大菱鲆出血症病原菌的分离和鉴定

从患病大菱鲆体内分离到一株病原菌SMP1，经人工感染试验计算出SMP1的半致死量LD50=1．94×10^6。药敏实验表明氟哌酸、丙氟哌酸、复合磺胺、氯霉素、四环素对SMP1有较强的抑制作用。BIOLOG细菌鉴定系统不能对SMP1鉴定。综合形态观察、生理生化特征、16S rDNA、溶血素基因保守区分析等实验结果，可将SMP1鉴定为鳗弧菌。

养殖牙鲆鱼苗腹水症病原菌的鉴定及系统发育学分析

从患腹水症养殖牙鲆鱼苗分离到一株细菌B1 7,人工感染实验证实其具有致病性。用Biolog GN细菌鉴定系统对B1 7进行测试 ,发现其与参考菌株的相似性较低 ,不能进行鉴定。常规生理生化测试表明 ,B1 7具有弧菌属的特征 ,其表型特征与Vibriosplendidus非常相似。为了进一步明确菌株B1 7的分类学地位 ,测定了其 1 6SrRNA基因序列 ,分析了相关细菌相应序列的同源性 ,构建了系统发生树 ,结果表明菌株B1 7与V .splendidus的亲缘关系最近。综合上述结果 ,菌株B1 7可鉴定为V .splendidus。

鳗弧菌胞外产物中致病因子的分离纯化及性质研究

鳗弧菌致病株M3的胞外产物经超滤、SephadexG10 0凝胶层析、DEAE cellulose离子交换层析和HPLC凝胶色谱层析纯化后 ,得到一个纯化的毒性蛋白酶 ,其对金鱼的半数致死量为 1 2微克蛋白 /克体重。该蛋白酶的分子量为 36 5kDa ,等电点为 5 1;与底物A zocasin作用的最适pH为 8 0 ,最适作用温度 5 5℃ ,85℃作用 30min后酶被灭活。该酶活性可被EDTA、EGTA及 1,10 菲咯啉抑制 ,表明它是金属蛋白酶。N端部分氨基酸序列经测定为AGATGTGPGGAGLTG。

人工诱导雌核发育牙鲆的染色体及核型证明

于1994-1996年，分别在威海海洋渔业捕捞公司（石岛）和鸿洋实业总公司龙须岛育苗场采集人工培育的3－5龄牙鲆亲鱼，采用紫外线照射法使牙鲆精子遗传物质失活，并用冷休克法抑制受精卵第二极体释放，从而获得雌核发育二倍体牙好。原肠期采用空气干燥法、Giemsa染色，得到雌核发育二倍体、正常二倍体及单倍体的染色体制片，进行染色体和核型的分析。结果表明，牙鲆的雌核发育二倍体和正常二倍体的染色体数均为2n=48，核型为48t，即48条端部着色点染色体，臂数NF=48，两者的核型设有明显差异；单倍体为24条端部着丝点染色体；在3个组别中，第一号染色体上都有一明显的次缢痕。雌核发育二倍体牙鲆的诱导率为98％。

牙鲆GH基因外显子多态性与生长性状关系的初步研究

以一个牙鲆养殖群体中的100个个体为实验材料，根据其生长激素（GH）基因的五个外显子序列设计引物，进行PCR扩增，通过SSCP分析技术对其进行检测，结果表明该群体生长激素基因的第四个外显子存在多态性。共检测到两种基因型，其中AA型个体占88％，AB型个体占12％；DNA测序结果表明，AB型在第1763位发生碱基突变，c→t，与AA型同源性达到99％，同时发现不同基因型的个体在体重和头长上表现出显著的差异（P〈0．05）。上述结果表明利用PCR-SSCP技术可以检测到牙鲆生长激素基因外显子部分存在序列遗传多态性，且该多态性与其生长的某些性状具有一定的连锁关系，为将来进行标记辅助选育奠定了基础。

