幽门螺杆菌与胃肠微生物群相互作用及关系的研究进展

幽门螺杆菌(Hp)是慢性萎缩性胃炎、消化性溃疡、胃癌等消化道疾病的重要病因之一。Hp感染可以通过影响胃微环境及宿主免疫进而改变胃肠微生态的多样性及结构,而根除Hp的治疗可造成胃肠微生态短期紊乱,且不同的Hp根除治疗方案对肠道微生态的影响各不相同。本文仅就Hp与胃肠微生态的相互作用进行综述,以便为防治Hp感染提供参考。

口腔菌群与胃癌相关性的研究进展

胃癌是世界范围内严重威胁人类健康的一种癌症,其发生机制尚未完全明确,且大部分患者确诊时已是晚期。口腔是人体内仅次于肠道的第二大微生物库,口腔菌群与人体健康之间的联系也越来越受关注。近年来的一些研究发现口腔菌群与胃癌发生密切相关,口腔菌群特征具有作为胃癌无创诊断筛查生物标志物的潜质,而且口腔菌群失调、移位会促进胃癌的发生发展。本文对口腔菌群与胃癌的相关性进行综述,旨在为进一步阐明胃癌的发生发展机制、实现胃癌的早期无创筛查提供依据,并为后续开展相关研究提供参考。

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的微量蛋白制备抗血清

目的 以SDS PAGE纯化的微量蛋白制备抗人层粘连蛋白受体前体蛋白 (LRP)的血清。方法 以SDS PAGE分离纯化原核表达的人LRP与 6×组氨酸的融合蛋白 ,切下并粉碎融合蛋白所在凝胶块。将含 10 μg融合蛋白的凝胶颗粒与弗氏佐剂混匀后 ,免疫BALB/c小鼠。以Westernblot检测所获抗血清的滴度和特异性。结果 以胃癌细胞总蛋白为靶抗原时 ,Westernblot显示 ,所获抗血清仅识别 1条Mr 约 4 2 0 0 0的蛋白带 ,将抗血清做 1∶2 0 0 0稀释后 ,仍能清晰地显示其靶抗原所在位置。结论 以聚丙烯酰胺凝胶颗粒为载体 。

构建fas基因真核表达载体逆转胃癌耐药细胞MDR表型

目的将ｆａｓ基因转导入胃癌耐药细胞，建立高表达ｆａｓ的耐药株，比较转导前后ｆａｓｍＲＮＡ与蛋白的表达水平，观察转导株对化疗药物的敏感性．方法采用分子克隆技术将人ｆａｓ基因的全长ｃＤＮＡ片段插入真核表达载体ｐＢＫＣＭＶ的多克隆位点之间，并借助脂质体将重组表达载体转导入人胃癌多药耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ，Ｇ４１８筛选克隆细胞，Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ观察ｆａｓ基因的表达，ＭＴＴ法检测转导株对ＶＣＲ，ＣＤＤＰ，５ＦＵ的敏感性．结果成功地构建了真核表达载体ｐＢＫｆａｓ；转导细胞后，从２×１０５细胞中筛选出大约１２０个抗性克隆，转导率大于０５‰，随机挑选２个克隆继续筛选与扩增培养，最终获得了１株稳定的抗性细胞，命名为ｆａｓＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ；杂交结果表明，转导株与非转导株均有ｆａｓ基因的表达，但转导株ｆａｓｍＲＮＡ及其蛋白水平显著高于非转导株；ＭＴＴ实验结果显示，转导株对ＶＣＲ，ＣＤＤＰ，５ＦＵ的敏感性显著升高．结论在胃癌耐药细胞中ｆａｓ基因处于低表达状态．将ｆａｓ基因全长ｃＤＮＡ导入耐药细胞，能有效增强ｆａｓｍＲＮＡ及其蛋白的表达水平，并使耐药细胞对化疗药物的敏感性显著?

