我国森林土壤中苏云金芽孢杆菌生态分布的研究

从我国8个森林立地带(寒温带、中温带、暖温带、北亚热带、中亚热带、南亚热带、高原亚热带、热带)所属的13个自然保护区,采集了0—5cm土层林下土壤样品384个.测定了土壤pH、水分和养分.从中分离观察芽孢杆菌菌落1873个,分离出苏云金芽孢杆菌79株,并对其所属亚种进行了初步鉴定.其平均出土率和分离率分别为14.32%和4.21%.研究了芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌在森林土壤中生态分布的规律及苏云金芽孢杆菌对6种昆虫的室内毒力测定,从中筛选出不少的高效菌株.为研究苏云金芽孢杆菌在我国森林生态系中资源的保护、开发和利用,具有重要意义.

我国四个自然保护区森林土壤中苏云金芽孢杆菌的分布

从我国四个不同立地带——长白山、百花山、鼎湖山、尖峰岭自然保护区,采集到林下0～5cm土层土壤样品75个,分离到苏云金芽孢杆菌39株。其中芽孢杆菌的总数量和苏云金芽孢杆菌的出土率和分离率有所差异,pH偏中性和含水量稍高的土壤,菌数较高;而与所测的各种土壤养分无明显相关。对39株苏云金芽孢杆菌的鉴定:17株属库尔斯塔亚种,6株属松蠋亚种,16株未定名。毒力测定表明:对杨扇舟蛾和马尾松毛虫幼虫的致死率在50％以上的菌株约占70％;对榆蓝叶甲和黄粉甲幼虫均无明显杀虫活性。

中国八个自然保护区森林土壤中苏云金芽孢杆菌的分布

从大兴安岭根河潮查、带岭、千佛山、崂山、黄山、紫金山、武夷山和西双版纳八个自然保护区采集到０—５ｃｍ土层林下土壤样品１２９个，从中分离出大量的苏云金芽孢杆菌。研究表明：不同立地带森林土壤中芽孢杆菌的总数量、苏云金芽孢杆菌的出土率及占所分离芽孢杆菌的分离率间具有一定的差异，但它们与土壤含水量、ｐＨ、单一养分间无明显的相关性。我们还对所分离的苏云金芽孢杆菌所属亚种进行了初步鉴定，对六种有害昆虫进行了毒力测定。

三株不同形状伴孢晶体的苏芸金杆菌对几种害虫的毒力测定

我们从落叶松毛虫(Dendrolimus sibiricus)、印度谷斑螟(Pyralis farinali)幼虫和森林土壤中分离到产生不同形状伴孢晶体的苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis),对三株菌进行了形态特征的电子显微镜观察、生理生化特性的测定及营养细胞的酯酶型分析,并对几种昆虫进行了室内生物测定,表现出不同的毒力。

苏云金芽孢杆菌七个亚种酌DNA的G+C克分子百分数的测定

苏云金芽孢杆菌在害虫的生物防治以及植物抗虫育种中的作用日益扩大。该类细菌资源的开发和利用越来越被重视,而正确的分类鉴定方法是进行该项研究的基础。目前苏云金芽孢杆菌的分类鉴定是根据形态特征、生理生化特性、鞭毛抗原(H)的血清型以及营养细胞的酯酶型等,将其分为31个亚种。随着分子生物学和遗传学的高速发展,

高毒力苏云金杆菌株的筛选

为选育对目的害虫毒力高,生产性能稳定的菌株,收集了101个苏云金杆菌株,经初选、复筛和营养细胞酯酶分析,从中选出82038(galleriae 酯酶型)、83002(dendrolimus 酯酶型)、83016(galleriae 酯酶型)3株优良菌株。用3菌株与生产菌株7216—13对舞毒蛾、杨尺蠖、柳毒蛾和杨扇舟蛾进行毒力测定表明,除对杨扇舟蛾毒力较低外,对其它几种害虫均有80%以上的杀虫效果。

苏云金芽孢杆菌菌种保藏

采用砂土管和滤纸片两种保藏方法，对分属31个亚种的61株有代表性的苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）经过1—23年保存后的菌体存活情况、形态特征及对林业主要害虫舞毒蛾（lymantriadispar）幼虫的杀虫活性进行了试验；并对苏云金芽孢杆菌5个亚种的标准菌株和保存不同年限后的11项生理生化特性及酯酶型进行了测定。

