γ-干扰素ELISA检测方法在广西牛结核病流行病学调查中的应用

【目的】摸清广西水牛及奶牛结核病的流行情况，为制定净化广西牛结核病防制策略提供参考。【方法】2008～2011年采用皮内变态反应和γ-干扰素ELISA检测方法联合对广西奶牛及水牛开展结核病流行病学调查，共检疫5478头奶牛和1580头奶水牛。【结果】2008～2011年从广西南宁、柳州、北海、钦州、桂林等市累积检测出皮内变态反应阳性奶牛63头、水牛17头，阳性检出率分别为1.15％和1.08％，总体上广西奶牛及水牛结核病阳性率呈现逐年降低的趋势。通过采用自制水γ－干扰素EusA检测试剂盒和Bovigam牛结核分枝杆菌γ-干扰素检测试剂盒对牛结核病进行检测，发现γ-干扰素ELISA检测的牛结核病阳性率低于皮内变态反应，且准确度高。【结论】对牛群进行结核病检测时，先以变态反应检疫牛群，再结合γ-干扰素ELISA检测进行综合判断，更有利于牛结核病的检测与净化。

牛结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的原核表达及其在牛结核病检测中的应用

采用重组PCR技术从牛结核分枝杆菌AN5基因组DNA中扩增CFP10-ESAT6融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a,构建了原核表达质粒pET-CFP10/ESAT6。重组子经酶切及测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳鉴定,获得约42 ku带有6×His蛋白标签的rHIS-CFP10/ESAT6融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的40%。用HIS蛋白纯化柱纯化该蛋白,Western-blot分析显示,该融合蛋白能与抗牛结核分枝杆菌阳性血清发生特异性反应。将重组的该融合蛋白用于刺激单次皮内变态反应阳性牛全血,可以产生高水平的IFN-γ,其特异性优于结核菌素。结果表明,获得的重组融合蛋白rHIS-CFP10/ESAT6为牛结核病的诊断奠定了基础。

两种奶牛结核病检测方法的比较

本研究中采用常规皮内变态反应(TST)对广西南宁、柳州共计2 818头黑白花奶牛进行牛结核病检测,采用抗原特异性IFN-γ试验方法对PPD检测结果为阳性、可疑的牛以及部分阴性牛进行复检。将抗原特异性IFN-γ试验与TST检测结果相比,其敏感性为53.33%,特异性为70.49%,符合率为67.11%。本研究证实单独使用PPD皮内变态反应方法在牛结核病的诊断方面存在非特异性强等缺点,易造成假阳性牛的误杀;用抗原特异性IFN-γ试验对TST试验阳性和可疑牛进行复检可以提高特异性,该方法在临床上有重要应用价值。

水牛IFN-γ成熟蛋白基因的原核表达及其产物多克隆抗体的制备

将水牛γ-干扰素成熟蛋白(IFN-γ)基因亚克隆至pGEX-6P-1中,成功构建了pGEX-BoIFN-γ表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)重组菌进行IPTG诱导表达。应用SDS-PAGE方法对表达产物rGST-BoIFN-γ进行分析,用GST琼脂糖凝胶柱对可溶性蛋白进行分离纯化,并采用ELISA和Western-blot试验鉴定重组蛋白的免疫活性。将可溶性纯化蛋白作为抗原免疫小鼠,包涵体蛋白经SDS-PAGE分析后切取目的蛋白免疫小鼠以制备多克隆抗体。结果表明:重组菌经37℃0.5 mmol/L的IPTG诱导3 h,表达出43 ku的融合蛋白。目的蛋白的表达量达到菌体总蛋白量的30%,分别以可溶性和包涵体两种形式存在,而可溶性表达蛋白纯化后的纯度较高。获得的重组蛋白具有良好的免疫活性。均能从可溶性蛋白及包涵体蛋白免疫小鼠得到针对rGST-BoIFN-γ的特异性多克隆抗体。

