严重烧伤大鼠肝脏葡萄糖转运体1蛋白表达的实验研究

目的 探讨严重烧伤大鼠早期肝脏葡萄糖转运体 1(Glucosetransporter 1,GLUT 1)蛋白及其转录活性的变化和意义。方法 采用 3 0 %TBSAⅢ度烧伤大鼠模型 ,以正常大鼠为参照 ,WesternBlot法检测伤后 0 5、1、2、4、8、16h肝脏总蛋白中GLUT 1的表达 ;体外转染含有大鼠GLUT 1全长调控序列的报告基因构建体A ,2 4h后 ,1%氧浓度诱导表达 ,以 β 半乳糖苷酶为参照 ,分析报告基因表达强度的变化。结果 ①与正常对照相比 ,严重烧伤后 1h大鼠肝脏Glut 1蛋白表达明显增加 (增加约 1 3 2倍 ) (P <0 0 5 ) ,在伤后 4～ 8h变化最为明显 ,约为正常对照的 2倍 (P <0 0 5 ) ,烧伤后 16h ,GLUT 1蛋白含量降低 (P <0 0 5 ) ;②构建体A转染 2 4h后 ,缺氧处理 3h ,报告基因的表达明显升高 ,增高约 3 19倍 (P <0 0 5 ) ,缺氧6h ,报告基因的表达增强 2 2 3倍 ,与 3h相比无明显差异 (P >0 0 5 )。本试验观察期内 ,缺氧处理 12h报告基因的表达强度最大 ,诱导表达倍数约 5 3 4倍 ,与缺氧 3、6h存在显著差异 (P <0 0 1)。结论 ①严重烧伤以后 ,大鼠肝脏的GLUT 1蛋白含量增加。②缺氧诱导了大鼠GLUT 1基因

条件性缺氧诱导因子-1αRNAi转基因小鼠模型的建立

缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是细胞在缺氧等条件下稳定表达的具有转录活性的蛋白,通过与多种靶基因调控区的缺氧反应元件(hypoxia response element,HRE)结合,调控靶基因表达,使机体对缺氧、缺血等病理生理过程产生适应性反应。为从整体动物水平研究HIF-1α的作用,需要建立HIF-1α相关遗传修饰小鼠。分别针对HIF-1αmRNA序列的两个靶位点合成两对互补的寡核苷酸链,构建可诱导的RNA干扰真核表达载体HIF-AB和HIF-CD。分别将CRE重组酶真核表达载体CRE-ER^(T2)与HIF-AB或HIF-CD转染入RAW264.7细胞,筛选得到稳定表达CRE-ER^(T2)与HIF-AB,或CRE-ER^(T2)与HIF-CD的稳定细胞系。在用4-HT诱导去除上述细胞系中HIF-AB或HIF-CD所含的Neo基因后,用CoCl_2诱导HIF-1α表达,采用半定量RT-PCR检测HIF-AB或HIF-CD对HIF-1α基因表达的影响。结果发现干扰载体(HIF-AB和HIF-CD)对HIF-1αmRNA序列的沉默效果分别为85%和72%。选择干扰效率较高的表达载体HIF-AB经显微注射获得HIF-1α基因敲低小鼠模型,经PCR以及测序验证获得2个转基因阳性小鼠(Founders,G_0代)。G_0代雄鼠与FVB/N雌鼠交配后获得2只F_1代(first filial generation)转基因阳性小鼠,经与EIIA-Cre转基因小鼠交配,得到EIIA-Cre;HIFRNAi^(flox/+)小鼠,RT-PCR结果显示,EIIA-Cre;HIFRNAi^(flox/+)小鼠肝、肺、肾等组织的HIF-1αmRNA水平明显降低,分别约为正常对照的44%、38.2%和23.5%。该小鼠模型的建立为进一步研究HIF-1α的功能及作用机制提供了新的手段。