抗虫转基因欧美杨的培育

以携带３５Ｓ－Ω－Ｂ．ｔ－Ｎｏｓ嵌合基因的双元载体农杆菌ｐＢ４８．２１４和ｐＢ４８２．１５（Ｂ．ｔ基因片断长度分别为２．１ｋｂ和１．８ｋｂ），转化欧美杨叶片和茎段外植体，共获得２２５株转化再生植株。以舞毒蛾（ＬｙｍａｎｔｒｉａｄｉｓｐａｒＬｉｎｎａｅｕｓ）幼虫进行生物测定后，获得杀虫率分别为５５—８０％的抗虫转基因植株共３株（Ｒ－１３５，Ｒ－１２３和Ｒ－１４０），经组培苗和苗圃移栽植株的ＰＣＲ分析，苗圃移栽植株ＰＣＲ产物杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明，Ｂ．ｔ毒蛋白基因已整合到上述抗虫植株的细胞ＤＮＡ中，并表达出杀虫活性。

我国不同森林立地带Bt分离株杀虫晶体蛋白及基因分析

利用苏云金芽孢杆菌cry基因的PCR RFLP鉴定体系和SDS PAGE方法分析了来自我国不同森林立地带土壤中的 72株苏云金芽孢杆菌的cry1、cry2、cry3、cry4、cry5、cry8、cry9、cry10、cry11、cry1I等 10类基因类型和表达蛋白 ,并进行了杀虫活性的生物测定。研究表明 :同时含有cry1,cry2 ,cry1I 3类基因的有 2 1株菌 ,6株菌含有cry1,cry2类基因 ,4株菌含有cry1和cry1I类基因 ,只含有cry1基因的有 1株 ,cry2类基因的 4株 ,36株菌不含所鉴定的 10类cry基因。同时证明 ,绝大多数含有cry1基因的菌株表达了 130kDa蛋白 ,含有cry2基因的菌株表达了 6 0kDa蛋白。生物活性测定表明 ,共同含有cry1Aa、cry1Ac和cry2基因的菌株对棉铃虫幼虫具有较强的杀虫活性 ,只含有单一基因和不含上述基因的菌株杀虫活性较弱。

31株苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因型鉴定及表达产物研究

利用已建立的苏云金芽孢杆菌cry基因的PCR RFLP鉴定体系 ,鉴定了 31株Bt菌株的cry基因类型 ,并进行了SDS PAGE分析和杀虫生物活性测定。研究表明 :2 5株含cry1基因 ,表达蛋白 1 30～ 1 50kD ;其中 1 6株含有对鞘翅目和鳞翅目害虫皆有活性的cry1I基因 ,其表达蛋白为 81kD ;1 5株同时含有cry1和cry2基因 ( 1 3株表达蛋白约为 60kD) ;1 0株含有未知待定基因 ;6株不含所鉴定的cry基因 (其中 2株有表达产物 )。室内生物测定表明 :cry1、cry2基因表达的菌株对鳞翅目害虫具有高杀虫活性 ,7株对舞毒蛾和膜翅目———杨叶蜂幼虫具有较高杀虫活性 ;含有cry1Aa、cry1Ac、cry2或cry1Ab、cry1Ac、cry2基因组合的菌株对棉铃虫幼虫均显示杀虫活性 ,其中 6、1 2、30号菌株毒力最强。不含上述cry基因的菌株均无杀虫活性。以上结果证明 ,通过cry基因类型鉴定和表达产物的SDS PAGE分析可以预测菌株的杀虫活性。

我国不同森林立地带土壤中苏云金芽孢杆菌cry基因资源研究

利用PCR RFLP鉴定体系和SDS PAGE表达蛋白的分析方法,分析了来自我国不同森林立地带(寒温带、中温带、暖温带、北亚热带、中亚热带、南亚热带、高原亚热带、热带)自然保护区森林土壤中分离的72株苏云金芽孢杆菌的cry1、cry2、cry3、cry4、cry5、cry8、cry9、cry10、cry11、cry1I杀虫晶体蛋白基因类型,表达蛋白和杀虫活性的生物测定。研究表明:同时含有cry1、cry2、cry1I3类基因的有21株菌,6株菌含有cry1、cry2类基因,4株菌含有cry1和cry1I基因,只含有cry1基因的有1株,cry2基因的4株,36株菌不含所鉴定的10类基因。同时证明:绝大多数含有cry1基因的菌株表达了130kD蛋白,含有cry2基因的菌株表达了60kD的蛋白。对不同农、林害虫棉铃虫、杨扇舟蛾、舞毒蛾、马尾松毛虫、黄粉甲、榆兰叶甲、落叶松叶蜂等幼虫的杀虫活性进行了生物测定。进一步证明了苏云金芽孢杆菌cry基因,表达蛋白及杀虫活性三者的相关性。为生产和科研提供了生物治虫、抗虫育种新的苏云金芽孢杆菌cry基因资源。

