成军:非酒精性脂肪性肝病新药的研发

记者:请您介绍下您研究的脂肪肝产品“利沃素”是一个什么样的产品?成军教授:“利沃素”是国家正式批准的一款功能性医学食品,成分是人参提取物。目前我们在一定范围内尝试在脂肪肝患者的生活干预方面是否有一些效果。这是我们课题组从发现新基因HCBP6,到产品设计研究了20多年的结果。

杜仲叶苯丙素类成分的研究

目的 :对杜仲叶化学成分进行研究。方法 :溶剂法、色谱法分离化学成分 ,波谱法鉴定其结构。结果 :从叶中分离得到 6个化合物 ,熊果酸 (1) ,β 谷甾醇 (2 ) ,对香豆酸 (3) ,咖啡酸乙酯 (4 ) ,绿原酸 (5 ) ,松柏苷 (6 )。 结论 :均为首次从杜仲叶中得到 ,化合物 3,4。

杜仲叶黄酮类化合物的研究

目的 :从杜仲叶中分离化学成分。方法 :溶剂法和色谱法分离 ,波谱法鉴定化合物的结构。结果 :从杜仲叶中分离得到 7个化合物 ,鉴定为 5个黄酮 :山奈酚 (1)、槲皮素 (2 )、紫云英甙 (3)、陆地锦甙 (4)、芦丁 (5 ) ;1个简单的酚 :3,4 二羟基苯甲酸 (6 )和 1个葡萄糖乙甙 (7,ethylglucopyranoside)。 结论 :其中化合物 3～ 7为首次从杜仲叶中获得。

中药鸡血藤化学成分的研究

目的 :研究中药鸡血藤Spatholobussuberectus的化学成分。方法 :用色谱法分离 ,用波谱法鉴定结构。结果 :分离并鉴定了 5个化合物 ,分别为 2 甲氧基 4 (2′ 羟乙基 ) 苯酚 1 O β D 吡喃葡萄糖苷 (1)、正丁基 O β D 吡喃果糖苷 (2 ) ,二十五烷酸 α 单甘油酯 (3) ,白桦脂酸 (4) ,正二十六碳酸 (5 )。结论 :均为首次从该属植物中获得。

生物信息学技术与新基因的研究

0引言 新基因的克隆化无异是生物医学领域创新知识源泉的重要组成部分.这一任务,不仅是人类基因组计划(HGP)的核心内容,同时也是后基因组计划(post-HGP)的重要内容.

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6基因和蛋白的生物信息学分析

目的:克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合的肝细胞的蛋白基因,对新发现的基因及编码产物的结构与功能,及其基因表达的调节机制的结构基础进行生物信息学分析。方法:应用酵母双杂交技术,以HCV的核心蛋白作为“诱饵(bait)”,筛选鉴定与其结合的肝细胞中蛋白的编码基因。应用生物信息学(bioinformatics)技术,对其中筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)全长基因及其编码产物的一级结构序列,进行生物信息学分析。获得该基因的基因组序列,并利用同源基因序列的比对,确定该基因在染色体上的定位,并确定人HCBP6基因的内含子序列。对其编码上游的基因组DNA序列进行分析,获得该基因启动子序列的一些信息。同时,根据同源基因序列的比较,确定了小鼠HCBP6的基因序列和氨基酸残基序列。通过对氨基酸残基序列的疏水性特点的分析,确定了HCBP6蛋白的潜在的抗原结构位点。通过蛋白质一级结构的在线计算机软件的分析,对人HCBP6蛋白质一级结构潜在的功能性结构位点进行了计算机辅助分析预测。结果:通过酵母双杂交技术的筛选和鉴定,结合生物信息学分析,证实人HCBP6基因由456 nt组成,编码产物由152 aa组成。人HCBP6的基因组DNA是没有内含子序列的DNA结构。通过生物信息学技术分析,确定人HCBP6基因组DNA定位于人22号染色体上。在对人HCBP6基因启动子序列的生物信息学分析中发现了几段可能的启动子序列结构,以及可能的转录因子蛋白潜在的结合位点。利用同样的技术,确定了小鼠的HCBP6的基因序列和蛋白质一级结构序列。对人HCBP6的蛋白质一级结构序列进行分析,发现在其序列中第80-110氨基酸残基序列之间存在疏水性结构位点,提示抗原位点所在,对其进行免疫学分析提供了可能。利用在线软件,对人的 HCBP6蛋白质结构中潜在的功能位点进行了初步的预测,为进一步研究HCBP6蛋白的生物学功能的实验研究,提供了丰富的信息。这些生物信息学分析的结果,虽然目前还只是初步的,有些还不能被实验所证实,但是,对新基因的结构与功能的研究来说,毕竟这种生物信息学分析,能够提供一些线索,对下一步结构与功能分析实验的设计,具有很大的帮助。结论:酵母双杂交技术结合生物信息学技术,是克隆、分析蛋白结合蛋白的基因,对于其功能结构域的预测的有效工具,在病毒性肝炎的致病机制研究中具有重要应用前景。

