软件对XX-2022株VP2基因推导的氨基酸序列进行分析,该毒株与YANJI-5(MW715601)的VP2氨基酸序列在同一小分支,氨基酸同源性为99.7%。根据CPV的基因分型原则,最终确定XX-2022株CPV属于CPV-2a型。【结论】从临床病料中成功分离出1株CPV,经分析确定为CPV-2a型,研究结果可为新乡地区CPV的流行病学、致病性及生物学特性研究提供依据,为CPV的区域流行及有效防控提供参考,为新疫苗的研发提供地方种毒。

着眼于研究生课题研究需要的兽医微生物学实验技术教学改革与实践

兽医微生物学实验技术课在畜牧兽医专业研究生教育中起着关键的作用。河南科技学院兽医微生物学教学实验室经多年建设该课程,建立了以让研究生掌握基本实验技术原理为基础、能熟练将实验技术转化为解决课题手段为目的,以创新能力培养为驱动的多级别、分层次的兽医微生物学实验教学体系;实验内容由传统的单一式教学模式,改变为由基础性实验、综合性实验、创新性实验组合而成的实验课教学体系;在利用教学实验室的同时最大限度地开放本学科科研平台优势,为研究生学习搭建了更贴近课题研究的创新训练基地。通过该课程教学方法的改革与实践提高了研究生参与课题研究的兴趣,培养了其科研素质和创新能力,推动了兽医微生物学教学效果的提高。

新生仔猪小肠上皮细胞的分离培养和鉴定

为更快捷地进行猪肠道病毒性、细菌性疾病及细胞永生化的研究提供便利,本研究使用多种酶消化法及其他培养法尝试分离培养肠上皮细胞。结果,利用组织块培养法能成功建立新生仔猪小肠上皮细胞株,获得的上皮细胞具有较强的增殖能力,22 h内贴壁并发生细胞分裂,6~7 d明显增殖,10~12 d汇合成单层,连续传代培养至12代,细胞基本失去上皮样特征。倒置显微镜下观察,10代前培养细胞为多角状或卵圆形,单层生长不重叠,呈铺路石状排列,11~12代细胞发生变形,间隙增大。细胞角蛋白18鉴定二者均为阳性。电镜下,纹状缘整齐,紧密连接结构清晰可见。结果表明利用组织块培养法可以获得能够连续传代、活力较好的猪小肠上皮细胞。

抗菌肽JH-3的抑菌活性及其稳定性分析

对牛血红蛋白源抗菌肽P3进行氨基酸改造,并了解改造后抗菌肽JH-3的抑菌活性和稳定性。通过微量稀释法检测了抗菌肽JH-3的最小抑菌浓度（MIC）,通过扫描电镜观察了细菌和真菌形态的变化,测定了抗菌肽JH-3的溶血性、热稳定性、酸碱稳定性和盐稳定性。结果表明：抗菌肽JH-3对革兰阳性菌（金黄色葡萄球菌、猪链球菌2型）的MIC为6.25-25μg·mL^-1,对革兰阴性菌（大肠杆菌、猪霍乱沙门菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌）的MIC为3.125-50μg·mL^-1,对真菌（白色念珠菌）的MIC为12.5μg·mL^-1,均具有良好的抗菌活性。经抗菌肽JH-3处理后,大肠杆菌细胞表面出现皱缩、孔洞;金黄色葡萄球菌出现菌体皱缩,细胞的完整性受到破坏;白色念珠菌细胞表面出现凹陷、突出、裂痕。在6-100倍MIC时312.5μg·mL^-1抗菌肽JH-3的溶血率仅12.84%;75-100℃的高温、80-100mmol·L^-1的高浓度NaCl和pH 4.0及pH 10.0的高酸碱性对抗菌肽JH-3的抑菌活性没有明显的影响。研究结果为抗菌肽JH-3的临床应用提供了理论基础,且抗菌肽JH-3有替代抗生素成为新抗菌药物的潜力。

乙型脑炎病毒SXBJ07株的分离鉴定及序列分析

【目的】分离鉴定乙型脑炎病毒（JEV）,确定分离毒株的基因分型及其E区段氨基酸的序列特征。【方法】采用BHK-21细胞培养法,从猪脑组织标本中分离出1株病毒,对其进行细胞和免疫荧光试验,同时采用RT-PCR扩增并克隆该毒株的PrM、E区段核苷酸序列,利用PrM（456-695位）区核苷酸序列与36株参考序列进行基因分型分析,并对E区核苷酸序列与减毒活疫苗株SA-14-14-2株的相应序列进行比对,分析分离株和疫苗株氨基酸的同源性及关键结构域的差异。【结果】分离出的病毒经细胞病变和直接免疫荧光试验证实为乙脑病毒,命名为SX-BJ07;用该病毒感染BHK-21细胞,72 h后所有细胞均发生病变（CPE）;用该病毒接种3日龄乳鼠,72 h之内即可导致乳鼠死亡;SXBJ07株PrM（456-695位）区基因分型证实,分离株属于基因Ⅰ型,E区段核苷酸和氨基酸与减毒活疫苗株SA-14-14-2株的同源性分别为87.7%和97.0%,但在E蛋白的活性关键结构域有13个氨基酸存在差异。【结论】从陕西省境内首次成功分离到1株Ⅰ型乙脑病毒,初步确定了该分离株的分子特征,对乙型脑炎的流行病学研究及其防治具有重要意义。

