海马放射状胶质细胞激活后Rest和Runx1t1基因的表达变化

目的探讨经切割穹隆海马伞侧海马提取液诱导而激活的海马放射状胶质细胞的基因表达变化。方法将分离、纯化后的海马放射状胶质细胞分别加入正常侧和切割穹隆海马伞侧海马提取液,7d后利用免疫荧光法检测两组细胞的数量和生长情况;利用基因芯片分析细胞内基因表达情况;利用实时定量PCR分析神经干细胞向神经元分化的相关基因Rest和Runx1t1的转录情况。结果与正常组相比,切割组放射状胶质细胞的数量明显增多,胞体增大,突起增粗变长。基因芯片结果显示,在所检测的709个基因中,切割组中10个基因表达明显上调,10个基因明显下调;实时定量PCR结果表明,切割组Rest和Runx1t1的转录水平均显著高于正常组(P<0.05)。结论切割穹隆海马伞海马提取液可诱导海马放射状胶质细胞的激活,提高Rest和Runx1t1基因转录水平。

Brn-4在大鼠海马神经干细胞向神经元分化中的作用

为探讨Brn-4在海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)向神经元分化过程中的作用,分别制备切割海马伞侧和正常侧海马提取液,将鼠胚海马神经干细胞球分成3组:(1)切割组加入含切割侧海马提取液的DMEM/F12无血清培养基;(2)正常组加入含正常侧海马提取液的DMEM/F12无血清培养基;(3)对照组加入单纯的DMEM/F12无血清培养基。培养后第14d行Brn-4/MAP-2免疫荧光双标染色。在荧光显微镜下分别计数每个视野下Brn-4单标神经元和Brn-4/MAP-2双标神经元的数量,并测量双标神经元的胞体面积、细胞周长以及Brn-4的免疫荧光强度。用图像处理系统和Stata7.0软件对所得数据进行统计学分析。结果显示:Brn-4/MAP-2双标神经元数在切割组中较多、胞体较大、突起较丰富,且Brn-4的免疫荧光亦较强;正常组次之,对照组最差。上述数据经组间比较分析,3组间差异有显著性意义(P<0.01)。本研究结果提示Brn-4在海马神经干细胞向神经元分化过程中可能发挥重要作用。

Lhx8在海马胆碱能神经再生中的作用

目的探讨切割穹隆海马伞大鼠海马胆碱能神经再生过程中Lhx8的作用。方法 72只SD大鼠随机分成4组,每组18只。所分的4组分别为:对照组(未做任何处理),切割组(切割右侧穹隆海马伞),过表达组(右侧海马齿状回中注射Lenti6.3-Lhx8慢病毒)及切割联合过表达组(右侧海马齿状回中注射Lenti6.3-Lhx8慢病毒并切割右侧穹隆海马伞)。28d后每组各取6只分别制备脑冷冻切片行免疫荧光检测,提取海马总RNA行Real-time PCR,提取海马蛋白行Western blotting检测。结果与对照组相比,切割组、过表达组和切割联合过表达组中Lhx8 mRNA和蛋白水平均显著上调,以切割联合过表达组中上调最为显著,组间比较差异均有统计学意义;切割组胆碱乙酰转移酶(ChAT)mRNA水平与对照组相比无统计学差异,过表达组和切割联合过表达组中ChAT mRNA显著上调,且以切割联合过表达组中上调最为显著;切割组、过表达组和切割联合过表达组中均检测到ChAT蛋白,组间比较差异有统计学意义;切割组、过表达组和切割联合过表达组海马齿状回门区和颗粒下层中均能检测到新生的Lhx8阳性的胆碱能神经元,且以切割联合过表达组最多,组间比较差异均有统计学意义。结论上调Lhx8的表达能促进海马中神经干细胞向胆碱能神经元分化,Lhx8可能与海马胆碱能神经再生有关。

当前局部解剖学教学中的问题与解决对策

局部解剖学（topographicor regional anatomy）是在系统解剖学的基础上,研究人体各个局部区域的层次和器官的位置、毗邻关系的一门科学[1]。学习该课程的主要目的是通过实地解剖,