缺氧诱导肝细胞中葡萄糖转运体1表达变化机制的实验研究

目的 探讨缺氧诱导肝细胞中葡萄糖转运体 1(GLUT 1)蛋白表达变化的机制。方法 以含有GLUT 1全长调控序列的表达载体 (构建体A)为模板 ,构建野生型 (构建体N)和突变型 (构建体M )缺氧反应元件 (hypoxiaresponseele ment ,HRE)表达质粒 ,转染体外培养的肝细胞BRL ,与含有全长缺氧诱导因子 1α(HIF 1α)cDNA的质粒p(HA)HIF 1共转染 ,1%氧浓度诱导表达 ,分析报告基因的表达及变化。结果 成功构建了构建体N和构建体M ,转染BRL细胞后 ,缺氧明显诱导了构建体N和构建体M中报告基因的表达 ,与转染空载体的对照相比 ,报告基因的表达分别增加了 7 2倍 (P <0 0 5 )和 3 .1倍 (P <0 0 5 ) ,且两者之间具有明显的差异 (P <0 0 5 )。构建体N与p(HA)HIF 1共转染 ,报告基因的表达增强了 16倍 ,而构建体M与p(HA)HIF 1共转染时 ,与单独转染构建体M相比 ,两者没有显著差异 (P >0 0 5 )。结论 HRE中的HIF 1结合位点在GLUT 1mRNA的缺氧诱导中起重要的作用。

融合蛋白TAT-HIF-1α-PAS-B原核表达载体的构建、表达及纯化

目的构建蛋白转导结构域TAT和人缺氧诱导因子1αPAS-B结构域融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化。方法分别构建原核表达质粒pTAT-PAS-B、pET-PAS-B和pTAT-EGFP;在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内,以IPTG诱导融合蛋白的表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析鉴定,利用镍-亚硝胺乙酸-组氨酸(Ni-NTA-His)亲和层析法对重组蛋白进行纯化。结果成功构建了PAS-B结构域的原核表达载体,经过优化表达和纯化条件,融合蛋白在IPTG诱导下获得特异性表达,纯化得到了高纯度的目的蛋白。结论含人缺氧诱导因子1αPAS-B和TAT结构域融合蛋白的成功表达及纯化,为应用该融合蛋白调控体内HIF-1α的活性奠定了基础。

成熟成骨细胞中敲除基因fgfr1小鼠的制备

目的制备在成熟成骨细胞中敲除基因fgfr1的特定细胞阶段性基因敲除小鼠。方法从美国NIH引进SPF级fgfr1条件性基因敲除(fgfr1flox/flox)小鼠,进行饲养、繁殖和PCR鉴定;fgfr1flox/flox小鼠与在成熟成骨细胞表达Cre重组酶的OC-Cre小鼠交配,获得在成熟成骨细胞中敲除一个基因拷贝的杂合子小鼠;杂合子小鼠之间交配,或者杂合子小鼠与fgfr1flox/flox小鼠交配,可以获得在成熟成骨细胞中敲除fgfr1基因的小鼠fgfr1△/△/OC-CreTG/+。结果成功制备在成熟成骨细胞中敲除fgfr1的细胞特异性敲除小鼠。结论成功引进fgfr1flox/flox小鼠,应用合理的基因条件性敲除繁殖策略,获得在成熟成骨细胞中敲除fgfr1的基因敲除小鼠。

阻断TGF-β/TGF-βRⅠ通路对ATDC5细胞增殖、分化及细胞外基质的影响

目的研究转化生长因子βⅠ型受体(transforming growth factor beta typeⅠreceptor,TGF-βRⅠ)阻断剂SB-505124对软骨细胞增殖、分化及细胞外基质的影响与机制。方法利用Western blot检测不同浓度的SB-505124处理后,前软骨细胞系ATDC5中p-Smad2/3的变化。MTT法检测SB-505124处理对ATDC5细胞生长、增殖的影响及时间、浓度依赖性效应。Western blot检测c-Myc蛋白水平的变化。Real-time PCR检测SB-505124处理后软骨分化、细胞外基质合成及降解相关分子CollagenⅡ、Aggrecan及Adamts5表达与变化,并利用阿尔新蓝染色法检测SB-505124处理对ATDC5细胞中蛋白聚糖合成的影响。结果 Western blot检测结果示:SB-505124处理ATDC5细胞明显抑制TGF-β1激活的p-Smad2/3,并呈浓度依赖性;MTT检测结果示:SB-505124浓度和时间依赖性的抑制ATDC5细胞增殖;Real-time PCR检测结果示:SB-505124处理明显抑制ATDC5细胞中CollagenⅡ、Aggrecan的表达,同时上调了Adamts5的表达;阿尔新蓝染色结果提示SB-505124处理明显抑制ATDC5细胞中蛋白聚糖的合成。结论利用SB-505124阻断内源性TGF-β信号,可抑制软骨细胞增殖、分化及细胞外基质的合成,同时促进细胞外基质的降解。

