低能离子注入诱变法选育新硫肽类抗生素166A高产菌株

目的为进一步提高产量,以小单孢菌Micromonospora sp.TMD166-MU1为出发菌株,采用低能离子注入技术,研究不同离子注入参数对菌株存活率、正负突变率的影响,通过突变株抑菌活性变势参数分析,初步探讨N+离子注入对166A生产菌所产生的诱变效果,并结合卡那霉素抗性筛选及牛津杯固体发酵高通量筛选,获得高产菌株。方法利用低能N+离子注入技术对出发菌株TMD166-MU1的孢子进行辐照诱变,以卡那霉素耐受性为选择压力,不同诱变条件处理的菌悬液涂布在含有卡那霉素培养基平板上培养后获得单菌落,并以牛津杯固体发酵高通量筛选方法进行高产菌株初筛,之后对高产菌株进行摇瓶复筛,利用高效液相法检测突变株摇瓶发酵的化学效价。结果通过研究30和60 keV能量下不同注入剂量与小单孢菌正突变率的生物学效应关系,确定了在注入能量为30 keV、注入剂量4×10^(13)ions/cm^(2)、卡那霉素抗性筛选浓度为6 mg/L条件下,可获得最高达36.33%的正突变率。复筛效价是出发菌株1.5倍以上的有4株,其中突变株IK-3的166A产量是菌株TMD166-MU1的1.8倍。结论采用低能N+离子注入诱变方式,再结合抗生素抗性筛选及牛津杯固体发酵高通量筛选的集成方法能简单、高效地获得166A高产突变菌株。

新一代必特螺旋霉素基因工程菌的微波诱变

本文探讨微波诱变对新一代必特螺旋霉素基因工程菌的育种效果。以经紫外诱变筛选的新一代必特螺旋霉素产生菌Streptomyces spiramyceticusNBT-U149为出发菌株进行微波诱变筛选。辐射分四种方式:培养皿加盖冷却;加盖不冷却;不加盖冷却;不加盖不冷却,辐射时间分别为10、20、30、40、50、60、80、100和120 s。每次辐射5 s后,冰上快速冷却20 s再照射,并将照射时间累计。以不同的辐射时间设定为不同的微波处理剂量,计算致死率。结果表明,必特菌株对微波敏感,微波辐射60 s时致死率达到92.55%。微波诱变在以脉冲频率为2450MHz的800W家用微波炉条件下,其最佳作用方式为培养皿不加盖、冰上快速冷却,最佳辐射时间为50 s。初筛摇瓶正突变率达到57.14%,复筛摇瓶发酵效价是出发菌株1.6倍以上的有10株,占初筛菌株的2%。最终筛选得到突变株Streptomyces spiramyceticusNBT-UM22,其必特螺旋霉素发酵产量是出发菌株的1.87倍,且组分比例无明显变化。

必特螺旋霉素基因工程菌发酵参数的研究

曾利用同源重组技术构建了稳定的必特螺旋霉素基因工程菌。本研究在30L全自动发酵罐从菌体生长,糖、氮源利用及发酵效价增长情况考察了必特螺旋霉素基因工程菌的发酵过程,研究了发酵过程摄氧率(OUR)、二氧化碳释放率(CER)、溶解氧(DO)等在线参数的变化,着重研究了不同溶氧水平对必特螺旋霉素发酵的影响。结果表明溶氧水平尤其是发酵前期溶氧水平对必特螺旋霉素发酵影响至关重要,前期临界氧浓度应控制在25%左右。本研究为必特螺旋霉素发酵放大工艺研究提供了依据。

响应面法优化必特螺旋霉素发酵培养基

目的利用响应面法对新一代必特螺旋霉素基因工程菌(Streptomyces spiramyceticus,WSJ-2),即含有整合型双拷贝4″位异戊酰基转移酶基因(4″-isovaleryltrasferase gene,ist)工程菌发酵培养基进行优化。方法以发酵效价和异戊酰螺旋霉素组分含量为指标,通过部分因子析因设计实验,筛选出影响较大的主要影响因子。其次,进行最陡爬坡实验,最后,通过中心组合设计,利用DX7trail 7.0软件进行回归分析,确定主要影响因子的最佳浓度,得到优化发酵培养基。结果综合培养基组成对发酵效价和组分含量的影响获得2个主要影响因子,即KH2PO4和NaCl,通过最陡爬坡实验和响应面法,确定了优化发酵培养基组成为(g.L-1):淀粉60、碳酸钙7.0、MgSO42.0、NH4NO36.0、酵母粉3.0、鱼粉15、MnCl20.10、NaCl 12.5、KH2PO40.645。验证实验表明在优化培养基中发酵相对效价为142%与预测值139%比较接近,效价比原配方提高了42%,而其总异戊酰基螺旋霉素组分的含量与原配方基本一致。结论对新构建的必特螺旋霉素基因工程菌采用响应面中心组合设计,可以较有效地进行发酵培养基的优化。