海马放射状胶质细胞的体外诱导激活及其意义

为探讨海马放射状胶质细胞在切割穹窿海马伞侧海马提取液的诱导下形态发生的变化,将培养的海马胶质细胞接种于24孔培养板中,分成诱导组和对照组,诱导组加入含5%切割穹窿海马伞侧海马提取液的DMEM/F12培养液,对照组加入单纯的细胞培养液,分别于培养后1、3、7和14d时行BLBP免疫荧光检测和Hoechst标记。计算两组各天时BLBP阳性细胞占Ho-echst阳性细胞的百分比,并用LeicaQiwn图像处理软件检测BLBP阳性细胞的周长和面积(含突起)。Stata8.0统计软件行组间比较。结果显示,1d时诱导组BLBP阳性细胞的比例稍高于对照组,两组细胞胞体均较小,突起均较短较细,无明显差异;3d时,诱导组BLBP阳性细胞的比例明显高于对照组,且胞体较大,突起较粗较长;7d时诱导组BLBP阳性细胞的比例明显高于对照组达到高峰,胞体更大,突起更粗更长交织成网;14d时两组BLBP阳性细胞的比例均稍有降低,但诱导组的比例仍明显高于对照组,两组细胞的胞体稍变小,突起稍变细变短。上述结果提示,切割穹窿海马伞侧海马提取液可明显地诱导BLBP阳性放射状胶质细胞增殖,并使胞体变大,突起变粗变长,呈"激活"状态。

切割穹隆海马伞海马提取液促进放射状胶质细胞增殖和向神经元分化

目的探讨海马微环境的变化对体外培养的放射状胶质细胞增殖和分化的影响。方法本实验在成功制备正常侧和切割穹隆海马伞侧海马提取液的基础上,分别使用正常侧和切割侧海马提取液,观察其在体外培养的放射状胶质细胞增殖和分化过程中所起的作用。结果在放射状胶质细胞增殖阶段,切割组与正常组及对照组相比,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的增殖细胞比例明显提高(P<0.05);在放射状胶质细胞分化阶段,切割组与正常组及对照组相比,Tuj1阳性神经元数量明显增多(P<0.05)。结论切割穹隆海马伞侧海马提取液对大鼠放射状胶质细胞的增殖和向神经元的分化有明显促进作用,提示海马微环境对海马放射状胶质细胞的增殖和分化有重要影响。

Brn-4抗体对大鼠海马神经干细胞分化为神经元的影响

为探讨Brn-4在海马神经干细胞(NSCs)向神经元分化过程中的作用,分别制备成年SD大鼠海马伞切割侧和正常侧海马提取液;将从鼠胚海马中分离、克隆和扩增的神经干细胞球分成6组:(1)切割组:加入含切割侧海马提取液的DMEM/F12培养基;(2)切割阻断组:在切割组培养基中加入Brn-4多克隆抗体;(3)正常组:加入含正常侧海马提取液的DMEM/F12培养基;(4)正常阻断组:在正常组培养基中加入Brn-4多克隆抗体;(5)空白组:加入单纯的DMEM/F12培养基;(6)空白阻断组:在空白组培养基中加入Brn-4多克隆抗体。培养后第14d对NSCs分化的神经元进行MAP-2免疫荧光检测,图像处理系统计数各组MAP-2阳性神经元数、处理胞体面积和细胞周长,STATA7.0软件进行统计分析。结果显示:各组以上三项形态学指标从优到劣的排列顺序为:切割组、正常组、切割阻断组、正常阻断组、空白组和空白阻断组。统计分析结果表明,除空白组与空白阻断组三项指标无显著性差异外,其余各组间差异均有显著性意义(P<0.05)。上述结果提示,Brn-4多克隆抗体在体外能部分地阻断切割海马伞侧海马提取液促进NSCs向神经元分化的作用,因而Brn-4在海马NSCs向神经元分化过程中可能发挥重要作用。

Jagged1对海马放射状胶质细胞增殖和向神经元分化的影响

目的探讨Jagged1在体外培养的海马放射状胶质细胞增殖和向神经元分化中的作用。方法体外培养海马放射状胶质细胞,在培养液中加入Notch信号通路的激动剂Jagged1和(或)抑制剂{氮-[氮-(3,5-二氟苯乙酰)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸丁酯,DAPT},将细胞分为空白对照组、Jagged1组、Jagged1联合DAPT组、DAPT组;细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测各组细胞活力;免疫荧光法检测脑脂结合蛋白(BLBP)/Ki67双标阳性细胞数及分化所得的微管相关蛋白-2(MAP-2)阳性细胞数。结果 Jagged1组中细胞活力明显高于其他各组,并且Jagged1组中BLBP/Ki67双标阳性细胞及分化所得的MAP-2阳性细胞数也多于其他各组。结论 Jagged1能够促进体外培养的海马放射状胶质细胞增殖,并且能够促进其更多地向神经元分化。