脓毒症模型大鼠循环内皮细胞与肝功能状态间关系的相关性研究

目的探讨大鼠脓毒症中循环内皮细胞(circulating endothelial cells,CEC)数量的变化及其与肝功能改变的关系。方法利用盲肠结扎穿孔模型(CLP)在大鼠制作脓毒症模型。观察CEC数量、白细胞数量的变化、以及肝组织病理组织学、血天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的改变。并探讨CEC数量与AST和ALT的相关关系。结果CLP6h后动物肝细胞明显肿胀,24h组肝细胞大量空泡变性,乃至坏死。CLP3h组白细胞和CEC数量比对照组明显升高。而CLP6h后AST、ALT才出现明显增高。CEC数量与AST和ALT水平呈负相关,Pearson相关系数(r)分别为-0·774和-0.734(P<0·01)。用非线性回归分析CEC数量与AST和ALT的关系,发现CEC数量对ALT的最佳拟合曲线为幂函数(P<0·05),其方程为ALT=33.052681+24.097309CEC-1。CEC数量对AST的最佳拟合曲线为对数函数,但无统计学意义(P=0.607)。结论在大鼠脓毒症模型中,比起常规肝功能指标,CEC数量更能敏感反映肝脏病理进程。当肝功能指标高于正常阈值时肝细胞已经出现了显著损伤。因此,早期监测CEC数量结合已有的肝功能指标有助于早期提示肝功能损害,及时针对治疗。

HIF-1α条件性基因敲除嵌合体小鼠的获得

目的应用Cre/loxP系统建立HIF-1α条件性基因敲除小鼠模型。方法电击法将构建好的HIF-1α条件性基因敲除载体转染入小鼠ES细胞,用G418与Ganciclovir对转染的ES细胞进行正负筛选,经Southern杂交鉴定得到阳性ES细胞克隆后,将已发生正确重组的ES细胞显微注射入小鼠囊胚腔,对子代鼠进行基因型鉴定。结果经G418与Gan-ciclovir筛选培养得到490个阳性克隆,用5′端探针进行Southern杂交鉴定获得1株发生同源重组的ES细胞克隆,经显微注射,得到5只由基因敲除ES细胞和供体囊胚细胞共同发育而来的嵌合体小鼠。结论成功得到基于Cre/loxP系统的HIF-1α条件性基因敲除嵌合体小鼠模型。

维生素D信号通路在骨骼稳态维持中的作用

维生素D作为一种重要的类固醇激素在骨骼发育和稳态维持中发挥重要作用。机体从外界获取的维生素D需在体内经过2次羟化转变为活性1,25-二羟基维生素D3,然后与维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)结合后发挥生物学作用。传统观点认为1,25-二羟基维生素D3在体内主要通过内分泌途径作用于肠道和肾脏,通过调节钙磷吸收和重吸收维持矿物质稳态,并因此间接调节骨骼稳态。近年发现1,25-二羟基维生素D3能直接作用于成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞等,通过调节其增殖、分化直接调节骨形成与骨吸收,维持骨稳态的平衡。

高效稳定表达人缺氧诱导因子抑制因子肠上皮细胞株的建立

目的通过转染含有人FIH全长cDNA的质粒pcDNA3.1-V5-His-A-FIH,建立FIH高效表达的肠上皮细胞株。方法对pcDNA3.1-V5-His-A-FIH进行扩增、提取,用脂质体Lipofectamine 2000将pcDNA3.1-V5-His-A-FIH转入Caco-2细胞,经G418筛选并逐步传代,RT-PCR和Western blot法检测阳性细胞克隆FIH mRNA和蛋白表达。结果转染pcDNA3.1-V5-His-A-FIH后Caco-2细胞FIH mRNA是普通Caco-2细胞的1.98倍,而FIH蛋白含量是普通Caco-2细胞的1.70倍。结论成功建立了高效、稳定表达人FIH基因的肠上皮细胞株。