超抗原与T细胞的作用

超抗原不需要抗原提呈细胞的加工处理，以MHCII类分子依赖或非依赖的方式递呈，结合于TCR的Vβ而激活T细胞，使其发生增殖、凋亡和免疫无反应性。研究超抗原与T细胞的作用，将有助于探讨淋巴细胞对自身抗原的耐受机制，HIV致病的机理，以及超抗原在肿瘤免疫治疗中的安全应用等。

获奖后的反思——谈干细胞治疗终末期肝病“军队一等奖”的六个问题

我们课题组通过系列的基础和临床研究,提出并建立了自体外周血干细胞移植治疗终末期肝病的新技术。研究成果荣获了2009年度军队医疗成果一等奖。然而,在干细胞治疗终末期肝病这一领域,仍有许多科学问题亟待回答。进一步阐明干细胞移植治疗终末期肝病的机制、确定其最佳适应证、制定临床治疗规范,将是我们以后努力的方向。

热休克蛋白-多肽复合物诱导肿瘤特异性免疫的机理

近年研究发现，肿瘤组织的热休克蛋白－多肽复合物具有肿瘤疫苗的免疫作用，可诱导动物产生特异性的抗肿瘤免疫应答。在诱导免疫应答中，巨噬细胞和Ｂ细胞作为抗原提呈细胞而发挥作用。

Rho GTPases对肿瘤血管生成相关分子的作用

探讨RhoGTPases的 3个主要分子RhoA、Rac1和Cdc4 2对肿瘤血管生成相关分子的作用 .构建负显性RhoA、Rac1和Cdc4 2的真核表达质粒 ,在Lipofectamine2 0 0 0 介导下转染胃癌细胞AGS ,应用ELISA检测细胞培养上清中VEGF的含量 ,应用Western印迹检测肿瘤血管生成相关分子HIF 1α、P5 3和PTEN的表达水平 .成功地构建了负显性RhoA、Rac1和Cdc4 2的真核表达质粒 ,转染胃癌细胞AGS并经G4 18筛选出单克隆 .ELISA表明转染细胞培养上清中VEGF的含量可被明显抑制 ;Western印迹表明 ,负显性RhoGTPases在蛋白水平上可下调HIF 1α表达水平 ,上调P5 3的表达水平 .结果表明 ,Rho家族的 3个主要分子可能通过调节血管生成相关分子的表达来促进肿瘤血管生成 .

以胶原水凝胶为支架构建肝细胞三维培养系统

背景:肝细胞体外培养时快速失去功能限制了肝细胞疗法的发展。目的:以胶原水凝胶为支架建立能够长时间有效维持肝细胞功能的肝细胞三维培养系统。方法:将SD大鼠肝细胞与预混肝细胞生长因子及DMEM的液态Ⅰ型胶原混合,形成肝细胞/胶原凝胶复合物,将该复合物接种至培养板,待形成胶冻状凝胶后再加培养液进行培养。通过光学显微镜、苏木精-伊红染色及透射电子显微镜对肝细胞的形态学特征及超微结构进行观察;并通过糖原染色、免疫荧光染色、实时定量PCR进一步对肝细胞特异表型及功能进行检测。收集培养上清,检测细胞白蛋白及尿素合成能力。结果与结论:①肝细胞/胶原水凝胶复合物形成后,可见肝细胞呈圆形分布于水凝胶中,培养14d后仍保持肝细胞形态并呈类似肝脏结构的肝索样聚集排列,超微结构观察显示肝细胞之间形成紧密连接。②培养14d后,糖原染色、白蛋白及肝细胞核因子4α免疫荧光染色呈阳性,证实肝细胞具有糖原及白蛋白合成能力并仍具有分化潜能。③三维培养中,肝细胞的白蛋白及尿素合成能力及分泌水平明显高于二维培养,且至少能够在较高水平维持15d。④培养7d后,Albumin、HNF-4α、Claudin-3、CYP1A1、CYP3A1以及G6P等肝细胞特异性基因的表达水平明显高于二维培养。以上结果证实,以胶原水凝胶为支架构建的三维培养系统使肝细胞在结构上更类似肝脏组织,并能在更长时间内有效的维持肝细胞合成代谢等各方面功能。