神经生长因子促进海马胆碱能神经再生过程中Lhx8的动态表达

目的探讨神经生长因子(NGF)促进海马胆碱能神经再生与同源盒基因Lhx8之间的关系。方法SD大鼠72只,在制备切割右侧穹隆海马伞模型和NGF侧脑室注射的基础上,分为对照组、切割组、NGF组、切割联合NGF组;Real-time PCR和Western blotting分别检测各组动物海马中Lhx8蛋白的表达变化;免疫荧光技术检测各组动物海马齿状回颗粒下层中胆碱乙酰转移酶(ChAT)/Lhx8双标细胞数。结果切割组和NGF组中Lhx8蛋白的表达量较对照组增高,切割联合NGF组增高更为明显,且Lhx8基因表达也增高;NGF组和切割联合NGF组中海马齿状回颗粒下层(SGZ)中的ChAT/Lhx8双标细胞数也较对照组和切割组明显增多。结论侧脑室注射NGF促进海马胆碱能神经再生与Lhx8的高表达有关。

切割穹窿海马伞海马提取液和银杏叶提取物联合诱导海马NSCs向胆碱能神经元的分化

为探讨切割穹窿海马伞海马提取液和银杏叶提取物(extract of ginkgo bilobo,EGb)在海马NSCs向胆碱能神经元定向分化中的作用,分别制备大鼠穹窿海马伞切割侧和正常侧海马提取液;将从鼠胚海马中分离扩增的NSCs球分成4组,应用不同的培养液促其分化:(1)联合组:含切割侧海马提取液和银杏内酯的DMEM/F12培养基;(2)提取液组:含切割侧海马提取液的DMEM/F12培养基;(3)EGb组:含银杏内酯的DMEM/F12培养基;(4)对照组:含正常侧海马提取液的DMEM/F12培养基。培养14d后行ChAT免疫荧光检测,计算ChAT阳性神经元的分化率,图像处理细胞面积和周长。结果显示联合组各项指标均明显优于其它各组(P<0.01);提取液组、EGb组各项指标也均优于对照组(P<0.05);细胞面积提取液组优于EGb组(P<0.05),细胞周长EGb组优于提取液组(P<0.05),两组ChAT阳性神经元分化率无明显差异(P>0.05)。上述提示切割穹窿海马伞的海马提取液和EGb联合应用可诱导海马NSCs分化为更多、更为成熟的胆碱能神经元。

Lhx8促进海马神经干细胞向胆碱能神经元分化

目的构建大鼠Lhx8全长结构基因真核表达载体。方法 PCR法扩增Lhx8全长结构基因,经EcoRI和BamHI双酶切后连接至真核表达载体pEGFP-C3中,重组质粒pEGFP-C3-Lhx8经测序鉴定后,采用脂质体转染的方法转染至体外培养的海马神经干细胞中。结果测序鉴定表明,重组质粒pEGFP-C3-Lhx8-EGFP构建成功,该重组质粒转入体外培养的神经干细胞后,质粒转染组中ChAT阳性的细胞数较阴性对照组明显增多(P<0.05)。结论重组质粒pEGFP-C3-Lhx8-EGFP构建成功,Lhx8能够促进NSCs向ChAT阳性的细胞分化。

Lhx8基因沉默抑制NGF诱导的海马NSCs向胆碱能神经元分化的研究

目的:明确Lhx8在神经生长因子(nerve growth factors,NGF)促进海马神经干细胞向胆碱能神经元分化中的作用。方法:体外培养海马神经干细胞并应用NGF促进其向胆碱能神经元分化的过程中,将构建的Lhx8干扰慢病毒加入至培养液中,7 d后应用免疫荧光标记技术检测分化所得胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase,Ch AT)和微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)双标阳性细胞。结果:在空白对照组中,仅检测到少量的Ch AT/MAP-2双标阳性细胞;在NGF组或是NGF联合阴性对照慢病毒组中则可检测到较多的Ch AT/MAP-2双标阳性细胞;在加入Lhx8干扰慢病毒的实验组中,分化所得的Ch AT/MAP-2双标阳性细胞数较NGF组或是NGF联合阴性慢病毒组明显减少。结论:Lhx8基因沉默抑制了NGF诱导的海马神经干细胞向胆碱能神经元的分化。

