农业大学园艺专业本科实习与毕业论文教学改革探讨

在农业大学园艺专业本科教育中,完成实习课程和毕业论文是培养学生综合素质和实践能力的关键环节。现行的园艺专业本科教学模式存在实习时间固定且集中、教与学存在一定脱节、考核方式单一和经费不足等问题,导致教学效果不佳,毕业的本科生质量较难满足乡村振兴和研究生人才选拔需求。文章通过实地调研、文献查阅、实际案例分析和实习课程教改项目实施,探讨园艺方向本科实习与毕业论文传统教学模式中理论和实践教学存在问题,分析本科毕业论文教学要求与社会工作需要专业类型人才间的联系,进而优化调整教学内容与毕业论文完成形式,强化实践教学,改革和创新本科毕业论文完成方式,为提高农业大学园艺专业本科学生的园艺理论和实践水平及培养适应现代农业生产的优秀园艺专业人才提供参考。

柑橘黄龙病菌亚洲种重复序列分析及其检测引物筛选

由柑橘黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)引起的黄龙病(Huanglongbing,HLB)对柑橘产业危害严重,通过加强病原检测有利于减少病害传播。利用高拷贝重复序列位点设计引物,虽能提高黄龙病检测的灵敏度,但重复序列的多态性很难保障引物检测特征稳定。通过比较11个CLas全基因组的重复序列,以期获得保守的重复序列,利于开发通用型CLas检测引物。结果显示,CLas全基因组有4段长度>50 bp的高拷贝重复序列,其重复数量和序列在11个菌株中均具有保守性。基于4段重复序列开发了CLas特异的6对引物,均能稳定检测田间柑橘黄龙病样品,熔解曲线吸收峰单一,熔解温度稳定。比较6对引物的灵敏度,发现基于5个拷贝重复序列开发的IR16-fr灵敏度最高。使用IR16-fr和常规引物CQULas-FR对50份田间柑橘叶片样品进行检测,结果显示,CQULas-FR对CLas的检出率为20%,而IR16-fr的检出率为26%。新引物IR16-fr可为田间CLas高效率检测提供技术支撑。

核酸共提取试剂盒应用于柑橘危险性病害检测的效率评价

柑橘易受到不同遗传类型病原的复合感染,传统病原检测方法需单一核酸提取,使得检测步骤繁琐,影响检测效率。以普通单一核酸提取试剂盒为对照,采用核酸共提取试剂盒,通过分析核酸完整性和浓度以及病原检测效率,以期探讨核酸共提取试剂盒应用于柑橘危险性病害检测的可行性,从而简化柑橘病原检测方法的核酸提取步骤。结果表明,相比普通RNA提取试剂盒,核酸共提取试剂盒提取RNA的完整性、纯度、浓度以及柑橘衰退病毒病原检测效率均无显著差异,可达到相同检测效果。相比普通DNA提取试剂盒,核酸共提取试剂盒提取DNA的完整性、纯度均无显著性差异,但其浓度显著降低,使得柑橘黄龙病和柑橘溃疡病病原检测效率也显著降低;通过增加PCR反应的起始模板量,核酸共提取试剂盒检测柑橘黄龙病和柑橘溃疡病病原的效率与普通DNA试剂盒无显著差异,可达到相同检测效果。综上所述,核酸共提取试剂盒可应用于柑橘危险性病害检测,将有助于提高病原复合感染样品的检测效率。

线虫耐寒性研究进展

对于分布在温带和寒带的线虫,它们只有战胜冬季寒冷的挑战,才能有利于种群的存在与发展。因此,耐寒性是线虫生物学研究中不可忽视的内容。综述了关于线虫在低温胁迫下的耐寒性测定方法、耐寒对策及耐寒机制等方面的研究进展。线虫的耐寒性和昆虫一样,可通过过冷却点和低温存活率两种指标进行评价,但在具体的实验方法上,线虫耐寒性研究有其不同之处。线虫的耐寒对策和耐寒机制具有多样化。耐寒对策主要有耐冻和避冻,二者能共同渗透于线虫的耐寒过程中。耐寒机制包括特殊发育阶段的形成、低温驯化作用、低分子量抗冻物质的聚集、以及高分子量抗冻蛋白和热休克蛋白的产生,等等。此外,还强调应从多个角度研究线虫的耐寒性,如寒冷敏感型线虫的研究、寄生线虫的耐寒对策研究以及交叉胁迫的研究。

