蜂毒肽与死亡素杂合肽(MT)在大肠杆菌中融合表达的研究

人工合成的蜂毒肽与死亡素的杂合肽DNA序列,经聚合酶链式反应(PCR)扩增后得到带有BamHI和XhoI限制性酶切位点的序列.将此基因克隆至载体pET-32a,成功构建了重组质粒pET32a-MT.测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3),37℃IPTG诱导,获得高效表达,融合蛋白经Ni柱亲和纯化后用肠激酶切下杂合肽,杯碟法检验酶切产物具有抑菌活性。

死亡素突变体TH1在裂殖酵母中的分泌表达

通过PCR方法人工合成带有K28信号肽的死亡素突变体基因,构建了重组表达载体pRHZ-41-k28Th1,转化到裂殖酵母中进行表达,发酵液中检测到与TH1理论分子量一致的多肽分子,微量稀释法检验表达产物具有抑菌活性,并计算了粗产物对4种供试菌的最低抑菌浓度。

虫生真菌对害虫防治的研究与应用

介绍了虫生真菌对害虫防治的研究与应用现状,就国内外的基础与应用研究进展情况给予了总结,包括资源与分类、生物学特性、致病机理及其毒力、菌株选育、制剂研究、自然发生与流行规律以及作为杀虫剂使用、引入定殖、流行病的诱发与调整等,并对虫生真菌以后的研究方向作了讨论。

死亡素在裂殖酵母中的表达

目的:在裂殖酵母中表达死亡素。方法:通过PCR方法人工合成死亡素基因,构建重组表达载体pRHZ41Tha,转化到裂殖酵母中,杯碟法检验表达产物活性。结果:重组载体构建成功并且转化到酵母中,外源基因在转化子中得到了表达,表达产物具有抑菌活性。结论:本研究成功构建了具有抑菌活性的表达产物,为进一步将死亡素研制成添加剂和药物奠定了一定的基础。

Thanatin突变体在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:在大肠杆菌中克隆表达thanatin突变体(Th-T)蛋白并纯化。方法:PCR合成Th-T基因并克隆到pET32a载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,构建Th-T原核表达载体(pET32a-Th-T)并转化到大肠杆菌BL21融合表达,通过正交实验优化表达条件,His-Bind介质纯化。考察经酶切纯化后的重组Th-T对4种供试菌的最低抑制浓度。结果:菌体在LB培养基(pH6.5)培养4.5 h,IPTG 0.4 mmol.L-1诱导7 h,Th-T融合蛋白大量可溶性表达,经药敏试验证明纯化的重组Th-T具有预期的抗菌活性。结论:本研究为通过大肠杆菌体系表达重组Th-T抗菌药物奠定了基础。

重组死亡素裂殖酵母工程菌发酵的研究

在裂殖酵母基本培养基的基础上,通过正交设计.优化了培养基6个组分;优化后的培养基,摇瓶发酵,目的蛋白产量在26-51 mg/L之间,发酵罐的批次发酵,产量在51-102 mg/L之间。

气相色谱法测定利拉鲁肽中四种溶剂的残留量

目的:建立利拉鲁肽原料药中四种残留溶剂的测定方法。方法:采用顶空气相色谱法,色谱柱为DB-624(6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为固定液)的毛细管柱(30 m×0.53 mm×3μm);检测器为氢火焰离子化检测器(FID),检测器温度设定250℃;进样口温度为200℃;初始温度45℃保持5 min,以10℃/min速率升温至100℃,再以40℃/min升温至200℃,保持7 min;顶空平衡温度设定为80℃,平衡30 min。结果:在该色谱条件下,四种残留溶剂的分离效果良好,线性相关系数均大于0.99%;重复性、稳定性与耐用性试验中各溶剂测定结果良好;四种溶剂的检测限分别为0.174、0.019、0.400、0.005μg/ml,定量限分别为0.695、0.077、1.201、0.025μg/ml,方法检测灵敏度高;四种溶剂回收率均在92.0%~108.0%之间(RSD<10.0%,n=9)。结论:该方法操作简便、灵敏度高、重复性好,测定结果稳定可靠,可用于利拉鲁肽原料药中四种残留溶剂的测定。

一种用于proCPB可溶性表达的新型表达系统

目的:构建一种新型可溶性表达系统,实现包括重组猪羧肽酶原B(proCPB)在内的目标蛋白的可溶性表达。方法:通过筛选不同来源的蛋白质二硫键异构酶并与巯基氧化酶进行共表达,并添加N末端标签对这两种蛋白的表达进行优化。结果:在大肠杆菌中,ERV1-TrxsPDI系统与目的蛋白共表达可实现目的蛋白的可溶性表达,且不受到启动子和诱导剂的限制,在重组蛋白生产和新酶工程挖掘等领域具有应用前景。

利拉鲁肽中高分子蛋白质杂质含量方法学研究

目的:建立利拉鲁肽中高分子蛋白质检测的分子排阻色谱法并进行全面的方法学验证。方法:采用分子排阻色谱法分离利拉鲁肽单体以及高分子蛋白质,并对高分子蛋白质进行准确定量。结果:确定了利拉鲁肽中高分子蛋白质的主要形式为二聚体,建立的分子排阻色谱法可准确地测定利拉鲁肽中高分子蛋白质的含量,并考察了高分子蛋白质分析方法的专属性、检测限、定量限、线性与范围、进样精密度、重复性与中间精密度、稳定性和耐用性。结论:建立的方法可快速有效地对利拉鲁肽高分子蛋白质进行定性和定量分析,可作为利拉鲁肽中高分子蛋白质的质量研究和质控分析方法。