胃癌MG-7抗原模拟表位与HSP70融合基因的构建及表达

目的构建和表达胃癌 MG7模拟表位与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因.方法采用加端 PCR 的方法,将 MG7模拟表位(GC23)的编码序列融合到 HSP 基因的3′端;PCR 获得的融合基因片段经 T-A 克隆法克隆到 pUCm-T 载体上,并进行 DNA 测序;将融合基因片段从 pUCm-T 载体上酶切后,亚克隆到表达载体 PET-21a(+)上;将重组质粒 PET-21a(+)/GC23-hsp 转化大肠杆菌,经IPTG 诱导后,收集细菌,菌体裂解后进行 SDS-PAGE 及Western blot 检测.结果应用 PCR 方法扩增出约2.0kb 的目的片段,序列测定结果证实,模拟表位 GC23序列成功地融合到 HSP70基因的3′端,GC23及 HSP70基因序列均正确;经 EcoR I+Xho I 酶切及 PCR 鉴定证实,融合基因成功地克隆到原核表达载体 PET-21a(+)上;转入重组质粒的大肠杆菌经 IPTG 诱导后,进行SDS-PAGE 发现在 M_r 为72000处有表达量明显增多的蛋白条带,Western blot 证实,M_r72000处的条带为目的条带.结论成功构建并表达了 MG7模拟表位与 HSP70的融合基因.

肝硬化的治疗进展

肝硬化是由各种因素导致慢性肝损害的一类晚期肝纤维化疾病。简述了肝硬化的病因及相关并发症的治疗进展,指出肝移植作为治疗肝硬化唯一有效的治疗手段,但却受到供肝及费用等问题限制,而干细胞具有治疗肝硬化的巨大潜力,成为研究热点,但其作用机制尚未明确,仍有很多问题尚未解决。

ZNRD1基因的克隆及其反义核酸对胃癌耐药细胞阿霉素蓄积的影响

为获得ZNRD1基因的编码区序列 ,构建反义真核表达载体 ,通过检测ZNRD1基因反义核酸转染对胃癌长春新碱耐药细胞SGC790 1/VCR阿霉素 (ADM)积蓄能力的影响 ,评价ZNRD1在抗胃癌细胞多药耐药性方面的应用前景。用PCR方法扩增目的基因序列 ,PCR产物经DNA序列测定证实后 ,采用分子克隆技术 ,将所获目的基因全长cDNA片段按反方向克隆入真核表达载体pcDNA3 1+ 的多克隆位点之间 ,对重组质粒进行酶切鉴定。用脂质体介导法将ZNRD1反义核酸转染SGC790 1/VCR ,流式细胞仪 (FACS)检测SGC790 1/VCR细胞内阿霉素的蓄积量。结果应用PCR反应扩增出特异性片段 ,经DNA序列分析 ,证实与文献报道的ZNRD1基因编码区序列一致 ;构建了反义真核表达载体pcDNA3 1 ZNRD1;转染SGC790 1/VCR细胞后 ,可提高细胞内ADM蓄积量。ZNRD1反义核酸转染后 ,胃癌多药耐药细胞株SGC790 1/VCR对抗肿瘤药物ADM的积蓄作用提高 ,提示ZNRD1反义核酸具有提高耐药细胞株细胞内药物浓度、恢复其药物敏感性、逆转多药耐药性的作用。