两种药用植物提取物对柑橘保鲜的影响

为筛选能应用于柑橘保鲜的药用植物提取物,测定了博落回和虎杖提取物对柑橘绿霉菌的抑菌活性以及对柑橘保鲜的效果。结果表明:博落回和虎杖提取物均能抑制绿霉菌的生长,二者的有效中质量浓度分别为184.32、538.48 mg/L,博落回的抑菌效果比虎杖好;与清水对照相比,2种提取物处理柑橘的腐烂率均显著降低;与常规化学保鲜剂相比,2种提取物冰糖橙的腐烂率差异均无统计学意义,但椪柑的腐烂率均显著升高;2种提取物处理冰糖橙的失水率与常规化学保鲜剂处理的差异均无统计学意义,但显著高于清水处理,2种提取物对冰糖橙的防腐、保鲜能达到常规化学保鲜剂的效果。

松材线虫Hsp70基因的克隆与原核表达

热激蛋白70（Hsp70）是已知热休克蛋白家族中最重要的一种,它在细胞内的大量表达可以明显改善细胞的生存能力,提高对环境胁迫或伤害的耐受性。采用RACE-PCR技术,从松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）中克隆了Hsp70基因的全长cDNA序列（共2 061 bp）（GenBank登录号为：DQ785812）。其编码一个分子量为70 kD的642个氨基酸的蛋白序列,含有3段Hsp70家族的签名序列。同源性分析表明,氨基酸序列与其它真核生物的Hsp70序列具有很高的相似性,并与秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）热激蛋白70家族中的hsp-1基因编码的氨基酸序列更为相似。因此,将克隆的松材线虫Hsp70基因命名为Bx-hsp-1。构建了一个原核表达载体Bx70pEASY-E1,当IPTG终浓度为0.4-0.8 mmol/L时,能诱导表达融合蛋白。Bx-hsp-1基因的克隆和表达,将为松材线虫的生态适应性机理研究奠定基础。

细胞色素P450表达在植物防御反应中的作用

细胞色素P4 5 0是广泛存在植物体中的一种多功能氧化酶 ,它在植物对病原侵袭的防御反应中起着重要的作用。本文从植物P4 5 0的多样性 ,及在寄主 病原物不亲和互作中的特异表达 ,证明了P4 5 0参与植物的抗病反应 ;同时 ,分析P4 5 0在植物抗病反应的作用途径 ,说明P4 5 0在植物抗病基因工程中存在巨大的应用潜力。

β-氨基丁酸诱导辣椒细胞色素P450基因的克隆及其序列分析

用RT-PCR和RACE方法,从β-氨基丁酸(β-aminobutyric acid,BABA)诱导辣椒叶片的基因表达体系中克隆出CYP92A的全长cDNA序列。在BABA处理后,CYP92A基因以一种快速而短暂的方式作出应答。生物信息学分析表明,该基因编码一条509个氨基酸残基的多肽,含有一段细胞色素P450保守的血红素结合区域,由此CYP92A被确定是细胞色素P450。通过系统进化分析,CYP92A属于多基因家族P450的92A亚家族。结合已报道92A亚家族成员的研究,推测CYP92A参与植物的防御反应。通过生物信息学分析蛋白结构,对CYP92A催化反应特性进行了讨论。为进一步探讨BABA的诱导机理奠定了基础。