聚乙二醇化重组人白细胞介素6的放射性标记

分别用常规氯氨T和改进的双相氯氨T法对PEG-rhIL-6进行放射性碘标记,用柱层析法和离心超滤法对标记物分离纯化,同时用三氯乙酸沉淀法和SDS-PAGE电泳法鉴定纯化后的标记化合物放射化学纯度,采用rhIL-6依赖细胞7TD1,用MTT比色法测定标记物的生物学活性。结果表明:1.改进的双相氯氨T法标记率为74.5%,高于常规氯氨T法的62.3%,放射性比活度分别为5.513×105和4.610×105Bq/μg。2.经柱层析法和离心超滤法对标记物分离纯化后,用三氯乙酸沉淀法测得放射化学纯度均能达到99%以上。3.用SDS-PAGE电泳法检测两种标记方法所得的标记物与非标记物的结果表明,常规氯氨T法标记物比非标记物多1条高分子量蛋白带,认为是标记过程中蛋白质受到部分损伤;改进的双相氯氨T的标记物与非标记物蛋白质条带一致,认为蛋白质标记后基本没有受到损伤。4.生物活性检测表明改进的双相氯氨T标记物与非标记物活性之间无显著差异,常规氯氨T法标记物活性略低于双相氯氨T的标记物活性。

GnRH免疫在肉牛去势上的应用

免疫去势技术在肉牛上的研究已有 2 0多年的历史 ,本文就最新研究资料综述了促性腺激素释放激素 (GnRH)免疫的作用机理及其在肉牛免疫去势方面的研究进展 。

广西宠物诊疗市场现状和规范化管理探讨

随着宠物热的兴起,宠物诊疗业蓬勃发展,但该行业依然存在专业人员严重缺乏,行业标准和规范不完善、管理落后等问题,严重阻碍了发展,本文就广西宠物诊疗业存在的问题及应对措施进行了深入的探讨,以期为促进广西宠物诊疗业的良性发展提供借鉴。

GnRH免疫对肉牛去势效果及生产性能的影响

本文综述了GnRH免疫的作用机理及其在肉牛免疫去势和生产性能影响方面的研究进展,并展望了该项技术在国内肉牛畜牧业发展方面的应用前景。

H1N1猪流感病毒广西分离株HA基因序列分析

【目的】了解H1N1猪流感病毒广西分离株的分子特征,为广西猪流感疫情监控提供参考依据。【方法】采用RT-PCR对2011年分离获得的H1N1猪流感病毒广西分离株（A/swine/Guangxi/1/2011）的HA基因进行扩增,然后利用DNASTAR分析软件对测序基因片段进行整个阅读框架的核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性比对分析,并用MEGA4.0绘制遗传进化树。【结果】广西分离株HA基因长1701bp,编码566个氨基酸,核苷酸序列与经典SIV的同源性为88.0%~99.6%,与季节性H1N1人流感病毒的同源性为76.3%~77.3%,与欧洲类禽SIV分离株的同源性为72.9%~75.4%,与2009甲型H1N1流感病毒的同源性为99.2%~99.6%;从核苷酸遗传进化树可知,广西分离株与类禽H1N1流感病毒和人H1N1流感病毒分离株的亲缘关系较远,而与2009甲型H1N1流感病毒分离株的亲缘关系最近。广西分离毒株HA基因的裂解位点序列为IPSIQSR↓G,具有典型低致病性流感病毒的分子生物学特征;共有8个糖基化位点,其中6个位于HAl区,两个位于HA2区;广西分离株HA蛋白RBS位点的氨基酸同时具有人和猪流感病毒的特点。【结论】广西分离株（A/swine/Guangxi/1/2011）属于2009甲型H1N1流感病毒。

新蛋白构型GnRH多肽疫苗对公兔生殖性能的影响

用蛋白结构修饰后的促性腺激素释放激素并列体二聚物(G6k-GnRH-Tandem-Dimer,GnRH-TDK)2次免疫公兔,研究了该疫苗对公兔生殖性能和生长情况的影响。12只公兔随机分为免疫组和对照组,免疫组于3月龄初免,4周后加免1次。每周采用放射免疫分析法测定公兔血清睾酮水平,发现免疫组睾酮浓度从82.74±16.03ng/ml降至59.24±16.18ng/ml;观察其体重和性行为,免疫组无明显性行为,体重与对照组接近。免疫后9周屠宰公兔比较睾丸重量、体积和精液质量,进行睾丸组织学分析,发现免疫组睾丸大小、精子密度极显著(P<0.01)低于对照组,其睾丸组织结构病变明显。这些现象表明,用新蛋白构型GnRH多肽免疫后,公兔睾酮分泌减少,睾丸发育受阻,精子密度和活力降低,去势效果好,且不影响动物的生长。

