羊捻转血矛线虫病检测方法研究进展

羊捻转血矛线虫病是由捻转血矛线虫寄生于羊等小反刍动物皱胃内引起的一种危害严重的嗜血性寄生虫病。病羊临床表现为消瘦、贫血和衰弱等慢性消耗性症状,严重感染者可致死。该病在我国牧区普遍流行,目前暂无安全长效疫苗可用,加之耐药性严重,放牧羊群感染率和发病率居高不下,极大地降低了羊养殖业的经济效益。准确可靠的检测手段是诊断寄生虫感染、制定驱虫治疗方案、耐药监测及流行病学调查的关键环节。本文详细介绍了羊捻转血矛线虫病的检测技术研究现状,分析了病原学、免疫学及分子检测等方法的优缺点,并对未来检测技术发展趋势进行了展望,以期为该病新型检测方法的研发及综合防控策略提供参考。

不同环境和营养条件对捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌生长、产孢及几丁质酶表达的影响

[目的]研究温度、pH和不同营养条件对捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌(Arthrobotrys conoides)生长及产孢特性的影响,分析其在碳氮饥饿条件下几丁质酶的表达水平,优化该菌的培养条件,为该菌的扩大培养提供参考依据。[方法]将圆锥节丛孢菌AC-shz1菌株接种于YPSSA培养基,分别置于不同温度(15、20、25、30和35℃)、pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0)、碳源(果糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、纤维素、几丁质)、氮源(甘氨酸、苯丙氨酸、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、尿素)和碳氮比(1∶1、5∶1、10∶1、20∶1、40∶1)环境条件下进行培养,观察并记录菌丝的生长速度及形态,测定其产孢能力;在碳氮源饥饿条件下,采用实时荧光定量PCR方法对4种几丁质酶基因的表达水平进行分析。[结果]圆锥节丛孢菌在温度15~30℃均能生长,其中以25℃时菌丝生长最快且产孢能力最强;在pH为6.5~7.5时菌丝生长良好,其中以pH 7.0时产孢能力最强。圆锥节丛孢菌最适菌丝生长和产孢碳源为葡萄糖和蔗糖,其中含葡萄糖的培养基产孢量最高;最适氮源为酵母粉和蛋白胨,含酵母粉的培养基产孢量最高,以葡萄糖和酵母粉为碳氮源的最适碳氮比为5∶1。与对照组相比,在碳饥饿条件下,捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌几丁质酶-14(AC-14,P<0.01)和捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌几丁质酶-190(AC-190,P>0.05)基因转录水平上调,捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌几丁质酶-379(AC-379,P>0.05)和捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌几丁质酶-483(AC-483,P<0.01)基因转录水平下调;在氮饥饿条件下,上述4种几丁质酶基因转录水平均极显著下调(P<0.01)。[结论]菌丝生长和产孢最适温度为25℃,最适pH为7.0,最适碳氮源分别为葡萄糖和酵母粉,最适碳氮比为5∶1。本研究结果为进一步研发具有高效的捕食线虫真菌生物防控制剂奠定了基础。

少孢节丛孢菌几丁质酶AO-492对线虫的降解作用研究

【目的】为探究捕食线虫真菌少孢节丛孢菌几丁质诱导过程中分泌蛋白AO-492的生物学功能。【方法】对少孢节丛孢菌几丁质酶AO-492主要结构域编码区进行基因克隆及分子特征分析,并在毕赤酵母中进行表达。利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白ReAO-Z492,采用NAG检测法分析了该重组蛋白在不同温度、pH及金属离子条件下的酶学活性,并将其作用于秀丽隐杆线虫及虫卵分析其生物学功能。【结果】几丁质酶AO-492有信号肽,无跨膜结构域,含有两个几丁质结合结构域和一个糖苷水解酶18家族结构域,并含有糖苷水解酶18家族几丁质酶高度保守的底物结合位点-SVGGWT-和水解酶活性位点-FDGGDLDWE-,含有典型的TIM桶形分子结构。系统进化分析显示,该蛋白与坚粘孢单顶孢几丁质酶(EPS35099.1)的亲缘关系相对最近。SDS-PAGE和Western Blot分析表明,ReAO-Z492分子量约为59 kD,可与小鼠抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生特异性反应。ReAO-Z492最适温度为40℃,最适pH为7.0;Mg^(2+)对其酶活有促进作用,而Ag^(+)、Cu^(2+)、Fe^(3+)和Zn^(2+)有抑制作用。ReAO-Z492对秀丽隐杆线虫体壁及其虫卵卵壳有较强的降解活性。【结论】少孢节丛孢菌几丁质酶 AO-492 对秀丽隐杆线虫及虫卵具有较强的降解作用。