不同密度可降解防草布对柑橘幼树生长及土壤性质的影响

本研究分析不同密度可降解防草布(低密度:52 g·m^(-2);中密度:72 g·m^(-2);高密度:82 g·m^(-2))对幼树生长及土壤性质的影响,旨在为柑橘幼树果园如何选择可降解防草布提供参考。结果表明,与对照相比,低密度和中密度可降解防草布对植株地上部分生长、根系在不同土层深度的分布比例均无显著性影响,但能造成根系总数量发生显著性减少。高密度可降解防草布能显著促进植株地上部分生长,不会引起根系总数量减少,但易造成根系分布在浅土层(0~<20 cm土层深度)。3种防草布对土壤容重无显著性影响,但能造成表层土壤含水量增加和深层土壤含水量减少,这可能是根系分布在浅土层的原因之一。因此,建议柑橘幼树果园选择高密度可降解防草布覆盖,但应考虑防草布覆盖前进行深层土壤改良,避免根系上浮。

新型柑橘采后杀菌剂研究进展

化学防治至今仍是柑橘采后病害防治的主要方法。近年来,咯菌腈、嘧霉胺和嘧菌酯等3种"低风险"毒性杀菌剂已在多个国家内用于柑橘采后病害防治。它们的作用机制与老型杀菌剂不同,能有效控制抗老型杀菌剂的病原株系,解决当前老型杀菌剂面临失效的困境。对有关安全、高效应用3种新型杀菌剂的研究情况进行了综述,包括作用机制、防治病害种类、最大残留限量标准、病原抗性风险和杀菌剂应用策略等5个方面。

混合式教学在园艺商品学课程中的应用

园艺商品学是园艺本科专业重要的必修专业课程。传统教学模式侧重教师的教而忽视了学生的学,已很难满足新时代对大学生综合素质提出的要求。针对传统教学模式的弊端,教学团队将混合式教学应用于课程改革,通过优化教学时间安排、构建线上教学体系和多元化评教体系、调整线下教学内容等方面使学生成为学习的主体,极大提高了学生学习课程的效率。

采后套袋的崀丰脐橙贮藏性能评价

以崀丰脐橙为研究对象,研究自然通风条件下套袋对果实外观和内在品质的影响。结果表明:崀丰脐橙贮藏60 d后失重超过5%,果皮出现皱缩,但是套袋后果皮劣变能有效缓解;随着贮藏时间延长,崀丰脐橙果皮色泽由橙黄色向橙红色转变,可溶性固形物含量保持稳定,可滴定酸含量有下降趋势,表现出较优的贮藏品质;在90 d的贮藏时间中,崀丰脐橙腐烂率和果皮生理性病害发生率均低于纽荷尔脐橙,耐贮藏性更优。

柑橘内参基因的稳定性评价

【目的】为了筛选在柑橘中稳定表达的内参基因,以确保柑橘基因表达分析结果的可靠性。【方法】选取Actin、18SrRNA、rpII、GAPDH、UBQ10、UBQ1作为候选内参基因,以geNorm、Normfinder、BestKeeper以及RefFinder软件分析这6个基因在冰糖橙的根、茎、叶、果实以及干旱、低温、溃疡病、衰退病胁迫下叶片中的表达稳定性。【结果】结果表明,在不同柑橘器官及不同胁迫处理下的柑橘叶片中,候选内参基因的表达稳定性确实存在差异。在不同柑橘器官之间比较用UBQ10和rpII;干旱胁迫下用GAPDH、18SrRNA和Actin;低温胁迫下用UBQ10、Actin和18Sr-RNA;溃疡病菌侵染胁迫下用Actin、UBQ10和GAPDH;感染衰退病毒时用18SrRNA和rpII。【结论】为了获得较为稳定的表达分析结果,建议根据不同的试验内容选择不同的内参基因组合。