自身免疫性肝炎和原发性胆汁性肝硬化重叠综合征的临床特征及疗效观察

目的观察自身免疫性肝炎和原发性胆汁性肝硬化(AIH-PBC)重叠综合征的临床特征及治疗效果。方法研究1:回顾分析124例PBC、57例AIH、39例AIH-PBC重叠综合征患者的临床特征;研究2:根据不同治疗方案对39例AIH-PBC重叠综合征患者进行分组疗效分析。结果在220例自身免疫性肝病患者中,AIH-PBC重叠综合征占17.73%。3组患者的性别组成差异无统计学意义,但发病年龄AIH组<AIH-PBC组与PBC组,乏力、黄疸等症状体征的发生率无差异,但瘙痒症状3组之间差异有统计学意义(P<0.05)。3组间ALT、AST、ALP及GGT水平差异有统计学意义(P<0.05),多以AIH-PBC重叠组高。AIH-PBC组自身抗体检测可见抗核抗体(ANA)、抗线粒体抗体(AMA)、Gp210和SP100抗体阳性,后三项抗体检出率明显高于AIH组,抗平滑肌抗体(SMA)检出率显著高于PBC组(P<0.05)。肝组织病理显示,AIH-PBC重叠综合征兼有PBC和AIH的特点。将39例AIH-PBC患者分为单用熊去氧胆酸(UDCA)组和UDCA联合激素治疗组,治疗后两组ALP、GGT水平均较治疗前有所下降,其中GGT改善有统计学意义;UDCA联合激素治疗组ALT、AST水平较治疗前有显著下降,并在GLB、IgG水平的改善上有统计学意义(P<0.05)。不同治疗组在ALT、IgG指标的生化学应答率上差异存在统计学意义(P<0.05),以联合治疗组应答率高。联合治疗可以有效减轻AIH-PBC重叠综合征患者肝脏炎症纤维化及胆管损害程度,但有骨折及消化道出血等不良反应发生。结论 AIH-PBC重叠综合征表现出AIH与PBC的双重特征,但又不完全是二者的重叠;对于诊断为AIH-PBC重叠综合征的患者,建议积极应用UDCA与糖皮质激素联合治疗,以获得更佳的生化学应答及组织学改善。

奥沙拉嗪与SASP灌肠治疗溃疡性结肠炎的疗效对比观察

目的观察用奥沙拉嗪灌肠方法治疗活动期溃疡性结肠炎的治疗效果,比较奥沙拉嗪与水扬酸偶氮磺胺吡啶(SASP)用灌肠方法治疗活动期溃疡性结肠炎的疗效和不良反应。方法采用随机双盲双模拟方法观察40例活动期溃疡性结肠炎的疗效和不良反应,疗程为4周。结果治疗4周末奥沙拉嗪组的总体疗效评价其显效率为70%,临床症状、体征消失率、内镜完全缓解率和组织学完全缓解率分别为60%、45%、75%及60%,对照组总体疗效评价其显效率为50%,临床症状、体征消失率、内镜完全缓解率和组织学完全缓解率分别为50%、30%、55%及50%,其疗效与对照组相比有明显差异(P<0.05)。结论用奥沙拉嗪灌肠方法治疗活动期溃疡性结肠炎有较好的疗效,其疗效优于SASP组,且奥沙拉嗪的主要不良反应腹泻明显减少。

自体外周血干细胞移植对乙肝相关终末期肝病患者免疫功能的调节作用

目的探讨自体外周血干细胞移植对乙型肝炎病毒(HBV)相关终末期肝病患者外周血中T淋巴细胞亚群和细胞因子的免疫调节作用。方法采用流式细胞术检测患者外周血中Th1、Th2、调节性T细胞(Treg)的百分比,ELISA检测血浆IFN-γ、IL-6、IL-10水平。结果自体外周血干细胞移植能明显改善HBV相关终末期肝病患者肝功能,同时上调患者外周血中Th2、Treg的百分比,下调血浆IL-6和IL-10水平(P<0.05),而对Th1细胞及其细胞因子IFN-γ影响无统计学意义。结论自体外周血干细胞移植可能是通过调节机体免疫微环境,抑制肝脏炎症反应,从而改善HBV相关终末期肝病患者肝功能。

缺氧诱导因子HIF-1α在胃癌细胞系中的表达和意义

目的 研究缺氧诱导因子HIF-1α在人多种胃癌细胞系中的表达及意义。方法 分别利用RT-PCR和Westernblot的方法检测多种胃癌细胞系中HIF-1α的表达水平。结果 常氧条件下,在永生化的胃粘膜上皮细胞系GES及多种胃癌细胞系(包括耐药细胞)中均能检测到HIF-1αmRNA的表达,其表达水平无明显差异;对部分细胞系中HIF-1α蛋白表达进行检测,同样发现常氧时即有HIF-1α的表达,但表达水平明显不同。结论 常氧时在多种胃癌细胞系及永生化的胃粘膜上皮细胞系中均有HIF-1α的表达;在胃癌细胞系中,HIF-1α的调节可能主要在翻译水平而非转录水平;HIF-1α在常氧时胃癌细胞系的异常表达,提示除缺氧刺激外,非缺氧因素可能也在胃癌的发生、发展中发挥了一定的作用。