广西鹅α干扰素基因的克隆与序列分析

根据GenBank上已发表的东北白鹅α干扰素(IFN-α)基因(AY524422)序列设计1对特异性引物,采用RT-PCR从经鹅副粘病毒(GPMV)刺激培养的鹅外周血淋巴细胞中克隆获得广西鹅IFN-α基因,将其连接pMD18-T载体、转化DH5α感受态细胞后进行序列分析。结果表明,广西鹅IFN-α基因完整的开放阅读框大小为576 bp,共编码192个氨基酸残基,其推导的氨基酸中有7个半胱氨酸残基和2个潜在的糖基化结合位点(NDT和NHT)。与GenBank上已公布的其他IFN-α基因进行同源性比较分析,发现广西鹅IFN-α基因与东北白鹅的同源性最高(核苷酸同源性为98.3%、氨基酸同源性为96.4%),与鸡、牛、猪、鼠、犬、人等的同源性较低。说明IFN具有种属特异性,且亲缘关系越近同源性越高,这与物种之间的进化亲缘关系一致。

长效促红细胞生成素的放射性标记

采用改进的双相氯胺 T法对LL EPO进行碘标记 ,使用离心超滤法分离纯化标记混合物 ,对标记纯化的LL EPO经三氯乙酸沉淀和SDS PAGE法鉴定放化纯度 ,通过网织红细胞法对标记前后的蛋白生物活性进行鉴定。结果表明 :1 改进的双相氯胺 T法标记LL EPO ,其标记率为 89% ,比放射性为 5 82× 1 0 5Bq·μg-1蛋白 ,放化纯度 >96% ,SDS PAGE法鉴定标记产物同原型蛋白电泳行为一致 ,Rf值分别为 0 2 8、0 49,网织红细胞法鉴定的标记蛋白与非标记蛋白的生物活性无差异。2 离心超滤法得到的蛋白回收率为 95 %以上 ,而凝胶过滤法得到的蛋白回收率仅为 2 3 82 % ;

猪瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中5′端非编码区的靶序列设计了用于TaqMan荧光定量PCR的1对引物及TaqMan探针,以猪瘟活疫苗病毒为模板,在常规PCR的基础上优化了TaqMan荧光定量PCR反应条件,建立了猪瘟病毒(CSFV)TaqMan荧光定量PCR检测方法。其敏感性和特异性试验结果表明,所建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法对CSFV具有很高的特异性,其检测灵敏度可达5.03×10-2μg/μL。说明TaqMan荧光定量PCR适用于CSFV的快速检测。

广西猪源禽Ⅰ型副粘病毒的分离与鉴定

【目的】了解广西猪源禽Ⅰ型副粘病毒的流行特征、毒力强弱及基因类型,为今后开展猪源副粘病毒的相关研究提供参考,也为有效防控副粘病毒感染奠定基础。【方法】采集疑似发病猪组织病料,通过鸡胚接种传代分离病毒后,分别进行血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验、平均死亡时间(MDT)和脑内接种致死指数(ICPI)测定,然后运用RT-PCR对分离株进行鉴定及扩增部分F基因片段,并对扩增片段进行克隆测序及比对分析。【结果】从广西疑似发病猪组织中分离获得一株猪源禽I型副粘病毒,其HA、HI效价均为26,鸡胚最小致死量为10-8/0.1mL,MDT为60h,ICPI为1.45;分离株F基因112～117位裂解位点的氨基酸组成为R-R-Q-R-R-F,与NDV标准强毒株HER33、F48E9的裂解位点一致;同源性分析结果表明,分离株与标准强毒株F48E9、中等毒力代表毒株BeaudetteC的核苷酸同源性分别为86.5%和85.7%,其推导氨基酸同源性分别为90.1%和90.8%。【结论】猪源禽Ⅰ型副粘病毒分离株为强毒株,属于基因Ⅱ型,是传统型毒株,广西地区禽I型副粘病毒宿主范围呈不断扩大趋势。