旅游踩踏对土壤微生物生物量碳、氮、磷的影响

为了探明旅游活动对张家界国家森林公园土壤微生物活性及多样性的影响，保护土壤生态平衡及合理开发自然保护区提供理论依据，进行了旅游踩踏对土壤微生物生物量碳、氮、磷的影响研究．结果表明，在所设的3个试验区中，0-5cm土壤层的微生物生物量碳、磷受到旅游踩踏的影响最严重，5-15cm土壤层的微生物生物量碳、磷受到旅游踩踏的影响较严重，而15-25cm土壤层的微生物生物量碳、磷受到旅游踩踏的影响最轻，旅游踩踏对所设3个试验区中3个层次土壤的微生物生物量碳、磷的影响均达到了显著水平（P〈0．05），从旅游踩踏对3个土壤层的微生物生物量氮的影响程度来看，0-5cm土壤层的微生物生物量氮受到的影响最严重，5-15cm土壤层的微生物生物量氮受到的影响较严重，而15-25cm土壤层的微生物生物量氮受到的影响最轻。背景区与缓冲区15-25cm土壤层的微生物生物量氮差异没有达到显著水平．说明张家界国家森林公园土壤微生物遭到了旅游踩踏的破坏，抵御外界干扰的能力已受到了旅游踩踏的破坏．

冰糖橙果实品质无损伤在线检测分级技术的建立与应用

【目的】冰糖橙果实外观分级与内部品质不一致极大地影响了其市场声誉,建立冰糖橙果实品质分级标准和果实快速规模化无损伤品质检测分级技术,并进行在线应用,为快速分选不同糖酸度冰糖橙产品提供技术支持。【方法】在利用常规果实品质分析方法对主产区的冰糖橙果实进行多年品质分析的基础上,找出果实外观和内在品质的相关性,确定不同果型横径与糖酸度含量的关系,形成冰糖橙果实分级标准。在此基础上,采集710—960 nm波段近红外透射光谱建立果实无损伤检测模型,利用常规品质分析数据对原始光谱反复进行校正并验证,确定无损伤检测的准确性,并在分级线上进行应用;调查统计应用无损伤检测生产线分级后各级冰糖橙的产量、销售单价和销售额。【结果】(1)根据果实横径大小进行初选分级,68—74 mm为大果型,62—67 mm为中果型,56—61 mm为小果型,再按果实的糖度(可溶性固形物Brix度)和酸度不同将冰糖橙划分为4个等级:糖度≥14、酸度≤0.4%为特级果;12≤糖度<14、酸度≤0.4%为一等果;糖度≥14、0.6%≥酸度>0.4%为二等果;糖度<12、酸度≤0.4%为合格果。通过反复矫正,建立了冰糖橙果实品质分级标准。(2)通过多次进行单果糖度和酸度的分析矫正,建立了冰糖橙果实糖度和酸度的检验线。第1次建立的冰糖橙糖度检量线检测范围为10.1—14.9 Brix,再利用常规品质分析验证无损伤检测结果,合格率仅为26%。第2次建立的糖度检量线延长高糖检测范围,为10.1—16.2 Brix,经验证后合格率达90%。第3次建立的糖度检量线扩大低糖检测范围,为9.8—16.2 Brix,经验证后合格率为90%。第1次建立的冰糖橙酸度检量线检测范围为0.1%—1.26%,再利用常规品质分析验证无损伤检测结果,合格率仅为64%。第2次建立的酸度检量线延长高酸检测范围,为0.1%—1.37%,经验证后合格率达94%。第3次建立的酸度检量线继续扩大高酸检测范围,为0.1%—1.53%,经验证后合格率为92%。(3)新建立无损伤糖酸度校正和验证模型,糖度有效检测范围为8.7—15.1 Brix,酸度有效检测范围为0.14%—2.0%,经验证后糖度合格率达到98%,酸度合格率为98%。应用该分级技术,分选速度达到10个冰糖橙/秒,品质分级后最高单价48元/kg,年产量4 500 t,实现产值9 122万元。【结论】研究结果预测糖酸度准确,测量范围全面涵盖冰糖橙商品果的糖酸度,能大批量、快速、高质量和无损伤在线鉴别冰糖橙果实内在品质,结合外观品质分级标准,分选出内外品质均一的产品。