改良的幽门螺杆菌噬菌体裂解酶在大肠杆菌和毕赤酵母中表达的活性差异

目的:改良型幽门螺杆菌噬菌体裂解酶由具有穿透外膜作用的疏水多肽和幽门螺杆菌噬菌体编码的裂解酶和穴蛋白构成,比较其在大肠杆菌和毕赤酵母中表达活性的差异。方法:构建的重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母X33,经过表达纯化得到改良型裂解酶,体外通过滤纸片法和液体法比较不同表达系统所表达的改良型裂解酶的活性差异。结果:体外抑菌实验表明,大肠杆菌表达的改良型裂解酶的溶菌效果明显强于毕赤酵母表达的改良型裂解酶。结论:2种表达系统各有优势,就活性而言,大肠杆菌表达系统更佳,毕赤酵母表达系统对外源蛋白的糖基化修饰影响改良型裂解酶活性。

重组猪胰蛋白酶原及其突变体在毕赤酵母X33中的组成型表达

目的:设计以PGAP为启动子的组成型质粒,构建高效表达重组猪胰蛋白酶原的毕赤酵母X33菌株,获得重组猪胰蛋白酶。方法:首先将质粒转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,电转化至毕赤酵母X33,表达重组猪胰蛋白酶原,经肠激酶激活,纯化提取得到重组猪胰蛋白酶。结果:筛选到高效表达重组猪胰蛋白酶原的毕赤酵母X33菌株,获得了重组猪胰蛋白酶。结论:以PGAP为启动子的质粒,转化毕赤酵母X33后表达的重组猪胰蛋白酶原避免了补加甲醇带来的危害,且操作方便,大大缩短了周期,提高了生产效率,避免了动物源性污染。

肝素类制品研究概述

肝素在临床上主要用于血液透析、血栓栓塞性疾病、心血管手术、心脏导管检查等,是防治血栓形成、肺栓塞、弥漫性血管内凝血的首选药物,具有抗凝效果好、副作用小、安全性高等优势。本文通过对肝素类制品类别及制备方法进展,对肝素类制备的发展趋势进行探讨。

一种多肽分子P2中高分子蛋白质杂质含量方法学研究

建立多肽分子P2中高分子蛋白质检测的分子排阻色谱法并进行全面的分析方法学验证。采用分子排阻色谱法分离多肽分子P2中单体以及高分子蛋白质,并对高分子蛋白质进行准确定量。结果表明:本方法的检测限为3.1×10^(-4)mg/ml;定量限为9.4×10^(-4)mg/ml,仪器精密度为RSD为1.1%;多肽分子P2在0.01%-120%的浓度范围内之间存在良好的线性关系,线性方程为Y=432.39X-0.6269,R^(2)=1.00;稳定性及耐用性均符合要求。本方法可快速有效地对多肽分子P2中高分子蛋白质进行定性和定量分析。

赖脯胰岛素注射液犬生物等效性研究

目的对国产赖脯胰岛素注射液和进口赖脯胰岛素注射液(优泌乐)进行药动学和生物等效性研究。方法 Beagle犬头颈部皮下注射交叉给予1 IU/kg单一剂量受试制剂和参比制剂,于给药后0、2、5、10、20、30、45、60、90、120、180和240 min股静脉取血,全自动免疫分析仪检测血清中药物浓度,绘制药-时曲线。将数据经DAS 2.0软件计算药动学参数并进行生物等效性评价。结果赖脯胰岛素受试制剂和参比制剂的药动学参数分别如下:C max(932.0±358.2)和(1 070.2±335.6)μIU/ml,t max(24.0±5.2)和(21.5±12.7)min,t1/2(51.9±28.4)和(66.6±20.7)min,AUC(0-t)为(84 833.2±10 512.9)和(98506.4±31 324.3)μIU·ml-1·min,AUC(0-∞)为(90 438.3±10 492.9)和(107 900.2±34 465.1)μIU·ml-1·min。以AUC(0-∞)计算,受试制剂对参比制剂的相对生物利用度为(93.4±35.9)%。结论 Beagle犬头颈部皮下注射给予1 IU/kg单一剂量受试制剂和参比制剂的体内药动学行为具有生物等效性。

治疗糖尿病和肥胖症的胃肠道激素类多受体激动剂研究进展

胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)类似物已广泛用于糖尿病和肥胖症的治疗,而将GLP-1类似物与其他肠道激素如葡萄糖依赖的促胰岛素肽、胰高血糖素结合的多受体激动剂正处于临床开发阶段。与GLP-1类似物相比,多受体激动剂可发挥多重生理效应、控制血糖和降低体重的效果更好、不良反应更小,有望成为糖尿病和肥胖症的新疗法。本文对在研的肠道激素类多受体激动剂进行综述,总结其设计思路及临床表现,为多受体激动剂类药物的开发提供参考。