提高可利霉素药代动力学研究中微生物法检测灵敏度的研究

目的研究影响可利霉素微生物法检测敏感度的因素,以提高血浆中测定可利霉素的灵敏度,为药代动力学研究中血药浓度的测定奠定基础。方法采用管碟法和纸片法,以抑菌圈大小为指标,考察检定菌液浓度,培养基配方,单、双层培养基检定平板,缓冲液加NaCl,胎牛血清,血浆等多种因素对检测灵敏度的影响;采用有机溶剂从人血浆中萃取可利霉素等方法测定血药浓度。结果检定菌浓度、培养基配方、检定平板厚度对检测灵敏度影响显著,含NaCl的缓冲液有利于提高检测灵敏度,人血浆对检测灵敏度有一定影响。以藤黄八叠球菌作检定菌,其菌浓为OD600=0.3~1.0,采用含牛肉蛋白胨0.5%,牛肉浸膏0.25%检定培养基制备单层检定平板,可以有效提高可利霉素检测灵敏度6倍;从血浆中萃取可利霉素,用纸片法进行测定,其最低检测限度可达0.02μg/ml。结论所建立的从血浆中萃取可利霉素的纸片法显著提高了微生物法检测血浆中可利霉素的灵敏度,可用于可利霉素药代动力学研究中血药浓度的微生物法检测。

生技霉素稳定型基因工程菌的构建

运用同源重组技术将异戊酰基转移酶基因整合至螺旋霉素产生菌（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓＦ２１）的染色体上，构建了稳定的生技霉素基因工程菌。在不加压的情况下传代，菌种携带选择性遗传标记情况、生长、发酵效价及发酵产物的ＴＬＣ分析均表明此基因工程菌有较好的遗传稳定性，且发酵效价及产物的组分均得到改善。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明外源基因在螺旋霉素产生菌染色体上的整合情况。

螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因的删除和主要产生螺旋霉素组分Ⅰ菌株的获得

螺旋霉素(SP)为16元环大环内酯类抗生素,含有螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ个组分,其结构的差异为16元内酯环的C3上分别连接羟基(SPⅠ)、乙酰基(SPⅡ)和丙酰基(SPⅢ);SPⅡ和SPⅢ是在相同的3-O-酰基转移酶催化下SPⅠ进一步酰化的产物。SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ在生物学活性方面无大差异。为简化螺旋霉素组分,便于今后对其结构进行进一步改造,根据碳霉素和麦迪霉素生物合成中的3-O-酰基转移酶序列,设计了简并性PCR引物,并采用SON-PCR(single oligonucleotide nested PCR)方法,从螺旋霉素产生菌S.spiramyceticus F21中进行特异性扩增,获得了螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因(sspA)及其侧翼序列,共约4.3kb(其中的3457nt DNA序列已被Genbank收录,DQ642742)。采用DNA同源双交换技术对S.spiramyceticus F21中的sspA进行了删除。对螺旋霉素原株和sspA缺失变株进行发酵产物提取和HPLC分析表明:原株中SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ的相对含量分别为7.8%、67%和25%,变株中则分别为72%、18%和9.6%;变株主要组分为SPⅠ。螺旋霉素sspA缺失变株的获得为螺旋霉素组分简化及其衍生物的结构改造奠定了基础。