β-氨基丁酸诱导植物抗病作用的研究

β-氨基丁酸(BABA)是一种具有广谱诱抗活性的植物化学诱抗剂.为了研制和开发该类氨基酸农药制剂,对BABA及其合成制剂温室诱导辣椒抗TMV,CMV,疫病和番茄抗根结线虫病及田间诱导大白菜抗霜霉病的活性进行了研究.结果表明,β-氨基丁酸喷雾处理辣椒叶片和茎杆后,可诱导辣椒获得对TMV和CMV的抗性,诱抗效果受诱抗剂浓度所影响,最高的诱抗效果可达到50%以上;10%BABA可溶性粉剂对多种病害的诱抗效果均在BABA纯剂之上,特别对辣椒疫病的诱抗效果在接种后10 d仍高达88%;对大白菜抗霜霉病的诱抗效果也较生产上常用药剂甲霜锰锌要好.BABA衍生物对TMV,CMV,疫病和根结线虫病亦表现出一定的诱抗潜能.

β-氨基丁酸诱导辣椒抗病机理的研究

以CV98,茄门和931等品种为供试材料,对β-氨基丁酸诱导辣椒后叶片中β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶和过氧化物酶活性动态变化进行测定.结果表明,β-氨基丁酸对不同抗、感辣(甜)椒β-1,3-葡聚糖酶活性、几丁质酶活性和过氧化物酶活性有不同程度的提高,但辣椒品种酶活性升高的幅度高于甜椒品种,且这3种PR蛋白活性变化与诱抗效果的表现相一致.β-氨基丁酸可以诱导几丁质酶ClassⅢ和脂氧合酶基因的表达,诱导处理辣椒后,几丁质酶ClassⅢ和脂氧合酶基因的表达都呈现低-高-低的抛物线型发展趋势,6 h时表达量较小或不表达,大多在12～24 h表达量达最大,之后表达开始减弱,到48 h基本停止表达或微弱表达.对所得差异片段进行核苷酸序列同源性分析,发现与已经报道的辣椒脂氧合酶的编码序列高度同源,达100%.

抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的制备及单链抗体基因的构建

【目的】制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体并构建其单链抗体(single chain variable fragment,ScFv)基因,为从PthA角度进一步研究柑橘溃疡病致病机理创造条件,并为构建单链抗体基因植物表达载体,尝试利用转基因和植物抗体技术创制抗溃疡病柑橘新种质奠定基础。【方法】利用PthA-NLS重组多肽免疫Balb/c小鼠,制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体,从分泌抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR和重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)法构建其单链抗体基因,并克隆到pGEM-T载体和原核表达载体pET32a(+)中,重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达。【结果】获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株1C8H1、2D12B6、3D8A10。成功构建了单链抗体基因ScFv,获得的ScFv基因大小约750bp,其中重链可变区(VH)基因有360bp,轻链可变区(VL)基因有342bp,中间连接肽基因45bp,经过IPTG诱导ScFv原核表达,获得了大小为44.5kD的ScFv重组蛋白。【结论】试验获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株,成功构建了ScFv基因,并实现了原核表达,为进一步探索PthA的致病机理和下一步利用抗体技术获得抗溃疡病柑橘种质[0]的研究打下了基础。