感染LM小鼠巨噬细胞外泌体的转录组测序及差异表达miRNA特征分析

[目的]分离和鉴定感染单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)小鼠巨噬细胞外泌体(Exosomes,Exos)并分析其miRNA表达谱,为揭示巨噬细胞Exos miRNA在LM感染中的调控机制奠定研究基础。[方法]以未感染LM的巨噬细胞为对照组,感染LM的巨噬细胞为试验组,采用超速离心法分离提取巨噬细胞上清中的Exos,通过透射电镜、纳米颗粒追踪技术和Western blot对Exos形态、大小及表面标志分子特征进行鉴定。利用Illumina SE50测序平台对2组巨噬细胞Exos miRNA进行Small RNA-seq测序,筛选出显著差异表达的miRNA。使用Targetscan、miRDB和miRWalk数据库对差异表达miRNA靶基因进行预测,并对差异miRNA靶基因进行GO和KEGG-Pathway功能富集分析。利用Cytoscape软件绘制前20位Hub基因的miRNA-mRNA调控网络图。[结果]Exos直径为30~150 nm,具有典型的双层膜结构,Exos表面标志分子CD9、CD63和TSG101呈阳性表达。高通量测序结果显示,与对照组相比,试验组Exos中共筛选出9个显著差异表达的miRNA,其中显著下调基因8个(mmu-miR-7a-5p、mmu-miR-365-2-5p、mmu-miR-122-5p、mmu-miR-122b-3p、mmu-let-7i-5p、mmu-miR-151-3p、mmu-miR-182-5p和mmu-miR-1198-5p),显著上调基因1个(mmu-miR-192-5p),共预测miRNA调控靶基因1064个。GO富集分析结果显示,差异miRNA靶基因主要富集在轴突形成、细胞连接组装、肌动蛋白结合和金属离子跨膜转运等过程;KEGG分析显示,靶基因显著富集在cGMP-PKG信号通路和FcγR介导的吞噬作用通路。[结论]感染LM的小鼠巨噬细胞Exos miRNA表达谱发生了显著改变,其调控的潜在靶基因主要参与感染和免疫反应等信号通路。

sRNA GcvB对鼠伤寒沙门菌毒力的调控作用研究

小RNA(sRNA)是一种调节分子,可以在转录后水平调节基因表达,从而改变细菌的生理特征。为了研究sRNA GcvB在鼠伤寒沙门菌毒力中的调控作用,本研究构建了GcvB基因缺失株、互补株及示踪菌,检测其对鼠伤寒沙门菌生物被膜形成及泳动能力的影响;分析亲本株与缺失株在毒力及感染动力学上的差异,预测并分析了GcvB调控的潜在靶基因,探究了GcvB对ST生物被膜、氧化应激和毒力的调控作用。结果显示,与亲本株和回补株相比,GcvB缺失后生物被膜形成能力升高、抗氧化应激能力显著增强;半数致死量(LD50)上升至3.98倍。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测靶基因gcvA、bapA、hilA、igaA及sitD,结果显示gcvA、bapA、igaA及sitD的转录水平表达量上调,而hilA下降。本研究证实sRNA GcvB参与了鼠伤寒沙门菌生物被膜形成、氧化应激和毒力作用,为揭示sRNA GcvB在ST生物被膜、氧化应激和毒力中的调控机制提供了研究基础。

猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制分子Ts-serpin-2对人THP-1细胞炎性细胞因子的表达影响

