肺炎链球菌表面蛋白A的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的 原核表达、纯化肺炎链球菌表面蛋白A（pneumococcal surface protein A,PspA）,并制备多克隆抗体。方法 应用ANTHEWIN、DNAstar等分子生物学软件,对PspA氨基酸序列进行分析,筛选出抗原表位富集区（第33-109个氨基酸）,选用原核生物偏爱的密码子优化基因序列,化学合成全新的基因序列pspa,插入质粒pGEX-4T-2和pET28a（＋）中,构建重组表达质粒pGEX-4T-2-pspa和pET28a（＋）-pspa,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。分别纯化带有GST标签和His标签的PspA重组蛋白GST-PspA和His-PspA,以His-PspA作为免疫原,经背部多点免疫新西兰大耳白兔,间接ELISA法检测血清抗体效价,Western blot法检测血清抗体特异性。结果 两种重组表达质粒pGEX-4T-2-pspa和pET28a（＋）-pspa经双酶切鉴定构建正确;表达的两种重组蛋白GST-PspA和His-PspA相对分子质量分别〈为33 000和18 000,均为可溶性表达,纯化后目的蛋白条带均无降解,纯度〈为95%,蛋白浓度分别为2和0.2 mg/ml;制备的兔抗血清效价较高,可达1：200 000,且特异性较好。结论 原核表达并纯化了肺炎链球菌PspA融合蛋白,并制备了特异性良好的高效价兔抗血清,为下一步建立肺炎链球菌快速检测技术奠定了基础。

单纯疱疹病毒Ⅱ型gC2蛋白在CHO细胞中的表达、纯化及其免疫活性

目的在CHO细胞中表达单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)Ⅱ型gC2蛋白,纯化后检测其免疫活性。方法利用ANTHEWIN等软件分析GenBank中HSVⅡ型gC2的氨基酸序列,筛选抗原表位富集、且亲水性较好的蛋白胞外区片段,选择真核和原核生物均偏爱的密码子,通过OptimumGene软件对基因进行序列优化,化学合成全新的基因序列HSV2-gC2,PCR扩增后,插入pMCE5载体,构建重组表达质粒pMCE5-gC2,转染至CHO细胞中进行真核表达。表达的重组gC2蛋白经亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。将纯化的重组gC2蛋白分别于第0、2、4周经腹腔免疫小鼠,以免疫PBS作为对照,采用间接ELISA法检测免疫小鼠的血清抗体水平;酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测免疫小鼠脾淋巴细胞分泌IFNγ(代表Th1细胞因子)和IL-4(代表Th2细胞因子)的细胞频率。结果重组表达质粒pMCE5-gC2经菌落PCR、双酶切(EcoRⅠ/NotⅠ)及测序证实构建正确;纯化的重组gC2蛋白相对分子质量约为90 000,纯度约为85%,浓度为40μg/ml,可与小鼠抗His单克隆抗体特异性结合;通过3次免疫,小鼠产生了高水平的血清抗体,与免疫前相比,差异均有统计学意义(P<0.001);免疫小鼠脾细胞经特异性抗原刺激后,分泌IFNγ和IL-4的细胞频率分别为(13.46±2.832)/106和(19.2±2.48)/106个细胞,均显著高于对照组(P<0.001)。结论在CHO细胞中表达了重组gC2蛋白,纯化的蛋白能够激发小鼠产生良好的体液免疫和细胞免疫应答,为进一步研制HSV亚单位疫苗奠定了基础。

E.coli O157:H7鞭毛蛋白H7抗原的表达纯化及抗血清的制备

应用生物信息学分析工具对E.coli O157∶H7鞭毛蛋白H7抗原(flic基因)表位进行分析,筛选抗原表位较富集的片段;优化基因序列,使其适合在原核载体中表达并化学合成序列。构建重组质粒pGEX-4T-2-flic和pET28a(+)-flic,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,分别用GST胶亲和层析技术和金属螯合层析技术纯化GST标签和His标签的目的蛋白,获得了高纯度的GST-Flic和His-Flic。使用His-Flic抗原免疫新西兰大耳白兔,间接ELISA法检测体液免疫效价,兔颈动脉取血并离心制备获得兔抗血清。纯化的两种蛋白和制备的兔血清多抗为研制E.coli O157∶H7检测试剂奠定了基础。

金黄色葡萄球菌表面蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的在原核细胞中表达金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A(fibronectin-binding protein A,FnBPA),制备其多克隆抗体。方法筛选FnBPA抗原表位富集区,优化基因序列,分别克隆至质粒pGEX4T-2和pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pGEX4T-2-fnbpa和pET-28a-fnbpa,分别转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,分别用High Affinity GST-NTA resin和High Affinity Ni-NTA resin进行纯化。以纯化后的FnBPA-His融合蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,以FnBPA-GST融合蛋白为检测抗原,采用间接ELISA法检测血清效价,Western blot法检测特异性。结果经双酶切及测序鉴定,证明质粒pGEX4T-2-fnbpa和pET-28a-fnbpa构建正确;在相对分子质量约42 000和19 000处,分别可见FnBPA-GST和FnBPA-His融合蛋白的表达,表达量分别约占菌体总蛋白的30%和20%,均以可溶性形式表达,纯度均在90%以上;免疫新西兰大白兔后获得高效价的特异性兔抗血清。结论2种标签的融合蛋白均具有较好的免疫原性和抗原性,所制备的多克隆抗体具有较好的特异性,为金黄色葡萄球菌检测方法的建立奠定了基础。

IKKε增加血管平滑肌细胞自噬促进小鼠腹主动脉瘤形成作用研究

目的探讨IKKε对小鼠腹主动脉瘤形成过程中血管平滑肌细胞自噬的影响。方法将载脂蛋白E敲除(ApoE^(-/-))的小鼠与载脂蛋白E和IKKε双敲(ApoE^(-/-)IKKε^(-/-))的小鼠用生理盐水(saline)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)分别刺激28天,检测小鼠的代谢水平以及用超声心动图检测小鼠的动脉直径,应用HE染色检测动脉瘤的病理性变化,马松染色检测小鼠动脉的纤维化水平,荧光法检测活性氧的产生和释放水平,免疫组化和Western blot检测自噬相关因子的表达变化情况。结果ApoE^(-/-)IKKε^(-/-)双敲小鼠与ApoE^(-/-)单敲小鼠代谢水平差异无统计学意义,ApoE^(-/-)IKKε^(-/-)双敲小鼠动脉直径显著小于ApoE^(-/-)单敲小鼠。ApoE^(-/-)IKKε^(-/-)双敲小鼠纤维胶原化水平显著低于ApoE^(-/-)单敲小鼠,且ApoE^(-/-)IKKε^(-/-)双敲小鼠中活性氧的产生水平明显低于ApoE^(-/-)单敲小鼠。免疫组化与Western blot结果均发现,ApoE^(-/-)IKKε^(-/-)双敲小鼠中LC3B与Beclin-1的表达水平均较ApoE^(-/-)单敲小鼠有明显的降低。结论小鼠IKKε基因的敲除能够明显抑制血管平滑肌细胞自噬,从而减少小鼠腹主动脉瘤的形成。