柑橘衰退病毒基因p23 RNAi载体的构建及转化

【目的】构建柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)含p23的RNAi载体,以获得具有抗性的柑橘转基因植株。【方法】基于转化病毒基因介导抗性,根据NCBI公布的CTV基因组序列,查找p23保守序列,设计并克隆两条不同长度的片段。对两条片段和植物表达载体p BI 121进行双酶切和连接来构建RNAi载体。初步预测所构建的载体发生RNAi抗病毒的可行性。利用农杆菌介导的瞬时表达技术将含RNAi载体的农杆菌注射入CTV指示植物墨西哥莱蒙的叶片,利用GUS组织化学染色法观察叶片中载体发生瞬时表达的情况。发生瞬时表达的叶片接种CTV T36基因型,利用酶联免疫反应(ELISA)检测病毒含量。同时,提取叶片的RNA并反转录为c DNA,利用实时荧光定量PCR(q-PCR)检测CTV p20,通过该基因的表达量反映叶片中的病毒含量。通过农杆菌介导的遗传转化将RNAi载体转入大红甜橙实生苗上胚轴节间茎段,抗生素筛选得到的芽嫁接至枳橙实生试管苗。提取大红甜橙叶片的DNA,通过PCR扩增确定其是否为转基因阳性;目的基因检测为阳性的植株二次嫁接至温室保存的酸橙实生苗;根据插入的p23基因序列设计q-PCR引物,检测转基因植株中p23的表达情况。取CTV T36基因型寄主的带皮芽,用腹接法接种大红甜橙转基因植株。取接种后新萌发枝梢上的叶片,用检测瞬时表达叶片同样的方法分析植株的抗病性。对于第1次接种后未检测出病毒感染的植株,进行第2次接种并检测分析。【结果】克隆得到CTV p23 513 bp的长片段和291 bp的短片段,与载体p BI121连接后成功构建含发夹结构的来自病原且能靶向目的基因的RNAi载体,命名为p23-RNAi。注射p23-RNAi的墨西哥莱蒙叶片经GUS染色后能够产生蓝色斑点,表明农杆菌p23-RNAi可以在叶片中发生瞬时表达;接种CTV后第15和30天,瞬时表达p23-RNAi的墨西哥莱蒙叶片ELISA检测结果均为阴性,同时q-PCR检测结果显示其CTV p20的积累水平和增加速度明显低于对照植株,表明瞬时表达的p23-RNAi在一定时间内可以对CTV的侵染产生抑制。p23-RNAi经农杆菌介导遗传转化大红甜橙获得抗性芽,通过普通PCR的扩增结果证明得到7个转基因植株;q-PCR检测结果进一步表明7个转基因植株间p23的含量呈现一定差异,植株E的含量最高,其次是C、F、H、A、B和G。接种CTV后,p20的表达量在7个转基因植株间也表现出一定差异,表达量最高的是植株A,其次是G、F、E、B、H、C,且与对照植株相比,呈现不同程度的抗病性。转基因植株对病毒的抗性与外源基因的表达水平没有相关性,外源基因表达水平最高的植株E并没有表现强的CTV抗性。经过两次病毒接种,转基因植株C在接种后具有完全抗性。【结论】p23-RNAi载体能引起植物抗柑橘衰退病毒;瞬时表达技术可快速鉴定RNAi载体的抗病性,有利于筛选高效率的RNAi载体。

柑橘衰退病毒基因RNAi载体的构建

基于转化病毒基因介导抗性,通过在植物表达载体p CAMBIA 2301上插入启动子–内含子–终止子的方式,构建一种含有发夹结构的、通用型强的RNAi载体骨架结构;以柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)的p25、p20和p23基因保守序列为模板设计正向片段和反向片段,先后与骨架载体连接,成功构建了3个RNAi载体(分别命名为ds2301–p25、ds2301–p20和ds2301–p23),并将载体ds2301–p23注射入墨西哥莱蒙叶片。制作p23基因的地高辛标记探针,用Northern杂交检测是否有si RNA产生。结果表明:用Northern杂交可以检测到p23特异的si RNA,在墨西哥莱蒙叶片中瞬时表达的农杆菌ds2301–p23可以发生RNAi,表达有效的si RNA。本研究中构建的骨架载体可以广泛用于RNAi载体的构建,含有柑橘衰退病毒基因片段的3个载体可以用于基因功能分析及具有CTV抗性的柑橘种质资源获得。