猪流行性腹泻病毒N基因的表达及抗原性分析

为深入了解仔猪腹泻的病因,本研究在不同发病猪场采集了115份临床样品,通过RT-PCR方法对猪流行性腹泻病毒(PEDV)进行检测,结果显示总阳性率为81.7%。进一步从部分样品中对PEDV的N基因进行克隆和序列分析,结果显示采集的临床样品中各分离株之间的氨基酸同源性高达99%以上,与代表性病毒株CV777的氨基酸同源性为97.4%～98.1%,表明目前流行的PEDV其N基因仍然相对保守的。同时,构建了重组表达载体pGEX-N,经诱导表达显示该重组蛋白呈可溶性表达,重组蛋白大小约为81 ku,western blot分析结果表明该重组蛋白能够被PEDV阳性猪血清特异性识别。将纯化后的重组N蛋白作为包被抗原,对20份已知背景的临床猪血清抗体进行ELISA检测,结果显示有9份血清为抗体阳性,11份血清呈抗体阴性,与应用RT-PCR方法鉴定抗原的结果符合率为85%。本研究表达的重组N蛋白具有良好的抗原性,可以将其作为PEDV血清学诊断的候选抗原。

新型血红蛋白抗菌肽抑菌活性及溶血性研究

对分离的血红蛋白抗菌肽进行生物活性鉴定。通过微量稀释法测定血红蛋白抗菌肽对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的最小抑菌浓度(MIC);以血红蛋白释放量测定其溶血性;琼脂平皿试验测定其热稳定性;并进一步在扫描电镜(SEM)下观察血红蛋白抗菌肽对测试菌株形态结构的影响。结果表明,血红蛋白抗菌肽对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的MIC分别为0.5、1.0、0.25mg/mL;在2.0mg/mL的浓度下,可造成6.7%的红细胞发生溶血;经过高温处理,仍表现出较好的热稳定性;SEM观察到血红蛋白抗菌肽作用的细菌形态发生严重的皱缩、变形并大量的聚集,细胞膜裂解、破碎。说明血红蛋白抗菌肽具有良好的抗菌活性且溶血性较低,具有良好的生物安全性。

一种广谱、低毒的抗菌肽类似物HJH-3的生物学活性和膜活性的测定

为了解牛红细胞抗菌肽(AMPs) P3的类似物HJH-3的活性、稳定性及潜在的作用机制,本研究采用微量倍比稀释法测定AMPs HJH-3对试验菌株的最小抑菌浓度(MIC);同时测定该AMPs对红细胞的溶血性;采用双层琼脂扩散法检测了HJH-3的稳定性;通过荧光探针-酶标仪分析技术和电镜技术检测了HJH-3潜在的膜作用机制。结果显示,HJH-3对与感染相关的不同细菌均具有广泛的抗菌活性,其在大于5 MIC时对红细胞的溶血作用比较低;HJH-3在耐受温度、酸碱度和离子强度等方面均具有很好的稳定性;在AMPs HJH-3的作用下,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞膜可以迅速去极化;电镜观察显示,HJH-3能够穿透大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞壁和细胞膜,并在其膜上形成孔洞,直接破坏了细胞的完整性,最终导致细菌的死亡。本研究证实了AMPs类似物HJH-3具有广谱的抗菌活性,其抗菌活性的发挥是通过改变正常细胞的跨膜电位和破坏细菌膜的完整性来实现的。本研究为AMPs HJH-3的开发应用奠定了实验基础。

鸡抗菌肽NK-lysin的生物信息学分析

为了解鸡内源性抗菌肽NK-lysin的基本信息,试验选择鸡NK-lysin的氨基酸序列通过软件对NK-lysin的生物信息学进行了分析。结果表明:NK-lysin的等电点为5.87,分子质量为15 231.3 u,为稳定蛋白和亲水蛋白,定位于细胞质内,有1个跨膜区和1个信号肽,没有糖基化位点,但有2个磷酸化位点,二级结构由α螺旋、延伸链、β折叠和无规则卷曲组成,存在多个抗原表位。说明鸡抗菌肽NK-lysin可作用于细胞膜或某些生物分子,使菌体死亡。