反义核酸抑制胃癌细胞Bcl-2表达

本文采用分子克隆技术成功地构建了反义核酸表达载体ｐＤＯＲ－Ｂｃｌ－２ ｃＤＮＡ。以奚质体介导法将重组反义核酸表达载体转染受体细胞ＳＧＣ７９０１，并Ｇ４１８筛选，从２×１０＾５细胞中筛选出大约１５０个抗性克隆，转导率大于１‰，随机挑选２个克隆继续筛选与扩增培养，获得了１株稳定的抗性细胞，从而建立了Ｂｃｌ－２表达阻断的胃癌细胞株，我们命名为７９０１ａｎＢｃｌ－２ｃｅｌｌｓ。通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹法、

电压门控钾通道Kv1.5反义核酸对胃癌细胞SGC7901生长的抑制作用

目的 构建电压门控钾通道Kv1 5分子的反义核酸 (Kv1 5AS)的真核表达载体 ,建立Kv1 5AS转染的胃癌SGC790 1细胞亚系 ,探讨Kv1 5分子对胃癌细胞生长的抑制作用。方法 通过DNA重组技术 ,将Kv1 5全长cDNA片段从 pBK Kv1 5载体反向亚克隆至真核表达载体pcDNA3 1 ,构建表达Kv1 5反义核酸的重组载体 pcDNA3 1 Kv1 5AS。借助脂质体将pcDNA3 1 Kv1 5AS转导入胃癌细胞SGC790 1。通过MTT实验绘制细胞生长曲线 ,肿瘤细胞集落形成实验检测集落形成率 ,流式细胞仪进行细胞周期分析 ,并利用Westernblot检测Kv1 5和CyclinD1蛋白在基因转染细胞中的表达。结果 限制性酶切鉴定结果提示 ,重组载体 pcDNA3 1 Kv1 5AS构建成功。Westernblot结果表明 ,转染pcDNA3 1 Kv1 5AS后 ,Kv1 5蛋白在SGC790 1细胞中的表达显著降低。与转染空载体的对照细胞相比 ,转染Kv1 5AS表达载体后 ,SGC790 1细胞生长变缓 ,集落形成率显著降低 ,细胞发生了G1 期阻滞。Westernblot结果证实 ,CyclinD1蛋白在Kv1 5AS转染细胞中表达降低。结论 电压门控钾通道Kv1 5反义核酸可抑制胃癌细胞SGC790

人核糖体蛋白S13的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的克隆人核糖体蛋白S13(ribosomal protein S13,RPS13)cDNA全长,构建原核表达质粒,诱导表达、纯化RPS13蛋白并制备其多克隆抗体。方法应用RT-PCR方法从胃癌多药耐药细胞SGC7901/VCR中扩增出RPS13的cDNA全长,利用DNA重组技术构建重组原核表达载体pET-28a(+)-RPS13,双酶切及测序鉴定。将重组载体转化入大肠杆菌BL21中,筛选抗性克隆并经DNA测序证实。IPTG诱导融合蛋白的表达,利用镍离子亲和层析柱提纯融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blot鉴定。用纯化的融合蛋白His-RPS13免疫BALB/c小鼠,ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,Western blot检测抗体活性。结果RT-PCR扩增片段与预计目的基因片段大小一致;双酶切鉴定表明,重组表达载体pET-28a(+)-RPS13构建成功,DNA测序结果显示所获基因序列与GenBank中收录完全相同。IPTG诱导3h后,经SDS-PAGE检测显示在Mr19000处出现一新生条带,与预计的融合白大小一致;利用抗His标签的抗体进行Western blot,结果证实融合蛋白表达成功。其免疫血清经Western blot证实可特异性的识别蛋白RPS13。结论成功地获得了RPS13的编码基因序列,并获得了纯化的RPS13蛋白质,为制备RPS13的单克隆抗体、进一步研究RPS13在肿瘤中的作用奠定了基础。