大黄鱼雌核发育二倍体的人工诱导

采用紫外线照射对大黄鱼(Pseudosciaena crocea Richardson)精子遗传物质进行完全灭活,灭活后精子与卵子受精获得雌核发育单倍体受精卵,再通过冷休克对单倍体受精卵进行倍性恢复,成功诱导出大黄鱼雌核发育二倍体。实验结果表明:(1)在紫外照射过程中照射剂量与大黄鱼精子和卵子受精后其成活率和孵化率呈现出明显的Hertwig效应,紫外照射时间超过2 min(剂量>2 400 ergs/mm2),可使大黄鱼精子遗传物质完全灭活。大黄鱼雌核发育诱导中精子遗传灭活的最适紫外照射时间为2.5 min(剂量为3 000 ergs/mm2);(2)冷休克法可成功抑制大黄鱼受精卵第二极体排放,诱导效果受处理时刻、处理时间和处理温度三因素的影响。综合雌核发育二倍体的诱导率、处理后受精卵早期胚胎存活率和仔鱼孵化率等因素,较适合的染色体加倍条件为23℃培育水温下授精后2 min,在3-4℃海水中处理10 min。

雌核发育牙鲆同工酶基因的重组及父方基因的表达

于 1 998年 4、5月在山东省荣成市寻山水产公司养鱼场人工采集牙鲆成熟精卵 ,紫外线灭活精子遗传物质 ,冷休克诱导 ,获得雌核发育牙鲆。 1 999年 5月收集 5 7尾雌核发育牙鲆生化样品 ,采用淀粉胶电泳分析了 LDH、IDHP、PGM、ACP、ADH、SDH、GDH、CAT等 8种在野生种群中为多态的同工酶。结果表明 ,牙鲆雌核发育群体的 Ldh- C、Cat两个基因座位发生了重组 ,基因座位与着丝点之间的重组率分别为 5 2 .6 %和 2 9.8% ;Idhp- 1有父方基因表达现象 ,说明雌核发育过程中父方基因可能在分子水平整合 ;牙鲆雌核发育群体的多态座位比例和平均杂合度分别为 7.0 %和 0 .0 3 5 ,远低于野生种群 ;研究表明 ,通过抑制第二极体排出获得的牙鲆雌核发育子代尚有一定基因杂合 。

牙鲆同质雌核发育人工诱导研究

采用紫外线照射对牙鲆(Paralichthys olivaceus)精子遗传物质进行完全灭活,灭活精子与牙鲆卵子授精获得雌核发育单倍体受精卵,再通过冷休克或静水压法对其进行倍性恢复,成功诱导出同质雌核发育牙鲆。牙鲆精子遗传灭活的最适紫外照射剂量为3.6×10^(-3)J/mm^2(照射时间为180s);(15±0.2)℃水温下冷休克法诱导的最适条件为受精后85min,0～2℃水温处理45min;静水压法的最适诱导参数为受精后85min,600kg/cm^2压力处理6min,诱导效率静水压法明显高于冷休克法。两种方法诱导组胚胎发育较对照组在原肠期前都有明显滞后现象,开口前同质雌核发育仔鱼比异质雌核发育仔鱼存活率低,但二者全长生长无显著差异(P<0.05)。这些结果为牙鲆纯系建立及其应用提供了重要依据。

冷休克法和静水压法人工诱导大黄鱼三倍体

同时采用冷休克法和静水压法进行大黄鱼（Pseudosciaena crocea Richardson）倍体诱导条件研究，同时比较适合条件下两种方法诱导效果差异以及大批量诱导组不同生长阶段三倍体榆出率的差别。结果表明：（1）冷休克法和静水压法都可成功诱导出大黄鱼二倍体。冷休克法适宜诱导条件为20℃培育水温下授精后3min，在3～4℃海水中处理8～10min；静水压法适宜诱导条件为同样培育水温下授精后3min，在静水压450kg／cm^2下处理3min。三倍体诱导率受处理时刻、处理时间和处理温度（或压力）3因素的影响。（2）综合三倍体诱导率、处理后受精卵原肠期存活率和仔鱼孵化率，静水压法诱导效果要明显优于冷休克法。（3）采用冷休克法进行大黄鱼三倍体大批量诱导，早期胚胎、初孵仔鱼和4月龄幼鱼三倍体检出率分别为34．03％、29．54％和14.81％。表明随生长发育诱导组三倍体检出率有下降趋势。