必特霉素基因工程菌航天育种的研究

探讨航天技术对必特霉素基因工程菌的育种效果。我国返回式搭载卫星对基因工程必特霉素菌种进行了航天育种，共搭载4个菌株以沙土、甘油、斜面等不同方式，经受航天环境条件处理后计算其孢子存活率、营养缺陷型出现率及菌株的发酵效价。在本实验条件下菌株的存活率均很低，尤其是沙土方式的致死率为100％，甘油及斜面孢子的致死率分别为99．79％～100％和99．81％～100％。营养缺陷型出现率为1．65％。存活菌株的负突变率高于正突变率。经筛选从408株正突变株获得了发酵效价提高11．3％～14．5％的菌株。航天技术有可能应用于基因工程必特霉素的育种，但适于其育种的空间条件必须经过详尽而细致的研究和控制。

海洋链霉菌7-145中洋橄榄叶素衍生物的分离鉴定

目的分离鉴定海洋链霉菌Streptomyces sp．7-145产生的抗耐药菌活性成分。方法通过活性追踪，利用大孔吸附树脂、凝胶、正反相色谱等多种色谱技术分离纯化活性成分；通过紫外光谱、质谱、核磁共振谱等波谱学方法鉴定其结构。利用琼脂稀释法和微量肉汤稀释法分别测定所得化合物的抗耐药菌和抗结核活性，利用MTT法评价其细胞毒性。结果从中分离鉴定了4个活性化合物，其结构分别确定为洋橄榄叶素（1）、11-O-甲基洋橄榄叶素（2）、11，11’-O-二甲基洋橄榄叶素（3）、14’-去乙基-14＇-甲基洋橄榄叶素（4）。化合物1～4对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌（MRSA）和万古霉素耐药的肠球菌（VRE）等革兰阳性耐药菌具有较强的抗菌活性，最低抑菌浓度（MIC）为1～16μg／mL；所有化合物对结核分枝杆菌H37Rv株显示出显著的抑制活性（MIC：0．5～4μg／mL），其中化合物1对结核分枝杆菌多重耐药（MDR）、广泛耐药（XDR）等耐药株也表现出较强的抑制活性（MIC：0．5～1μg／mL）；1和2对人肝细胞（L02）、肾上皮细胞（293T）和乳腺癌细胞（MCF-7）具有较强的细胞毒活性，IC50值200．14～0．28μmol／L。结论化合物1～4具有较强的体外抗MRSA、VRE等耐药菌活性。首次发现洋橄榄叶素（1）具有体外抗结核分枝杆菌标准株、多重耐药以及广泛耐药株活性。化合物1和2对人正常肝、肾上皮细胞具有细胞毒性。

麦迪霉素3-O-酰基转移酶在螺旋霉素链霉菌F21中的酰化特性

螺旋霉素(SP)与麦迪霉素(MD)均为16元大环内酯类抗生素,并且结构非常相似。螺旋霉素含有3个组分,其结构差异表现在16元内酯环C3上的一个取代基的差异,SPI组分为羟基、SPII组分羟基乙酰化、SPIII组分羟基丙酰化;麦迪霉素是以麦迪霉素A1为主要组分的多组分抗生素,麦迪霉素16元内酯环C3上连接的均为丙酰化羟基。已知这类抗生素16元内酯环C3羟基酰化是由一种称为3-O-酰基转移酶的蛋白催化完成。本研究将螺旋霉素产生菌—Streptomyces spiramyceticus F21中的螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因用Streptomyces mycarofaciens ATCC 21454中的麦迪霉素3-O-酰基转移酶基因原位替换后,发现所产生的螺旋霉素仍然含有3个组分,并且螺旋霉素III组分也不是主要组分,说明麦迪霉素3-O-酰基转移酶在螺旋霉素产生菌—S.spiramyceticus F21中不具有16元内酯环C3羟基丙酰化特异性以及酰化高效性,也提示其在麦迪霉素产生菌中的丙酰化特异性和高效性可能与该菌株(种)的特性有关。

螺旋链霉菌U-1941中PKSII型基因在淡青链霉菌tcmK变异株中的克隆(I)

利用螺旋霉素产生菌螺旋链霉菌(S trep tomy ces sp iramy ceticus U-1941)中发现的PK S II型基因,经测序和同源性比较证明在4174bp片段中含有PK S II型K S(K Sα)基因,该基因(pCG 4-K,aspA)由1229bp组成编码432个氨基酸,与产二素链霉菌A lpA和淡青链霉菌T cmK同源性分别为74.4%和69.7%。将含aspA基因的重组质粒pCG 4在四并菌素(tetracenom yc in C)产生菌(S.g laucescens GLA 4-26)tcmK基因缺陷型变异株中进行克隆,TLC分析表明转化子的发酵产物比对照株多一个明显的黄色斑点,该物质经分离、提纯后分析确定为一个含苯式结构的小分子化合物A S-5。