为了深入研究猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制分子(Ts-serpin-2)对THP-1细胞炎性细胞因子分泌的调节作用,本实验通过RTPCR从猪带绦虫成虫扩增获得Ts-serpin-2(TsM_000807300)的编码序列CDS,利用毕赤酵母表达Ts-serpin-2重组蛋白。利用发色底物特异性反应检测Ts-serpin-2蛋白对猪胰蛋白酶、胰弹性蛋白酶、牛α-糜蛋白酶、猪胃蛋白酶、木瓜酶、凝血酶和组织蛋白酶G的抑制效果。重组蛋白Ts-serpin-2处理THP-1细胞24 h,应用qRT-PCR和ELISA方法检测各炎性细胞因子差异表达水平。结果显示,真核酵母表达的重组蛋白Ts-serpin-2分子量约为48 kDa,具有蛋白酶抑制活性,对牛α-糜蛋白酶、猪胰弹性蛋白酶及猪胰蛋白酶的活性均有明显的抑制作用。重组蛋白Ts-serpin-2可抑制LPS活化的THP-1细胞促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12α、IFN-γ和iNOS2 mRNA的转录水平,促进IL-4刺激的THP-1细胞抗炎性细胞因子IL-10的表达。ELISA结果显示,Ts-serpin-2能够抑制巨噬细胞分泌致炎因子TNF-α、IL-6和IFN-γ,刺激IL-10的分泌,与qRT-PCR检测结果基本一致。上述研究结果表明猪带绦虫Ts-serpin-2可通过调节宿主巨噬细胞分泌的炎性因子影响虫体入侵过程中宿主的免疫应答。

单核细胞增生李斯特菌新型转录调节因子lmo2486的分子特征及原核表达研究

克隆目的基因LM lmo2486,分析目的基因及其编码蛋白的分子特征,并验证其编码蛋白的反应原性,为进一步研究LM lmo2486的生物学特性奠定前期的基础。通过PCR扩增单核细胞增生李斯特菌(LM)新型转录调节因子lmo2486基因,对该基因进行测序,预测分析其编码蛋白质的二、三级结构、理化特性、蛋白结构域等分子特征,并进行遗传进化分析。PCR克隆lmo2486基因的抗原集中区lmo2486K,构建重组载体pET-32a(+)-lmo2486K转化至大肠埃希氏菌感受态细胞BL21(DE3)并使用IPTG低温诱导表达,利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(Western blot)检测重组蛋白。结果显示,LM lmo2486基因全长1212 bp,共编码403个氨基酸;lmo2486基因编码的蛋白具有亲水性和跨膜结构,无信号肽,预测发现lmo2486含有PspC和DUF4097结构域。序列同源对比发现,LM lmo2486测序所得的核苷酸序列与LM不同分离株属于同一分支,亲缘关系较近,表明lmo2486基因在LM中高度保守。SDS-PAGE检测表明,重组蛋白Lmo2486K的分子质量约为64.6 ku,Western blot分析发现,Lmo2486K蛋白具有一定的反应原性。

STM1863分子特征分析及其基因缺失对鼠伤寒沙门菌生物学特性的影响

为揭示鼠伤寒沙门菌SL-1344菌株RcsCDB系统STM1863调控子分子特征,及对STM生物学特性的影响。本研究通过PCR扩增STM1863基因并进行克隆和测序,预测分析其编码蛋白的分子特征;利用λ-Red同源重组技术构建STM-ΔSTM1863基因缺失突变株,并对其生化特性、遗传稳定性、酸碱胁迫环境中的适应性及粘附侵袭小鼠巨噬细胞的能力进行研究。结果显示:STM1863基因全长159 bp,编码52个氨基酸,具有一个跨膜和d1p32a同系物结构域;与SL-1344亲本株相比,STM-ΔSTM1863缺失株生化特性与亲本株无明显差异,生长速度与亲本株生长速度一致,但STM-ΔSTM1863在pH4.0酸应激下对数期生长速度显著低于亲本株(P<0.05);粘附和侵袭小鼠巨噬细胞能力与亲本株相比极显著降低(P<0.01)。提示STM1863因参与了STM酸应激和粘附侵袭宿主细胞的调控,本研究为深入揭示STM1863对STM粘附侵袭宿主细胞的调控机制提供了参考。