乙型肝炎病毒对细胞信号转导的影响

0引言 乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒的一种,HBVDNA长度为3.2kb,具有4个开放读码框架(ORF),分别编码HBV的表面抗原蛋白,核心/e抗原,X蛋白以及HBV DNA的聚合酶.此外,HBV DNA结构中还有4段启动子、2段增强子以及与HBV DNA复制过程密切相关的顺向重复序列1、2(DR1、DR2)等[1].

保留左结肠动脉的腹腔镜低位直肠癌前切除术

目的探讨腹腔镜低位直肠癌前切除术中处理肠系膜下动脉(inferior mesenteric artery,IMA)时保留左结肠动脉(left colonic artery,LCA)的可行性及临床价值。方法回顾性分析我院2010年5月~2014年10月85例腹腔镜低位直肠癌前切除术的临床资料,其中保留LCA 44例,IMA根部结扎(不保留LCA)41例,比较2组临床病理资料、手术效果及术后并发症。结果 2组手术时间、术中出血量、术后排气时间、第3站淋巴结清扫数目及转移率均无显著性差异(P>0.05)。保留LCA组无游离脾曲及末端回肠造口,不保留LCA组6例游离脾曲(P=0.010),3例行末端回肠造口(P=0.108)。2组术后吻合口漏、复发、转移率差异无统计学意义(P>0.05)。结论腹腔镜低位直肠癌前切除术保留LCA可以保障近端结肠血运,保证第3站淋巴结根治性。

丙型肝炎病毒结构基因转基因小鼠引起肝脏脂肪变

目的:建立持续表达和诱导表达型丙型肝炎病毒(HCV)结构基因(包括核心蛋白和包膜蛋白E1、E2编码基因)的转基因小鼠动物模型,探讨HCV结构基因表达导致肝脏脂肪变的病理改变.方法:以含有近全长HCVcDNA的质粒为模板,通过多聚酶链反应(PCR)技术扩增HCV结构基因的DNA片段(约2.2kb),克隆到真核表达载体pcDNA4HisMas和pMT/BiP/V5-HisA中,分别构建成持续表达型表达载体pcDNA4HisMas-HCVCore-E2和诱导表达型表达载体pMT/BiP/V5-HisA-HCVCore-E2.以限制性内切酶分析和目的DNA片段的核苷酸序列分析,证实构建HCV结构基因的真核表达载体正确无误.以脂质体体外转染COS-7细胞系,利用抗-HCVE2的多克隆抗体进行Westernblot杂交分析,证实转染细胞中有HCVE2蛋白的表达.利用小鼠受精卵细胞核微注射方法,导入线性化表达载体的DNA,利用假孕小鼠的受精卵植入方法,建立了表达HCV结构基因的转基因小鼠模型.对于持续表达型转基因小鼠的死胎、6月龄以及硫酸铜诱导表达型的转基因小鼠模型的肝脏组织,进行HE染色和病理学特征的分析.结果:构建了持续性表达和可诱导性表达型的HCV结构基因表达载体pcDNA4HisMas-HCVCore-E2和pMT/BiP/V5-HisA-HCVCore-E2,体外转染COS-7细胞证实转染细胞中有HCVE2抗原的表达.对于持续表达型转基因小鼠死胎肝脏病理学特征进行分析,发现肝组织尚未分化发育完成,肝内有大量造血细胞,肝细胞空泡变性,单个核细胞聚集现象.对于持续表达HCV结构基因的6月龄转基因小鼠的肝脏进行病理学分析,发现中央静脉区肝细胞小泡型脂肪变性,中央静脉周围细胞溶解坏死,中央静脉明显扩大,少数组织中亦见大泡型脂肪变性.对于可诱导型转基因小鼠的肝脏进行病理学分析,发现肝小叶内中央静脉周围坏死区累及5-10个小叶,周围无淋巴细胞浸润,交界区可见多数肝细胞核异常,或固化,或呈花环状,或溶解为淡蓝色无定形基质.泡浆内残留大量脂肪小泡,肝脏脂肪变与核异常有一移行过程.结论:建立了表达HCV结构基因的转基因小鼠,发现HCV结构基因的转基因小鼠肝脏有典型的脂肪变病理改变,为进一步研究HCV感染引起的慢性丙型肝炎合并脂肪变的特征和机制研究奠定了基础.