利用强启动子PermE^＊提高4＂-异戊酰基转移酶基因在变铅青链霉菌TK24中对螺旋霉素的4＂-异戊酰化水平

目的提高螺旋霉素生物转化为4"-异戊酰螺旋霉素的水平,为构建以4"-异戊酰螺旋霉素为主要组分的必特螺旋霉素新一代基因工程菌提供指导。方法构建重组质粒pKC1139-e-ist-ist和pKC1139-ist-ist,它们分别含有5'-上游插入红霉素抗性基因强启动子PermE*的4"-异戊酰基转移酶基因串连双拷贝,和4"-异戊酰基转移酶基因串连双拷贝;将它们分别导入到变铅青链霉菌TK24中,比较它们对螺旋霉素的4"-异戊酰化能力。结果在加入终浓度为50μg/mL螺旋霉素时,变铅青链霉菌TK24[pKC1139-e-ist-ist]比变铅青链霉菌TK24[pKC1139-ist-ist]对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平提高近4倍。结论在变铅青链霉菌TK24中,PermE*可以增强4"-异戊酰基转移酶基因表达,明显提高对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平。

常压室温等离子体-紫外复合诱变选育新硫肽类抗生素166A高产菌株

目的通过对新硫肽类抗生素166A产生菌小单孢菌TMD166进行诱变选育研究,以期获得产166A的高产菌株。方法使用多功能等离子体诱变系统(multifunctional plasma mutagenesis system,MPMS)对出发菌株TMD166的孢子进行等离子体-紫外(MPMS-UV)复合诱变,单孢子悬液经照射处理、涂布培养后获得单菌落,并以牛津杯固体发酵高通量筛选方法对菌株进行初筛,之后对高产菌株进行摇瓶复筛,利用突变株摇瓶发酵的化学效价筛选出正突变菌株。结果对比MPMS-UV不同诱变剂量发现,MPMS105s-UV60s复合诱变剂量获得的正突变率最高,达到41.43%,相应致死率为99.88%。最终筛选出一株166A高产突变株TMD166-MU1,在培养温度为28℃、210 r/min的条件下,经过96~120 h培养后,166A产量相比出发菌株提高了7.47倍。结论采用MPMS-UV复合诱变方式,再结合牛津杯固体发酵高通量筛选方法和摇瓶复筛,可高效筛选获得166A高产菌株。

硫霉素产生菌卡特利链霉菌A520基因文库的构建

以大肠杆菌／链霉菌穿梭柯斯质粒ｐＫＣ５０５为载体，构建了卡特利链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｔｌｅｙａ）Ａ５２０在大肠杆菌ＤＨ１的基因文库，重组质粒插入外源片段的概率在９５％以上，插入外源片段的大小为２０～３０ｋｂ。以链霉菌染色体分子量为１０４ｋｂ计算，由４０００个转化子构成的基因文库可以概括卡特利链霉菌Ａ５２０约９９％的基因组。用已经克隆的硫霉素环化酶基因上游的１．５ｋｂＤＮＡ片段作为探针杂交，从基因文库得到３２个阳性克隆。用利波曼链霉菌（Ｓ．ｌｉｐｍａｎｉ）中的ＩＰＮＳ基因作为探针杂交，从基因文库得到１个阳性克隆ｐＫＷ２０１／ＤＨ１，并为Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交进一步证实杂交片段在ＢａｍＨⅠ２．７ｋｂ片段上。用来自带小棒链霉菌（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）的克拉维酸生物合成途径中的环化酶基因ｃｓ２作为探针杂交进行筛选，得到１个阳性克隆ｐＫＷ３０１／ＤＨ１，说明所构建的基因文库比较完整。