肝片吸虫CatB9蛋白的分子特征、遗传进化及表达定位研究

为了解肝片吸虫(Fasciolahepatica,Fh)组织蛋白酶B9(CatB9)的生物学功能,该研究对FhCatB9基因进行克隆、表达,并对其免疫原性和在Fh体内的定位进行分析。结果显示:FhCatB9基因长度为1038bp,编码345个氨基酸;编码的蛋白无跨膜区,有信号肽于第19~20氨基酸间。生物信息学分析显示,FhCatB9蛋白含2个N-糖基化位点、7个磷酸化位点、15个线性B细胞抗原表位和CatB的保守结构域,高级结构显示与大鼠CatB酶原相似。系统进化结果显示,Fh和大片吸虫亲缘关系最近,与其他寄生虫亲缘关系较远。SDS-PAGE和Westernblot都在55.3ku处检出目的条带。免疫组化显示,CatB9在Fh的肠道上皮细胞和排泄管上皮细胞均有表达,重组蛋白的获得为Fh血清学检测试剂的研发提供了一个有潜在价值的候选抗原。

Duddingtonia flagrans几丁质酶CTS3/CTS4的分子特征及亲缘关系

【目的】探究捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans几丁质酶的生物学特性与亲缘关系。【方法】对捕食线虫性真菌D.flagrans几丁质酶CTS3和CTS4基因进行克隆和测序,并对其编码蛋白的信号肽、亲/疏水性、催化结构域、保守序列、二级与三级结构等分子特征进行预测以及其他真菌几丁质酶的亲缘关系进行分析。【结果】几丁质酶CTS3和CTS4含有几丁质酶催化结构域的2个高度保守序列(SIGG和DGFDLDXE)及1个典型的(α/β)8桶状结构域,属于糖苷水解酶18家族(GH18)。CTS3和CTS4几丁质酶均为分泌型蛋白,在N端的第1~25和1~18个氨基酸分别为其信号肽序列,C端均含有糖苷水解酶18家族结构域。分子结构分析表明,几丁质酶CTS3和CTS4三级结构具有(α/β)8的TIM桶形结构,中心部分为平行的β⁃折叠组成的内桶,外桶由α1~α8组成;底物结合区域位于保守序列β3和β4链形成的环状裂隙。亲缘关系分析表明,CTS3和CTS4与昆虫致病真菌几丁质酶同源性较高,它们聚为一支,推测在侵染宿主的过程中具有相似的生物学功能。【结论】2个几丁质酶基因分子特征与亲缘关系的阐明,为研发新型家畜消化道线虫病生防制剂奠定了基础。

猪带绦虫六钩蚴45W基因家族分子克隆

利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从激活的猪带绦虫六钩蚴克隆到45W基因家族。通过测序及DNAStar软件分析证实,共得到8个A型转录本、3个与A型转录本相应的B型转录本和4个其它B型转录本,以及1个C型转录本,提示45W相关基因可能更多。在本研究中,发现45W-4B非常保守,有望以此为基础研制出有效的抗猪囊尾蚴病的疫苗。在大肠杆菌中以融合蛋白(GST)的形式对经改造的A型转录本(A3)和B型转录本(B2)进行表达,SDS-PAGE证明,A3呈可溶性表达;B2的表达产物主要形成了包涵体,用强变性剂(6M尿素)处理后再经SDS-PAGE,证明B2也得到了高效表达。Western分析结果表明,二者均与囊虫患者血清不反应或反应很弱;B2能与猪抗六钩蚴血清反应,说明B2可能具有免疫反应性,且其抗原表位可能是线性的。从预测的结果看,猪带绦虫45W蛋白可能是跨膜糖蛋白,跨膜区位于C末端,在它的结构中可能还存在FnⅢ组件。同时,A3和B2蛋白结构中还存在Cn-Em重复单元,以及由16～17个氨基酸构成的α-螺旋的结构单元。在45W蛋白的加工过程中,磷酸化修饰可能是一项重要内容。由此推测,45W蛋白的作用很复杂,可能在调节基因的表达和维持正常的细胞形态等过程中发挥重要的作用。