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)胞外产物中蛋白酶的纯化及其性质

对鳗弧菌 (Vibrioanguillarum)胞外产物中蛋白酶的纯化方法及其性质进行了研究 .其中 ,蛋白酶的纯化步骤包括 :(1)硫酸铵沉淀 ;(2 )SephadexG 10 0凝胶过滤 ;(3)DEAE Sepharose色谱分离 ;(4)DEAE Cellulose (DE 32 )色谱分离 .经上述纯化步骤得到两种蛋白酶 ,经SDS PAGE分析 ,Mr分别为 37.4× 10 3 和 33.1× 10 3 .以偶氮酪蛋白 (azocasein)作底物测其水解酶活性 ,结果表明二者差别显著 ,前者明显高于后者 .而且 ,Mr37.4× 10 3 的蛋白酶在pH 7～ 10范围内均显示较高活性 ,在 4 0～ 6 0℃范围内稳定性好 .结果表明该蛋白酶是一种金属蛋白酶 .关于该蛋白酶对牙鲆(Paralichtysolivaceus)的毒性作用尚在研究之中 .图 6表 3参

漠斑牙鲆养殖群体RAPD遗传多样性的初步分析

利用RAPD技术对由美国引进的漠斑牙鲆（Paralichthys lethostigma）齐殖子一代群体的遗传多样性进行了研究。实验用漠斑牙鲆鱼苗于2004年10月取自山东莱州大华水产有限公司，共24尾，全长平均为16．6mm±1．99mm。活体取其肌肉，用高盐法柚提获得总DNA，琼脂糖电泳检测，Beckman DU-6100型紫外分光光度仪定量后用随机引物进行PCR扩增，从25个随机引物中筛选出11个用于群体遗传学分析，共获得77条清晰重复性高的DNA片段，大小在100～2000bp之间，多态谱带比例和群体平均杂合度分别为66．23％和0．3526。

牙鲆GHR基因Promoter区微卫星序列多态性与生长性状关系的初步研究

采用牙鲆GHR基因5’端Promoter区的1个微卫星标记,对胶南和日照2个牙鲆养殖群体进行了群体遗传多样性的研究,并探索该基因多态性位点与牙鲆生长性状之间的相关性。结果表明,2个群体在该座位的等位基因数为12和9个,有效等位基因数为6.26和5.04个,多态信息含量为0.84和0.80。2个群体该座位的Hardy-Weinberg遗传偏离指数均为正值,并没有显示出杂合子缺失,但各基因型分布频率都在一定程度上偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)。连锁分析中发现,在胶南群体中,IM基因型对应的个体在全重、全长、体长、头长、体高和眼径形态学数据中均是最大的;在日照群体中,BC基因型对应的个体在全重、全长、体高、尾柄高、尾柄长和眼径数据中均是最大的;而CJ基因型对应的个体在体长和头长这两组数据中是最大的。该结果为研究GHR基因的变异对鱼类生长发育的影响及探索将该基因作为生长遗传标记的可行性奠定了实验基础。

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)M3菌株生长条件及其对蛋白酶产量的影响

采用体外测定细菌浓度、胞外产物 (ECP)蛋白含量和蛋白酶活力的方法 ,进行了鳗弧菌M3菌株在 2 2 16E培养基中的培养条件研究。结果表明 ,该菌株用固体培养基培养至 2 4h左右 ,可得到较高的菌体浓度、ECP蛋白含量和蛋白酶活力。采用响应面分析方法设计实验 ,用SAS统计软件分析数据 ,得到NaCl浓度、pH值和温度对菌体生长及蛋白酶产量影响的回归模型。在 2 2 16E培养基的基础上 ,添加不同氮源、碳源物质以及不同浓度蛋白胨进行生长研究。结果表明 ,胰大豆蛋白胨能促进菌体生长及ECP蛋白分泌 ;NH4 Cl与酪蛋白水解物可抑制蛋白酶的产生 ;牙鲆肌肉匀浆对菌体、ECP蛋白产量和蛋白酶产生有不同程度的促进作用 ;培养基中蛋白胨浓度为 4 %时菌体量与ECP蛋白含量达最高值 ,在蛋白胨浓度为 2 %时蛋白酶分泌量已稳定 ;1%的葡萄糖、蔗糖、甘油均能显著地提高菌体及ECP蛋白产量 ,却抑制了蛋白酶的产生。