小鼠胚胎瘤来源细胞系ATDC5的体外软骨分化诱导研究

目的在体外建立稳定有效的软骨细胞分化模型。方法复苏ATDC5细胞,在倒置显微镜下观察细胞形态及其生长情况,细胞90%融合时分别用不含Vc和含Vc的诱导培养基培养进行分化诱导。诱导21 d,阿力新蓝染色,RT-PCR检测Ⅱ、Ⅹ型胶原表达进行鉴定。结果含50μg/mL Vc的诱导培养基诱导1周便可见明显的软骨小结,细胞产生软骨基质明显增多,Ⅱ及Ⅹ型胶原表达明显增高,且Ⅹ型胶原表达呈提前。结论利用ATDC5细胞系可成功建立软骨细胞分化体外模型。

αv整合素沉默对结肠癌多细胞球药物敏感性的影响

目的应用反转录病毒介导的shRNA沉默αv整合素,探讨后者在结肠癌多细胞球(MCSs)对奥沙利铂耐药中的作用。方法构建针对αv整合素的反转录病毒质粒,脂质体转染质粒至结肠癌细胞株HT29。采用改良liquid overlay技术培养MCSs;Western blotting检测MCSs中αv整合素蛋白的表达;Cell Counting Kit-8检测梯度浓度(0、5、50、500、5 000μg/L)的奥沙利铂处理后MCSs的存活率。结果测序证实质粒构建成功。Western blotting结果显示反转录病毒质粒介导的shRNA能有效、特异、稳定地沉默αv整合素基因。沉默αv整合素基因后,MCSs对奥沙利铂的药物敏感性显著增加。奥沙利铂50、500μg/L处理48h后,MCSs的存活率为0.86%±0.05%和0.43%±0.04%,转染反转录病毒的MCSs则下降为0.77%±0.06%和0.30%±0.04%(P<0.05)。结论反转录病毒介导的shRNA能有效沉默αv整合素基因。沉默αv整合素能有效提高结肠癌MCSs对化疗药物奥沙利铂的敏感性。

大剂量1,25二羟维生素D_3对发育期小鼠骨稳态的影响

目的观察大剂量1,25二羟维生素D3[1,25(OH)2D3]对小鼠发育期骨稳态的影响。方法怀孕13.5 d的C3h小鼠分成3组,每日分别经腹腔注射1%的乙醇溶液(对照组),0.5 ng/g的1,25(OH)2D3(低剂量组)和5 ng/g的1,25(OH)2D3(大剂量组),持续至孕鼠分娩。新生小鼠从第3天开始隔天注射相同剂量的1,25(OH)2D3,连续1个月。观察小鼠出生以及身长、体质量等生长变化情况;1月龄的小鼠分别行X线检查、Micro-CT扫描,胫骨组织石蜡包埋、切片后经HE、藏红固绿染色,行组织学、骨形态计量分析,观察不同分组发育期小鼠骨骼结构及骨代谢的变化情况。结果从E13.5 d开始注射不同剂量的1,25(OH)2D3对孕鼠怀孕过程和小鼠出生没有明显的影响,出生后第7天开始,大剂量组小鼠身长、体质量明显低于对照组(P<0.05),1月龄时,差异增大,大剂量组身长、体质量显著低于对照组和小剂量组(P<0.01);X线检测显示1月龄大剂量组小鼠发生病理性骨折(n=10),其余2组未发现;Micro-CT结果提示大剂量组小鼠骨量较对照组显著降低(P<0.01),低剂量组小鼠仅骨皮质厚度有所增加(P<0.05);胫骨组织切片形态计量分析显示大剂量组小鼠破骨细胞数量较其余2组显著增加(P<0.01),而低剂量组破骨细胞数量的增加差异无统计学意义;低剂量组成骨细胞数量较其余2组有明显增加(P<0.05)。结论大剂量1,25(OH)2D3显著降低C3h小鼠骨量,同时使骨皮质菲薄,骨骼质量变差,从而易骨折。这种作用主要是通过促进破骨细胞的形成实现的。