HCNP与海马提取液对神经干细胞向胆碱能神经元分化的协同作用

目的:探讨海马胆碱能神经元刺激肽(hippocampal cholinergic neurostimulating peptide,HCNP)与海马提取液对海马神经干细胞向神经元及胆碱能神经元分化的协同作用。方法:取孕17 d SD大鼠海马组织进行神经干细胞的培养、增殖、传代,并将其接种于2块24孔板中,培养基中均含B27、微量脑源性神经营养因子(BD-NF),将培养孔分为6组:H+T组,加入HCNP和切割穹窿海马伞侧海马提取液;H+N组,加入HCNP和正常侧海马提取液;H组,加入HCNP;T组,加入切割穹窿海马伞侧海马提取液;N组,加入正常侧海马提取液;对照组,不加HCNP和海马提取液。分化14 d后行MAP-2/ChAT免疫荧光双标检测。结果:与其它各组相比,H+T组分化的MAP-2阳性神经元最多,ChAT/MAP-2双标阳性神经元占MAP-2阳性神经元的比例最高(P<0.05);与N组相比,H+N组MAP-2阳性神经元较多,ChAT/MAP-2双标阳性神经元占MAP-2阳性神经元的比例也较高(P<0.05);与对照组相比,H组T组均可见一定数量的MAP-2阳性神经元及ChAT/MAP-2双标阳性神经元(P<0.05);N组以及对照组中MAP-2阳性神经元的数量和ChAT/MAP-2双标阳性神经元占MAP-2阳性神经元的比例则最低。结论:在微量BDNF存在的情况下,HCNP可促进海马神经干细胞向神经元和胆碱能神经元分化,切割侧海马提取液与HCNP可发挥协同作用。

人体解剖学教学质量评价指标体系的构建

目的:构建适合医学院校使用的人体解剖学教学质量评价指标体系。方法:通过复习文献、与学生和教师座谈、走访咨询专家,在筛选指标、构建框架、形成草案的基础上,对教师课堂理论和实验教学组织实测。确立试卷检测部分的概念题和灵活题比例,通过对学生的实际测试和统计分析,最终确定最佳比例。结果:人体解剖学教学质量评价指标体系分为课堂教学质量评价指标体系和试卷检测两部分,分别占60%和40%。课堂教学质量评价指标体系又分为理论教学和实验教学两部分,理论教学含教学内容、教学方法、思维能力培养及教学基本功4个一级指标;实验教学含实验标本、实验方法和实验总结3个一级指标。每个一级指标又含3～4个二级指标。试卷检测部分概念题和灵活题比重分别为75%和25%。结论:本文构建的人体解剖学教学质量评价指标体系具有较强的可操作性、实用性和科学性。

切割穹窿海马伞后海马齿状回内Lhx8的表达变化及其对RGCs向胆碱能神经元分化的影响

目的:明确Lhx8在SD大鼠切割穹窿海马伞后海马齿状回颗粒下层和门区中的表达变化。方法:切割SD大鼠穹窿海马伞,成功制备海马去神经支配动物模型后,通过Western Blot的方法检测切割后第1、3、7、14、21、28 d海马中Lhx8蛋白的表达变化;通过免疫组织化学方法检测切割后第7天海马齿状回颗粒下层和门区中Lhx8阳性细胞的表达定位,并通过免疫荧光化学方法检测Lhx8/ChAT双标阳性细胞的共定位情况;切割SD大鼠穹窿海马伞并制备海马提取液,将其加入至细胞培养液中,模拟体内海马神经再生微环境,检测培养的海马放射状胶质细胞(radial slia cells,RGCs)向胆碱能神经元分化的情况。结果:切割穹窿海马伞后第7 d,Lhx8蛋白表达量较其他各时相点明显增高;海马齿状回颗粒下层和门区中Lhx8阳性细胞数目和光密度也明显高于正常侧,Lhx8/ChAT双标阳性细胞数目也较正常侧增多;体外细胞培养,切割穹窿海马伞侧海马提取液也较正常侧海马提取液更能促进海马放射状胶质细胞向胆碱能神经元的分化。结论:切割穹窿海马伞后,Lhx8表达明显上调,与海马齿状回的胆碱能神经再生有关。

慢病毒介导的Lhx8基因过表达在海马胆碱能神经元发生中所起作用的初步研究

目的:明确Lhx8过表达慢病毒在海马齿状回胆碱能神经元发生中的作用。方法:构建Lhx8过表达重组质粒、进行慢病毒包装,通过颅脑立体定位和微量注射的方法,将所得慢病毒Lenti6.3-Lhx8注入SD大鼠海马齿状回中;于注射后第1、3、7、10、14天在激光共聚焦显微镜下直接观察增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的荧光表达;检测术后第7天时EGFP/Lhx8/ChAT三标阳性细胞的数目。结果:慢病毒注射后第3天,海马齿状回中EGFP绿色荧光信号最强;此后EGFP表达下降,注射后第14天,几乎检测不到EGFP阳性细胞;术后第7天,注射Lenti6.3-Lhx8的慢病毒侧海马齿状回门区内能够检测到EGFP/Lhx8/ChAT三标阳性细胞,与阴性对照侧比较明显增多。结论:海马齿状回内注射Lhx8过表达慢病毒能够促进胆碱能神经元的发生。