鳗弧菌油乳化二价口服疫苗免疫养殖大菱鲆的免疫应答及免疫效果的研究

以鳗弧菌M3和SMP1为细菌抗原制备了油乳化二价疫苗,用饵料包埋后连续7天口服免疫大菱鲆鱼,评价鱼的免疫应答和疫苗的保护效果.结果显示,乳化疫苗在鱼后肠刺激产生的溶菌酶和抗蛋白酶活性以及抗体水平均高于未乳化疫苗（P＜0.05）;并且在乳化疫苗免疫的鱼血清检测到明显升高的M3抗体效价（P＜0.05）.原位杂交结果显示,乳化疫苗免疫鱼的后肠IgM的产生水平高于未乳化疫苗免疫鱼.攻毒实验显示,乳化疫苗免疫的鱼对M3和SMP1的感染分别获得100%和50%的免疫保护率,而未乳化疫苗获得的免疫保护率分别为57.9%和0%.结果表明,鳗弧菌油乳化二价口服疫苗能引起大菱鲆后肠的非特异性和特异性免疫应答并有效地抵抗鳗弧菌的感染,适合用作水产口服鱼用疫苗.

星斑川鲽(Platichthys stellatus)养殖群体的RAPD分析

利用RAPD技术对星斑川鲽养殖群体的遗传多样性进行了研究。将实验用星斑川鲽养殖群体的活鱼苗解剖，取其肌肉，高盐法抽提获得总DNA，质量鉴定和浓度测定后用随机引物进行PCR扩增，从20个随机引物中筛选出18个用于群体遗传学分析，共扩增出133条带，谱带大小为100～2000bp，大多数谱带分布在250～1000bp。多态谱带数为83，每个引物扩增谱带数为1～14条，平均为7条。多态谱带比例为62．41％，Shannon的信息指数和Nei的多样性指数分别为0．21和0．3166。

牙鲆性腺分化的组织学研究

运用组织学方法对牙鲆（Paralichthys olivaceus）的性腺分化和发育过程进行了观察。结果表明，牙鲆的性腺发育可分为3个阶段，即原始性腺阶段、性腺分化阶段和性腺分化后阶段。培育水温为18℃～20℃下，孵化后第45天、平均全长为22．0mm±2．8mm的牙鲆，其性腺分化尚未开始，属于原始性腺。70日龄、平均全长为38．0mm±1．7mm的牙鲆，部分个体中观察到卵巢的雏形，其余个体中性腺变化并不大；到了第110天、平均全长达到86．5mm±5．9mm时，雌性个体卵巢的卵巢腔进一步增大，并出现卵原细胞向卵母细胞的转变。精巢的分化开始于90日龄、平均全长为63．5mm±3．4mm的幼鱼，此期精原细胞快速增殖，体细胞进行有丝分裂并逐渐形成输精管原基；进一步的细胞学分化则出现在100日龄、平均全长为76．0mm±8．6mm的个体中，此时可以看到精小叶的形成；在平均全长为140．0mm±15．2mm时，精巢中出现初级精母细胞，标志着性腺分化的基本完成。

重组酵母菌对牙鲆生长及血清激素含量的影响

于１９９８年１０—１１月间在荣成市寻山养殖场实验了饲喂具有大麻哈鱼生长激素基因的酵母菌对牙鲆的生长及其血清激素的影响。实验分为对照组和三组实验组，其中对照组的饵料中不含重组酵母菌，实验组的饵料中分别含有重组酵母菌０．２５Ｗ‰、０．５０‰、０．７５‰（Ｗ／Ｗ）。实验表明，通过投喂重组酵母菌，可以增加牙鲆血清生长激素的含量，促进牙鲆的生长。重组酵母菌的含量不同，对牙鲆血清甲状腺素和三碘甲状腺原氨酸的影响也不同。促甲状腺素的含量与牙鲆血清甲状腺激素的含量呈负相关趋势，与生长激素无明显关系。