人兽共患疾病的流行现状、危害及其防控对策

人兽共患疾病是一类严重威胁人类和动物健康的疾病,有些疾病一旦发生会给人类社会和经济发展带来灾难性的影响。自从其发现以来,人类与其的斗争一直就没有停止。在国际组织和各个国家的参与下,人类已有效控制和消灭了天花、鼠疫等曾给人类带来灾难的人兽共患疾病。然而,21世纪的今天,一些新发现的和曾被有效控制的人兽共患疾病又频频爆发和肆虐,甚至愈演愈烈,有的发展到难以控制的局面,使人类社会又一次面临严峻的考验。本文概括介绍了人兽共患疾病的流行现状与危害、频繁发生的根源以及防控策略等,积极呼吁和倡导世界各国加强合作,采取协调统一的有效措施控制这类疾病的发生和蔓延,造福人类社会。

兽用长效驱虫制剂的研究进展及应用

概述了兽用长效驱虫制剂研制的重要意义,重点介绍了瘤胃控释和缓释制剂、皮下包埋制剂、注射用缓释制剂等长效制剂的研究进展及应用情况,并与常规驱虫药的优缺点进行了比较。

甘南牧区绵羊肝片吸虫病感染的季节动态

肝片吸虫病(Fascioliasis)是一种以牛羊为主要致病对象的多宿主寄生蠕虫病,其流行与病原的中间宿主——椎实螺的孳生和繁衍密切相关。这使得该病在广泛分布的同时,又表现为地方性流行的特征。

我国规模化羊场疫病流行情况及防控对策

一．我国养羊业现状 1．资源丰富，饲养量大。中国土地辽阔，草地资源达60亿亩，占国土面积的40％，是农田和林地的3倍多。农业可利用秸秆非常丰富，为养羊业的发展提供了良好的物质条件。

我国人畜共患病流行现状与对策

1．兽药法规已不适应行业发展的需要。政府在2007年颁布《兽药管理条例》的时候主要是针对生产乱、审批乱、使用乱的问题。随着社会经济的发展，消费者对畜产品安全的期望值不断提高，当前的兽药法规已经无法适应的行业发展。2．行政管理体系不健全。3．兽药标准化工作有待加强。4．监督执法体系不健全。5．技术支撑体系不健全。

基因治疗及其在兽医学中的应用

基因治疗是20世纪90年代形成的,该技术的研究一开始就与动物医学的发展密不可分,主要是通过建立动物疾病模型分析和研究基因治疗各种层面上的问题,但它真正在兽医临床上的研究是近年才开始的。许多试验结果表明,一旦载体的安全性有了保障,基因治疗将有可能成为动物重大疫病有效预防和治疗的方法,在兽医学中有很广阔的应用前景。

我国兽用生物制品产业发展现状与趋势

一．动物保健品产业发展现状 2007-2014年，全球动保产业销售额年复合增长率为6．2％，在国外，伴侣动物用与畜禽用动物保缝品的市场份额各占一半，2007-2014年，国内动保产业年复合增长率为12．3％，明显高于全球动保产业的增长速度。国内畜禽用生物制品的市场份额占97％，伴侣动物仅占3％，按照工信部企业规模分类标准，大部分（63．6％）兽用生物制品企业属于中型企业，只有22．1％属于大型企业。

我国动物疫病防控形势及对策

一、我国动物疫病防控形势分析（一）当前我国动物疫病防控形势分析1．法律法规进一步完善。新中国成立以来。从中国人们政治协商会议制定的《共同纲领》到颁布实施《动物防疫法》、《重大动物疫病应急条例》、《兽药管理条例》等法律法规；制定10个相关配套规章，出台应急预案、防治规范标准1348个，基本上实现了依法治疫。