我国西北干旱地区森林土壤中苏云金芽孢杆菌生态分布

对地处我国西北干旱地区新疆、甘肃、宁夏三省（区）内的１１ 个自然保护区——哈纳斯、小叶白蜡、天山云杉、野核桃、塔里木、东大山、贺兰山、六盘山、崆洞山、兴隆山、莲花山等自然保护区采集的２６０ 个森林土壤样品，进行了生态因子调查；分析了土壤ｐＨ、含水量、水解Ｎ、有效Ｐ、速效Ｋ、全Ｎ、有机质；研究了芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌数量和种类生态分布。共分离苏云金芽孢杆菌４２株，其出土率和分离率分别为１１．５３％ 和２．１８％ 。

苏云金杆菌发酵条件的研究——Ⅱ.83002菌株在14L发酵罐发酵条件与制剂生产

以苏云金杆菌83002菌株在14L发酵罐条件下研究表明:培养温度和搅拌速度对菌数表现出一定的相关性,但对培养基pH变化规律影响不大;培养基灭菌前的初始pH值高低对发酵过程中pH变化规律有一定影响,培养温度、搅拌速度、培养基灭菌前pH值高低对发酵过程中培养基C、N变化的规律均表现出一定影响。上述结果,为苏云金杆菌发酵条件参数提供了依据,确立了各种剂型的制备工艺。

用黄酒滤渣生产苏云金杆菌的研究

研究表明,利用生产黄酒的滤渣代替苏云金杆菌制剂生产中的部份原料,如酵母粉、淀粉等,取得了较好效果。用黄酒滤渣配方生产的苏云金杆菌,杀虫活性不低于原生产配方,并且生产成本降低30%以上。

苏云金芽孢杆菌83016菌株的研究

通过对83016菌株生理生化特性、不同培养和发酵条件下制备物室内毒力测定方法比较及小试产品对松毛虫等5种森林害虫林间防治试验结果表明,该菌株属苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种;三种不同制备方法的室内生测比较,以光密度测定法较其它两种方法简便可靠,适用于进行大量菌株筛选;83016菌株发酵产物和小试产品对马尾松毛虫等害虫有较高的毒性。

苏云金芽孢杆菌制剂与化学药剂混合使用的初步研究

本研究进行了五种化学药剂对苏云金芽孢杆菌库尔斯达克亚种(Bacillus thuringiensis Subsp Kurstaki)的抑菌实验。阐明了细菌杀虫剂与化学药剂混合使用中应该注意的问题和研究方法,为稳定细菌杀虫剂的生产和应用提供了依据。

前苏联森林害虫微生物防治研究概况

前苏联很重视森林病虫害生物防治工作。全苏每年病虫害发生面积约100万公顷,生防面积达72万公顷。在生防中大量使用苏云金杆菌制剂,其次是昆虫病毒和白僵菌制剂。全苏应用微生物研究所生产7大类微生物制品,其中杀虫剂产品就有10种。苏联在微生物制剂投入应用之前,要求提出一系列试验研完、应用效果、安全试验鉴定评价及应用药剂保护措施等报告和通过国家化学工业委员会批准及国家最后鉴定。

用马尾枕毛虫幼虫测定苏云金芽孢杆菌制剂毒力效价

本研究采用经室内一个世代饲养（温度２８℃，ＲＨ：７５％，Ｌ：Ｏ＝１６：８）马尾松毛虫二龄（脱皮第一天）幼虫为测试昆虫，测定了实验室生产的苏云金芽孢杆菌制剂（含水量４％以下，细度≥２００目，悬浮率８５％，活孢子数为１００Ｏ亿／ｇ），获得较满意的结果。初步确定了以马尾松毛虫幼虫为测试昆虫的可行性。