螺旋霉素生物合成基因簇中N,N-二甲基转移酶基因功能的鉴定

目的 确定螺旋霉素(SP)生物合成途径中编码两个N, N-二甲基转移酶的基因bsm9和bsm22的功能,并在基因阻断变株中分离纯化相应的SP前体物。方法 利用抗性基因插入或CRISPR-Cas基因编辑的方法阻断bsm9和bsm22基因,并对其进行基因回复实验。利用薄层色谱(TLC)和高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用分析变株Δbsm9和Δbsm22的发酵产物。利用半制备液相色谱的方法分离纯化缺少甲基化修饰的SP前体物,经核磁共振波谱(NMR)数据分析确定其化学结构。结果 成功构建了两个基因的阻断株Δbsm9和Δbsm22。Δbsm9变株的发酵液没有抗菌活性的物质产生,经HPLC-MS分析也未发现相应的SP前体物。而Δbsm22变株的发酵产物的抗菌活性下降50%以上,从Δbsm22变株发酵产物中分离出福洛胺糖缺少两个甲基的SP前体物。结论 bsm22基因负责SP生物合成中福洛胺糖上的N, N-二甲基的催化,而bsm9基因可能参与麦洛胺糖的N, N-二甲基化修饰,且两者在功能上不能互补。

新型常压室温等离子体-紫外复合诱变选育埃莎霉素Ⅰ高产菌株

目的通过对埃莎霉素Ⅰ产生菌WSJ-IA进行诱变选育研究,以期获得埃莎霉素Ⅰ高产菌株。方法使用多功能等离子体诱变系统(multifunctional plasma mutagenesis system,MPMS)对出发菌株的孢子进行等离子体和紫外复合诱变,设定不同的诱变时间处理孢子悬液,通过致死率确定合适的诱变条件,利用突变株摇瓶发酵效价筛选出正突变菌株。结果在MPMS射频功率为100W,处理距离5mm,气体流量12.5SLM,等离子体-紫外辐射时间为50s时,菌株致死率为96.08%。在此诱变条件下,以突变株的初筛效价为指标的突变率、正突变率分别达到63.96%和22.52%,复筛效价是出发菌株1.5倍以上的有5株,占复筛菌株的9%。最终筛选出一株发酵单位比出发菌株提高221%、埃莎霉素Ⅰ组分含量提高192%的正突变株IA-425。42L自动发酵罐发酵结果表明,该菌株埃莎霉素Ⅰ产量达到(2000±200)μg/m L左右。结论新型等离子体复合紫外诱变方式,可有效提高菌株的埃莎霉素Ⅰ发酵产量和组分含量。这为埃莎霉素Ⅰ的大规模发酵和临床前研究奠定了良好基础。

利用异源正调控基因acyB2构建埃莎霉素Ⅰ高产菌株

必特螺旋霉素(bitespiramycin,BT)是以异戊酰螺旋霉素(简称为埃莎霉素)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ为主要成分的多组分抗生素。通过阻断3-O-酰基转移酶基因(sspA),获得了只产埃莎霉素Ⅰ的WSJ-2菌株,但其发酵产物中含有大量螺旋霉素,而埃莎霉素Ⅰ含量较低。为提高4″-异戊酰基转移酶基因(ist)在WSJ-2中的表达水平,从而提高埃莎霉素Ⅰ的产量,首先构建了含有ist基因和其正调控基因acyB2连锁片段的重组质粒pSET152-ia,然后将其导入到埃莎霉素Ⅰ产生菌WSJ-2中,通过具有阿普拉霉素(apramycin)抗性标记的链霉菌整合型载体pSET152整合到WSJ-2的染色体上,获得新的埃莎霉素Ⅰ产生菌WSJ-IA。在不同发酵时间定量检测ist的表达水平,WSJ-IA中ist的表达量要明显高于WSJ-2。WSJ-IA高产菌株的发酵单位从(280±20)μg/ml提高至(1160±108)μg/ml,较原始菌株WSJ-2提高了314%,而且在WSJ-IA发酵产物中埃莎霉素Ⅰ与螺旋霉素Ⅰ含量的比值是WSJ-2的2.4倍左右,说明在引入acyB2基因的同时提高了菌株的发酵单位和埃莎霉素Ⅰ的产量。