高低浓度HBsAg血清中7项乙肝标志物的表现模式分析

目的分析不同浓度HBsAg血清中7项乙肝标志物表现模式,以揭示其在人群中的分布特征。方法对252份低浓度和387份高浓度HBsAg血清标本的7项乙肝标志物进行检测;为表述方便,将乙肝标志物检测项目的第1～5项,依次用1、2、3、4、5作为该模式的代码。结果高浓度HBsAg组和低浓度HBsAg组在人群中的比例分别为10.2%和0.7%左右,两组血清学乙肝标志物的表现模式分别有10种和7种,各模式在两组间的检出率不完全相同,且两组间各模式的Anti-HBc-IgM、HBVDNA检出率亦不尽相同,但两组各模式均以145模式为最高,其次为135和15模式。低浓度组中,约70%的145、15模式分布在1.0～2.0μg/L范围内,近65%的135模式分布在2.0～5.0μg/L范围内,其他模式则多数分布在≤1.0μg/L以下。结论高浓度和低浓度HBsAg携带者的血清学乙肝标志物表现模式在人群中具有不同的分布特征,低浓度HBsAg感染人群宜引起重视,应将包括Anti-HBc-IgG在内的乙肝标志物检测列为常规检查项目。

乙型肝炎血清学标志物单项抗-HBc-IgG阳性结果的解释及临床意义

目的探讨HBV标志物单项抗-HBc-IgG（抗-HBc）阳性结果的临床意义。方法对微粒子酶免分析（MEIA）检测5213例、ELISA检测594例住院患者HBV标志物总抗-HBc阳性率和单项抗-HBc阳性率进行回顾性统计；对MEIA检测的124例单项抗-HBc阳性和167例HBV标志物全阴性住院患者的抗-HBs水平进行分析；对ELISA筛选的97例流行病学意义的单项抗-HBc阳性血清标本采用含10％小牛血清PBS进行稀释后分别采用ELlSA和MEIA检测抗-HBc并进行比较。结果ELISA检测抗-HBc“流行病学意义”和“临床意义”的总抗-HBc阳性率及单项抗-HBc阳性率分别为72．1％、16．3％和62．6％、7．6％。MEIA检测抗-HBc的总抗-HBc阳性率及单项抗-HBc阳性率分别为78．1％、13．2％；MEIA检测HBV标志物单项抗-HBc阳性组和HBV标志物全阴性组的抗-HBs结果。差异有统计学意义（χ^2=86．9，P〈0．001），ELISA筛选的97例单项抗-HBc阳性标本不同倍数稀释后ELISA和MEIA检测抗-HBc结果提示，未稀释或低倍稀释存在较高的非特异性反应，高倍稀释则存在较高的漏检率。结论不同方法单项抗-HBc阳性率存在一定的差异，单项抗-HBc阳性可作为乙肝病毒感染的证据，但存在一定比例的非特异性反应和假阴性，日常工作中ELISA检测抗-HBc以5～10倍稀释为宜。