广西水牛γ干扰素基因的克隆与序列分析

提取经刀豆素(ConA)诱导培养的水牛外周血淋巴细胞的总RNA,采用RT-PCR技术扩增水牛IFN-γ基因,将其克隆到pMD18-T载体上,并进行测序。序列分析结果表明,获得的IFN-γ基因全长为544个碱基,其开放阅读框(ORF)为501个碱基,编码166个氨基酸。与GenBank上已发表的水牛、乳牛的IFN-γ基因进行同源性比较,其核苷酸同源性均高于97%,氨基酸同源性均高于96%;与其他种类动物的IFN-γ的同源性相比,随其亲缘关系的远近有所降低。

鹅源H9N2亚型禽流感病毒PB2和PB1基因序列分析

采用RT-PCR方法对1株鹅源H9N2亚型禽流感病毒(GS/GX/01/07)RNA聚合酶基因PB2和PB1分别进行了扩增,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定与分析。结果表明,该株病毒的PB2、PB1开放阅读框(ORF)分别由2 280和2 277个碱基组成,分别编码759和758个氨基酸。经同源性和系统进化树分析,该毒株RNA聚合酶基因PB2和PB1与H9N2亚型欧亚谱系中的第2亚群代表株QA/HK/G1/97的核苷酸和氨基酸同源性在95%以上,亲缘关系较近。

2株鹅细小病毒的主要结构蛋白VP2基因的克隆和序列分析

将鹅细小病毒PJ分离株和XJ分离株接种于13日龄非免疫鸭胚,收集接毒后24～72h死亡的鸭胚尿囊液。根据Genbank已发表的鹅细小病毒B株基因组核苷酸序列设计1对引物,对2株鹅细小病毒毒株主要结构蛋白VP2基因进行PCR扩增,将扩增产物与pMD18-T载体连接并测序。结果表明:PJ株和XJ株VP2的核苷酸序列全长分别为2 044bp和2 050bp,PJ株与B株、XJ株、台湾株的同源性均为93.5%～96.7%,与YG株、哈尔滨株、广东株的同源性为88.7%左右,与匈牙利株的同源性仅为80.7%,而与番鸭细小病毒的同源性为74.8%～80.7%。XJ株与匈牙利株的同源性为83.5%,与番鸭细小病毒的同源性为76.8%～80.0%,与其他毒株的同源性为91.6%～98.3%。

广西鹅γ干扰素基因的克隆与序列分析

为进一步研究鹅干扰素(IFN)的分子生物学特性及抗病毒作用机理,提取经刀豆素(ConA)刺激培养的鹅外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR技术扩增获得鹅IFN-γ基因,将其克隆至pMD18-T载体并进行序列测定分析。结果表明,克隆获得的广西鹅IFN-γ基因与GenBank上已公布的鹅IFN-γ基因核苷酸序列的同源性均高于99.2%、氨基酸同源性均高于98.2%;与其他动物的IFN-γ基因核苷酸及氨基酸序列比较,亲缘关系越远,同源性越低。

聚乙二醇化重组人白细胞介素-6的放射性碘标记条件探讨

采用双相氯胺-T法对聚乙二醇化重组人白细胞介素-6(PEG-rhIL-6)进行碘化标记,比较了双相氯胺-T法碘化标记PEG-rhIL-6在不同反应条件下的标记效果。用三氯乙酸沉淀法和γ计数探测仪测定标记物的标记率、超滤离心法对标记物进行分离纯化、三氯乙酸沉淀法鉴定标记物的放化纯度、SDS-PAGE电泳分析标记蛋白断链损伤情况。结果表明,采用该方法标记PEG-rhIL-6,在100μL、pH值7.4的反应体系中,控制反应蛋白量为25μg、浓度20g/L的氧化剂15μL、室温反应时间40—50min,可获得较高的标记率和放化纯度,比放射性适中,标记效果比较理想。

简便高效的蛋白质双相氯胺-T碘标法的建立及其应用

对双相氯胺-T碘标法实验装置作了改进并标记长效促红细胞生成素(LL-EPO),采用离心超滤技术代替传统的柱层析脱盐纯化标记蛋白质。结果显示125I-LL-EPO具有高比活性、高生物活性、高回收率。说明双相氯胺-T碘标法简单方便,是蛋白质同位素碘标记的理想方法;离心超滤技术适合放射性碘标记蛋白质的纯化。