埃莎霉素Ⅰ组分高含量、高产量基因工程菌WSJ-IA及其原株的鉴定

【目的】利用调节基因acyB2激活异戊酰基转移酶(ist)基因表达的特点,将ist与调节基因acyB2在异戊酰螺旋霉素(埃莎霉素)Ⅰ产生菌菌株中共表达,获得埃莎霉素Ⅰ单组分的高含量及高产量菌株WSJ-IA。对其及原始螺旋霉素产生菌菌株Streptomyces spiramyceticus F21进行了初步鉴定。【方法】从形态学、培养和生理生化特征、细胞壁化学组成、16S rRNA基因序列、5个看家基因(atpD、gyrB、rpoB、recA和trpB)蛋白分析和系统发育树构建等方面对该菌株及其原株进行了鉴定。【结果】两株菌在形态培养特征、生理生化特征、细胞壁化学组成、16S rRNA基因序列和5个看家基因蛋白水平基本一致,在系统发育树分析中同处在一个分支中。而在16S rRNA基因序列和5个看家基因蛋白水平在系统发育上它们均与已知相近菌株处于不同的分支上,并且与不同基因的相近菌株各有不同,其中无一报道产生螺旋霉素。【结论】Streptomyces spira-myceticus F21可能是一个产生螺旋霉素的链霉菌新种,16S rRNA基因序列和5个看家基因蛋白序列分析可以作为埃莎霉素Ⅰ基因工程菌生产过程中进行鉴别的分子标志。

可利霉素体外抗结肠癌活性的研究

目的:评价可利霉素(carrimycin, CAM)及其单组分异戊酰螺旋霉素Ⅰ(isovalerylspiramycinⅠ, ISPⅠ)对结肠癌细胞的抑制作用,初步探讨其抗肿瘤的作用机制。方法:选择结肠癌细胞系LoVo,评价CAM及其单组分ISPⅠ与螺旋霉素(spiramycin, SP)及其单组分螺旋霉素Ⅰ(spiramycinⅠ, SPⅠ)的抗肿瘤活性,采用CCK-8试剂盒检测对细胞增殖的影响;采用克隆形成实验分析对细胞克隆形成能力的影响;采用流式细胞术分析对细胞凋亡的影响;采用划痕实验检测对细胞迁移能力的影响。通过转录组分析CAM、ISPⅠ发挥抗肿瘤活性可能作用的信号通路。结果:CAM及其单组分ISPⅠ可以有效抑制结肠癌细胞的增殖、克隆形成,能促使细胞凋亡比例增加,但对细胞迁移能力影响不明显;在给药6 h和9 h后,CAM及其单组分ISPⅠ在细胞内的相对含量高于SP及其单组分SPⅠ;转录组测序分析发现CAM及ISPⅠ可能作用于细胞粘附相关信号通路和PI3K/Akt信号通路。结论:CAM及其单组分ISPⅠ具有体外抗结肠癌活性,且优于SP及其单组分SPⅠ,这可能与其更好的细胞穿透性相关,CAM及ISPⅠ的抗结肠癌活性可能是通过作用于细胞粘附相关信号通路和PI3K/Akt信号通路而发挥的,这为进一步研究CAM及其单组分的抗肿瘤作用机制奠定了基础。

耐热链霉菌4″-O-异戊酰基转移酶基因在变铅青链霉菌TK24中的表达

拟研究异源调控系统提高耐热链霉菌Streptomyces thermotolerans 4″-O-异戊酰基转移酶基因（ist）表达的可能性。在麦迪霉素产生菌Streptomyces mycarofaciens 1748中曾克隆到BamHⅠ~8.0 kb片段,含此基因片段的变铅青链霉菌TK24 Streptomyces lividans TK24转化子可将螺旋霉素高效转化为丙酰螺旋霉素。序列分析表明此片段除包含麦迪霉素4″-O-丙酰基转移酶基因（mpt）外还存在与其连锁的两个正调控基因orf27和orf28。将这个基因簇中mpt基因的orf替换为ist基因的orf,然后与两个正调控基因或者单独一个orf27连接,将这些构建好的片段分别克隆到中等拷贝数及高拷贝数载体pKC1139和pWHM3上,再转化到S.lividans TK24中。通过测定S.lividans TK24转化子中螺旋霉素生物转化为4″-O-酰化螺旋霉素的产率来评价mpt和ist基因的表达水平。结果表明只有高拷贝载体pWHM3构建的重组质粒S.lividans TK24转化子中才能明显检测到4″-O-异戊酰螺旋霉素的产生。mpt基因的正调节系统可以提高ist基因的表达水平,含两个调节基因的转化子转化效率高于含单一调节基因的转化子。