构建FGFR3基因沉默慢病毒载体及其对ATDC5细胞增殖和分化的影响

目的通过构建慢病毒介导的FGFR3RNAi,观察FGFR3对小鼠前软骨细胞系ATDC5增殖和分化的影响。方法针对FGFR3基因的有效靶序构建FGFR3RNAi慢病毒载体,并转染293T细胞进行病毒包装。用包装成功的慢病毒转染ATDC5细胞,Real-time PCR和Western blot检测ATDC5中FGFR3RNAi效率,细胞计数及MTT检测ATDC5的增殖变化,Real-time PCR检测ATDC5中软骨分化相关分子Ⅱ型胶原(collagenⅡ,ColⅡ)、Ⅹ型胶原(collagenⅩ,ColⅩ)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)的表达与变化。结果FGFR3RNAi慢病毒载体构建成功,并包装出相应的慢病毒,滴度为5×108TU/mL。FGFR3RNAi慢病毒转染ATDC5后FGFR3mRNA水平分别较空白组和阴性对照(NC)组下降了65.2%和68.8%(P<0.01)。Western blot结果显示,与空白组和NC组相比,FGFR3RNAi组FGFR3蛋白水平显著降低(P<0.01)。细胞计数及MTT检测结果显示,FGFR3RNAi组细胞增殖能力较空白组和NC组增强(P<0.05,P<0.01)。Real-time PCR结果显示,经向软骨诱导分化后,FGFR3RNAi组细胞中ColⅡ、ColⅩ和MMP-13的表达水平较空白组和NC组显著增加(P<0.01)。结论成功包装的FGFR3RNAi慢病毒能有效降低ATDC5细胞中FGFR3基因的表达。FGFR3表达水平降低后对ATDC5细胞增殖和分化的抑制作用明显减弱。

软骨细胞条件性敲除PTEN基因的FGFR3功能增强型点突变小鼠的获得及其表型初步分析

目的获得在软骨细胞中条件性敲除PTEN基因的FGFR3增强型点突变小鼠并进行初步表型分析。方法通过PTEN条件性基因敲除小鼠（Pten^flox/flox小鼠），与软骨细胞特异表达Cre重组酶的小鼠（Col2αCre）交配，获得在软骨细胞中特异敲除PTEN基因小鼠（Co12αCre：Pten^flox/flox）；同时，利用Pten^flox/flox小鼠与FGFR3增强型点突变小鼠（Fgfr3^G369C/小鼠，即ACH小鼠）交配，子代杂合子小鼠（Pten^flox/＋：ACH）之间再交配，获得Pten^flox/flox：ACH小鼠；通过Col2αCre：Pten^flox/flox和Pten^flox/flox：ACH交配即可获得在软骨细胞中特异性敲除PTEN基因的FGFR3增强型点突变小鼠（Col2αCre：Pten^flox/flox：ACH）。采用PCR对小鼠基因型进行鉴定，免疫荧光染色检测PTEN基因的敲除效率，通过X光平片摄影对小鼠的表型进行初步分析。结果获得了在软骨细胞中敲除PTEN的FGFR3点突变小鼠，免疫荧光染色证实Col2αCre：Pten^flox/flox：ACH小鼠软骨细胞中PTEN蛋白因为基因敲除而表达很低。初步的表型分析显示：Col2αCre：Pten^flox/flox：ACH小鼠身长、尾长均较Pten^flox/flox：ACH小鼠长（P〈0．05，n=5）。Col2αCre：Pten^flox/flox：ACH小鼠表型，较Pten^flox/flox：ACH小鼠的侏儒表型有所缓解。结论采用基于Cre／LoxP系统的条件性基因敲除策略，获得了在软骨细胞中敲除PTEN基因的FGFR3增强型突变小鼠，表型分析初步显示，软骨细胞特异性敲除PTEN基因可部分缓解由FGFR3增强型点突变所导致的小鼠侏儒表型。该小鼠的获得，为研究P13K／AKT信号通路在FGFR3突变介导的软骨生长抑制中的作用提供了实验动物平台。