脑脂结合蛋白在胶质母细胞瘤U251细胞自噬中的调节作用

目的:探讨脑脂结合蛋白(brain lipid binding protein,BLBP)在胶质母细胞瘤U251细胞自噬中的调节作用。方法:应用CRISPR/Cas9技术敲除U251细胞中BLBP的表达,检测BLBP敲除后U251细胞的活力变化;Ad-GFP-LC3b腺病毒感染U251细胞后,检测细胞中GFP-LC3b绿色荧光颗粒的数目;Western Blot检测自噬相关分子微管相关蛋白1轻链3βⅠ/Ⅱ(microtubule associated protein 1 light chain 3 betaⅠ/Ⅱ,LC3bⅠ/Ⅱ)、自噬相关基因5(autophagy-related genes 5,ATG5)、选择性自噬接头蛋白(sequestosome1,SQSTM1)的蛋白表达水平;Real-time PCR检测ATG5、SQSTM1的基因表达变化。结果:BLBP基因敲除后,U251细胞的活力明显下调,GFP-LC3b绿色荧光颗粒数目较对照组明显增多;此外,LC3bⅡ的蛋白表达水平较对照组明显增高,SQSTM1蛋白水平明显下降,而ATG5的基因和蛋白表达水平均明显上调。结论:BLBP基因敲除能提高U251细胞的自噬水平,BLBP具有调节胶质母细胞瘤细胞自噬的能力。

脑脂结合蛋白促进大鼠星形胶质细胞增殖的研究

目的:明确脑脂结合蛋白(brain lipid binding protein,BLBP)在体外培养的大鼠星形胶质细胞增殖过程中的作用。方法:构建BLBP过表达重组质粒、进行腺病毒包装,并感染体外培养的大鼠星形胶质细胞。培养3 d后检测BLBP基因和蛋白的表达情况,Ki67阳性细胞和EdU阳性细胞所占的比例,并用流式细胞术检测细胞周期的变化。结果:感染BLBP过表达腺病毒后,星形胶质细胞中BLBP基因的表达水平明显增高,外源性BLBP蛋白也能够在星形胶质细胞中正常表达;Ki67阳性细胞和EdU阳性细胞所占的比例明显增高,S期和G_2/M期细胞比例明显上调。结论:腺病毒能够感染体外培养的大鼠星形胶质细胞,过表达BLBP能够促进星形胶质细胞的增殖。

丙戊酸钠诱导神经干细胞分化过程中肝配蛋白A3的表达

目的探讨丙戊酸钠(VPA)促进神经干细胞分化过程中肝配蛋白A3(Efna3)的表达以及Efna3在神经系统里的表达模式。方法分离培养SD大鼠海马神经干细胞,在VPA诱导分化后24 h和48 h,利用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)、免疫印迹法(Western blotting)和免疫荧光技术检测Efna3的动态表达;Real-time PCR检测Efna3在成年SD大鼠各组织以及神经干细胞、星形胶质细胞和神经元中的表达水平。结果 VPA处理组与对照组相比,Efna3的表达量明显上升;Efna3在端脑和海马中呈现优势表达;Efna3在神经元中表达较高,而在星形胶质细胞中表达较低。结论 VPA促进神经干细胞分化可能与Efna3的表达上调有关。

顺铂诱导大鼠星形胶质细胞衰老的研究

目的:探讨顺铂(CDDP)对星形胶质细胞增殖的影响,明确CDDP在星形胶质细胞衰老中的作用。方法:分离、纯化大鼠星形胶质细胞,分别应用0,1,5,10,20μmol/L的CDDP处理细胞24 h,再用新鲜培养液培养3 d,随后进行细胞活力检测。10μmol/L CDDP处理星形胶质细胞24 h,更换为新鲜培养液继续培养3 d后,分别应用免疫荧光检测Ki67阳性细胞,衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)标记衰老细胞,Western Blot检测p16和p21的表达变化,并用流式细胞术检测细胞周期。结果:10μmol/L和20μmol/L CDDP处理星形胶质细胞24 h后,细胞活力明显下调;即使在新鲜培养液中继续培养3 d,细胞活力仍受明显抑制。10μmol/L CDDP减少Ki67阳性细胞的比例,但增加SA-β-Gal阳性细胞的比例;此外,10μmol/L CDDP还能够上调p16、p21的表达水平,并使细胞周期阻滞于S期。结论:CDDP能够抑制大鼠星形胶质细胞的增殖并诱导细胞衰老。