基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒X蛋白反式调节基因

目的:乙型肝炎病毒(HBV)基因组编码的HBxAg是一种很强的反式激活(transactivation)病毒蛋白,在正常肝细胞的恶性转化(transformation)以及肝细胞癌(HCC)的形成过程中具有十分重要的作用.为了阐明HBxAg的表达对于肝细胞基因表达谱的影响,我们应用基因芯片技术,对于转染和未转染的HepG2细胞进行了分析.方法:以含有全长乙型肝炎病毒基因的pCP10质粒作为模板,应用聚合酶链反应技术(PCR)扩增的HBxAg基因片段,常规分子生物学技术构建HBxAg的真核表达载体pcDNA3-HBxAg,利用脂质体转染技术转染HepG2细胞,HBxAg蛋白的表达以Western blot杂交技术证实.从转染和非转染细胞HepG2中提取总mRNA,逆转录为cDNA,并进行基因芯片技术分析.结果:经过限制性内切酶分析和序列测定,证实pcDNA3-HBxAg构建正确.HBxAg在HepG2细胞中的表达以Western blot杂交技术得到证实.对于HBxAg重组表达载体和空白载体转染的HepG2细胞的基因表达谱,利用基因芯片技术进行分析.结果表明,16种基因的表达水平上调,58种基因的表达水平下调.这些基因包括细胞生长、细胞凋亡、信号转导等基因,相信这些类型的基因在HBxAg的恶性转化中具有十分重要的作用.结论:HBxAg是一种病毒反式激活蛋白,对于肝细胞基因表达谱有显著影响;基因芯片技术是分析病毒反式激活蛋白反式调节基因表达谱的重要技术途径.

硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白的基因克隆与序列分析

[目的 ]克隆硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白 (amastin)的编码基因序列。 [方法 ]应用核苷酸序列数据库 (GenBank)和表达序列末端片段数据库 (dbEST)的计算机检索与DNA文库的杂交筛选方法。 [结果 ]从dbEST数据库中获得一段 30 9nt的来源于硕大利什曼原虫的基因片段 ,据此设计探针 ,筛选硕大利什曼原虫的DNA文库 ,获得硕大利什曼原虫无鞭毛体蛋白的编码基因。其开放读码框架由 5 5 2个核苷酸组成 ,编码产物由183个氨基酸残基组成。序列分析表明 ,硕大利什曼原虫与锥虫无鞭毛体蛋白一级结构的同源性为 2 3 5 %。 [结论 ]克隆的基因系硕大利什曼原虫表面蛋白编码基因 ,即无鞭毛体蛋白的编码基因。

丙型肝炎病毒核心蛋白可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达

利用分子生物学技术 ,构建表达丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白的人源单链可变区抗体 (ScFv)的原核表达载体 ,并在大肠杆菌JM 10 9中表达可溶性的HCV core ScFv。以重组的HCV核心蛋白为包被抗原 ,利用噬菌体抗体库的表面展示技术 ,筛选到含有HCV core ScFv基因的噬菌体克隆。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒 ,经NcoI/NotI酶切鉴定 ,该ScFv基因由 75 0bp组成。将其亚克隆到 pCANTAB5E表达载体中 ,转化大肠杆菌JM10 9,提取质粒进行DNA序列测定 ,符合ScFv的重链可变区和轻链可变区基因结构特点。IPTG诱导转化的大肠杆菌JM10 9,在其培养上清中获得了可溶性HCV core ScFv的表达。酶联免疫吸附法 (ELISA)证实表达的HCV core ScFv具有重组HCV核心蛋白的反应活性和特异性。对转化的JM10 9大肠杆菌上清中表达的HCV core ScFv进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) ,证实表达的HCV core ScFv的分子量为 2 8kDa。为应用HCV core ScFv进行肝组织免疫组织化学和细胞内免疫基因治疗研究奠定了基础。

丙型肝炎病毒与JAK-STAT信号转导系统

0引言 丙型肝炎病毒(HCV)感染具有显著的慢性化倾向,而且只有部分患者对于干扰素α(IFN α)的治疗有较好的应答.为什么会存在这种情况和差别,这是与HCV-肝细胞之间相互作用的分子生物学机制和基础来决定的[1].

基因表达谱芯片技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白3反式调节靶基因

目的:丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白3(non-structural protein 3,NS3)是由HCV基因组编码的具有多种功能的蛋白质.NS3蛋白的表达对于HCV感染肝细胞的基因表达谱具有显著影响.为了研究NS3蛋白反式调节的靶基因,我们应用基因芯片技术对于pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-NS3分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析.方法:以含有HCV-H全基因组cDNA的质粒pBRTM3011作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS3蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-NS3.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染hepG2细胞之后有NS3蛋白的表达,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有34个基因表达水平显著上调,37个基因表达水平显著下调.结论:HCV的NS3蛋白是一种反式激活因子.NS3基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响.DNA芯片技术是分析反式激活靶基因的有效技术途径.