从小鼠17.5d胚胎cDNA文库中筛选Bax相互作用蛋白

为了研究Bax可能形成的在细胞凋亡中起作用的蛋白复合体,选择Bcl-2家族中的前凋亡因子Bax作为诱饵蛋白,对17.5 d小鼠cDNA文库进行酵母双杂交筛选和BLAST,找到1个RACK1蛋白。为进一步验证上述酵母中Bax与RACK1的结合,用Bax与RACK1的真核表达载体,以免疫共沉淀和免疫荧光染色验证其相互作用。利用293T细胞过量表达Bax和RACK1蛋白,收获裂解液后进行免疫共沉淀试验,结果表明,Bax和RACK1在体内仍可形成复合体;在293T细胞中共转Bax和RACK1质粒,用各自荧光抗体标记,然后用激光共聚焦显微镜观察,发现Bax和RACK1可以共定位。

泛醇-谷氨酰胺对烧伤大鼠肠道的影响及其量效关系

目的研究泛醇与谷氨酰胺对烧伤大鼠肠道损伤和运动功能的影响及其量效关系。方法（1）拆方实验。将90只SD大鼠按随机数字表法分为A—I组，每组lO只。将各组大鼠制成30％TBSAⅢ度烧伤模型，伤后4h开始灌胃泛醇和谷氨酰胺，剂量分别为1．00、4，0．50、4，0．25、4，1．00、2，0．50、2，0．25、2，1．00、I，0．50、I，0．25、lg·kg-1·d-1，每日剂量分2次灌胃，连续7d。停药当天采集大鼠血液及肠道组织，观测肠道推进指数、血清二胺氧化酶（DAO）活性、全血乙酰胆碱含量、肠黏膜蛋白含量，筛选泛醇和谷氨酰胺最佳配比。（2）药效学实验。将70只SD大鼠按照随机数字表法分为正常对照组（不进行任何处理）、烧伤组、烧伤＋泛醇组、烧伤＋谷氨酰胺组、烧伤＋低剂量泛醇．谷氨酰胺（简称“泛谷”）组、烧伤＋中剂量泛谷组、烧伤＋高剂量泛谷组，每组10只。将后6组大鼠按上述模型致伤，伤后4h开始灌胃药物，烧伤＋泛醇组给予泛醇1．00g·kg-1·d-1；烧伤＋谷氨酰胺组给予谷氨酰胺4g·kg-1·d-1；烧伤＋低、中、高剂量泛谷组给予泛醇和谷氨酰胺，剂量分别为0．50、2，1．00、4，2．00、8g·kg-1·d-1，每日剂量分2次灌胃，连续7d。检测指标及时问同拆方实验，另外增加各烧伤组大鼠肠道病理学观察；正常对照组行相同检测。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析及Fisher确切概率法检验，两两比较行LSD检验。结果（1）A、B组大鼠肠道推进指数、肠黏膜蛋白含量相近（P值均大于0．05），显著高于其余7组（P值均小于0．01）；A组大鼠乙酰胆碱含量显著高于其余8组（P值均小于0．01）；A、D、E组大鼠DAO活性相近（P值均大于0．05），低于其余6组（P值均小于0．01）。泛醇与谷氨酰胺最佳配比剂量为1．00、4g·kg-1·d-1。（2）与正常对照组比较，烧伤组大鼠肠道推进指数、乙酰胆碱和肠黏膜蛋白含量明显降低，DAO含量明显增高（P值均小于0．01）；烧伤＋泛醇组大鼠肠道推进指数明显降低（P〈0．01）；烧伤＋谷氨酰胺组大鼠肠道推进指数、乙酰胆碱含量明显降低（P值均小于0．01）；烧伤＋低剂量泛谷组大鼠肠道推进指数明显降低（P〈0．01）；烧伤＋中、高剂量泛谷组大鼠4项指标水平未见明显改变（P值均大于0．05）。与烧伤组[0．50±0．07、（69±10）IXg／mL、（26±l】）汕g／g、（0．672±0．145）U／mL]比较，烧伤＋泛醇组大鼠乙酰胆碱和肠黏膜蛋白含量显著升高，DAO活性显著降低（P值均小于0．01）；烧伤＋谷氨酰胺组肠黏膜蛋白含量显著升高，DAO活性显著降低（P值均小于0．01）；烧伤＋低剂量泛谷组乙酰胆碱、肠黏膜蛋白含量升高（P值均小于0．01）；烧伤＋中、高剂量泛谷组肠道推进指数、乙酰胆碱和肠黏膜蛋白含量升高，DAO活性降低[0．66±0．07、0．68±0．05，（163±24）、（168±15）μg／mL，（57±7）、（57±7）μg／g，（0．203±0．070）、（0．193±0．068）U／mL，P值均小于0．01]。烧伤＋中、高剂量泛谷组4项指标水平相近或相同（P值均大于0．05）。与烧伤组比较，烧伤＋泛醇组绒毛排列紊乱鼠数显著减少（P〈0．05）；烧伤＋谷氨酰胺组绒毛高度下降、排列紊乱和中性粒细胞浸润鼠数明显减少（P值均小于0．05）；烧伤＋低剂量泛谷组绒毛高度下降、排列紊乱及细胞变性坏死和中性粒细胞浸润鼠数显著减少（P值均小于0．05）；烧伤＋中、高剂量泛谷组绒毛高度下降、数量减少、排列紊乱及细胞变性坏死和中性粒细胞浸润鼠数显著减少（P值均小于0．05）。烧伤＋中、高剂量泛谷组各项指标鼠数接近（P值均大于0．05）。结论联合应用泛醇与谷氨酰胺能明显减轻烧伤大鼠肠黏膜损伤并促进胃肠运动，疗效优于单一用药，二者最佳配比剂量为1．00、4g·kg-1·d-1。

谷氨酰胺联合泛醇对烧伤家犬肠道损伤的影响及机制研究

目的观察应用谷氨酰胺、泛醇及其复方制剂对减轻烧伤家犬肠道损伤的疗效并探讨其机制。方法采用30%体表面积Ⅲ度烧伤家犬模型,动物随机分为正常对照、烧伤对照、泛醇、谷氨酰胺、泛醇+谷氨酰胺5个组,每组6只家犬,观察伤后7d各组动物肠道损伤和修复指标。结果烧伤家犬乙酰胆碱、肠黏膜蛋白含量明显降低,血浆二胺氯化酶(DAO)含量和损伤指数则明显增高(P<0.05),给予谷氨酰胺、泛醇以及复方药物均可明减轻烧伤后肠道损伤,降低血浆DAO活性和黏膜损伤指数(P<0.05);给予泛醇则能明显增加乙酰胆碱合成。与单方组相比,复方制剂组上述各项指标均明显优于单方组。结论烧伤后肠道损伤明显,给予谷氨酰胺能明显减轻肠道损伤,给予泛醇能明显促进乙酰胆碱合成,促进胃肠运动,复方制剂疗效明显优于单方。

胰高血糖素样多肽2受体上调表达的Caco2细胞株克隆转染与筛选鉴定

目的建立胰高血糖素样多肽2受体(glucagon like peptide-2 receptor,GLP-2R)上调表达的Caco2细胞株。为研究GLP-2肠道保护机制构建体外模型。方法常规扩增抽提GLP-2R／pcDNA 3．1质粒,经酶切、测序鉴定正确后,用脂质体转染法将其转染至Caco2细胞。G418抗性筛选,挑选耐药细胞克隆培养获得稳定细胞株。以HER293细胞、VE细胞、正常Caco2细胞及正常人小肠组织为对照,采用逆转录聚合酶链反应与蛋白质印迹法检测稳定转染细胞中mRNA及其蛋白的表达。结果扩增抽提GLP-2R／pcDNA 3．1质粒后经酶切、测序结果正确。GLP-2R mRNA及其蛋白在HER293细胞及VE细胞中无表达,在正常Caco2细胞中表达微弱,在人小肠组织中有较强表达;转染CLP-2R后,Caco2／GLP-2R(+)细胞中GLP-2R mRNA及其蛋白表达明显增强。结论GLP-2R分布具有相对特异性,正常Caco2细胞中GLP-2R表达较弱;构建的Caco2／GLP-2R(+)细胞模型成立,为深入研究GLP-2的作用机制奠定了良好基础。