实验教学示范中心建设中的问题与对策

近年来,教育部加大了对高校实验教学中心建设力度,随之一大批国家级、省级实验教学示范中心应运而生,无疑对改善本科生实验教学环境和提升实验教学水平起到了重要推进作用。但在中心建设过程中,普遍出现重申报轻建设、重硬件轻软件、重投入轻产出、重普遍轻特色等现象。对此,作者提出了"三促进、三配套、三高效和三特色"的有效举措予以探索。

低浓度HBsAg人群HBV DNA与HBV M定量结果的关系及评价

目的:比较高、低浓度HBsAg阳性人群乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)与乙型病毒肝炎标志物(HBVM)含量之间的差异,揭示低浓度HBsAg人群HBV DNA与HBV M之间的特点。方法:对264例慢性HBV感染者的HBsAg浓度(高浓度HBsAg组、低浓度HBsAg组)及自然史(免疫耐受期、免疫清除期、非活动期)进行分组,采用实时荧光聚合酶链反应(PCR)和微粒子酶免疫试验(MEIA)对147例低浓度HBsA组和117例高浓度HBsAg组的血清标本进行HBV DNA和HBV M的定量测定并进行比较。结果:低浓度HBsAg组免疫耐受期7例、免疫清除期4例血清标本HBV DNA、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe之间的差异存在统计学意义(t=2.531～9.181,P<0.01～0.05),非活动期136例血清标本中有94.1%(128/136)HBV DNA处于105copies/L以下,直接法PCR、浓缩法PCR对HBV DNA检出率分别为10.3%(14/136)、10.3%(47/136),且HBV DNA与HBV M各指标之间均不存在相关性(P>0.05);高浓度HBsAg组免疫耐受期25例HBV DNA与HBeAg、抗HBe存在相关性(r=0.744～0.772,tr=3.858～4.207,P<0.01),免疫清除期46例和非活动期46例HBV DNA则仅与抗HBs存在负相关性(r=-0.693～-0.598,tr=-4.616～-3.936,P<0.01～0.05)。结论:低浓度HBsAg人群具有特殊的血清学特点,可能与机体免疫耐受及免疫系统个体化反应有关。

肿瘤抑制因子p21/waf1与肝炎病毒复制与表达的调节研究

0 引言作为一种肿瘤抑制基因,p21/wafl在细胞周期、细胞凋亡、信号转导以及癌变中具有十分重要的调节作用。肝炎病毒,特别是乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的感染,不仅引起急性和慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌(HCC)的发生、发展密切相关。这些肝炎病毒感染靶细胞之后,在细胞内对于细胞正常的调节机制产生严重干扰,这是肝炎病毒致病的分子生物学机制的重要组成部分。其中,肝炎病毒蛋白对于p21/wafl的异常调节具有十分重要的生物学和医学意义。

乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒反式调节靶基因的抑制性消减杂交和基因芯片分析结果的比较

目的:筛选与克隆HBV和HCV蛋白反式调节靶基因,阐明HBV和HCV感染后慢性肝脏疾病的发病机制.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及表达谱基因芯片(cDNAmicroarray)技术筛选并克隆HBV和HCV蛋白反式调节的靶基因.以HBV和HCV蛋白的表达质粒转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.同时进行表达谱基因芯片技术分析.结果:成功构建人HBV和HCV蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库,对HBV和HcV蛋白反式调节的靶基因同时进行基因表达谱芯片的分析.在SSH分析中,文库扩增后均得到200-800bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列.对于不同的肝炎病毒蛋白反式调节的靶基因类型,以及不同的分析技术研究的结果进行比较分析,发现了一系列的共同调节的靶基因,说明不同的肝炎病毒蛋白反式调节具有共同的作用途径.结论:筛选到的反式调节靶基因,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了HBV和HCV蛋白可能存在的调控机制,有助于阐明HBV和HCV蛋白的反式调节在慢性肝脏疾病的发生发展中的作用.