蓝舌病新疆分离株VP7蛋白编码基因序列分析及一步法RT-PCR方法的建立

【目的】分析蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,建立蓝舌病新疆分离株一步法RT-PCR方法,为新疆BTV分子流行病学调查及防控提供技术支持。【方法】采用二代测序技术获得新疆分离株S7基因序列,登陆GenBank对序列进行同源性Blast比对,用软件MEGA 5.0分析序列差异,根据蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,运用软件Oligo6.0设计引物,对蓝舌病新疆分离株S7基因进行RT-PCR扩增,并验证该方法的特异性及敏感性。【结果】蓝舌病中国新疆分离株编码VP7蛋白S7基因序列与哈尔滨报道BTV分离株S7基因片段相似度较高为89.64%,与中国云南报道BTV-29型分离株、蒙古国BTV分离株S7基因片段相似度分别为87.49%和87.39%;与德国BTV分离株S7基因片段相似度为80.70%,其余均无同源性序列。中国新疆分离株S7基因片段序列与4条同源序列间存在26处核苷酸差异,9处氨基酸差异。【结论】建立的蓝舌病中国新疆分离株S7基因片段一步法RT-PCR方法具有良好的特异性,仅BTV中国新疆分离株扩增获得目的条带,该方法的敏感性为4.0×10^(3)copies/mL。

牛羊布鲁氏菌天然半抗原琼脂扩散试验的建立与应用

【目的】建立并优化布鲁氏菌天然半抗原琼脂扩散试验(Native hapten agar gel immuno-diffusion test,NH-AGID),检测临床样品。【方法】建立NH-AGID方法,评价方法特异性、敏感性及重复性;检测免疫地区2287份、非免疫地区252份牛、羊血清。【结果】建立了NH-AGID方法,检测稳定,重复性好,具有较高的特异性;对自然感染阳性动物检测敏感性低于80%,对排菌动物的检测敏感性高于90%,检出布病阳性抗体的阈值高于RBT。免疫地区血清NH抗体平均检出率17.8%,LPS抗体平均检出率52.3%;非免疫地区血清NH抗体平均检出率40.9%,LPS抗体平均检出率54.8%。【结论】应用NH-AGID方法可鉴别区分免疫地区牛、羊布病感染动物和免疫动物。检出NH抗体动物处于布鲁氏菌活动期或排菌期为布病感染动物,应及时剔除出群。

布鲁氏菌A19和A19-△VirB12疫苗接种犊牛的免疫抗体变化比较

为了解犊牛采用WOAH推荐的A19疫苗的免疫方式接种不同剂量的A19疫苗和A19-△VirB12疫苗的抗体变化,应用不同剂量的布鲁氏菌A19疫苗和A19-△VirB12疫苗采用WOAH推荐的黏膜免疫和皮下接种两种免疫方式接种3~6月龄母犊牛,采用试管凝集试验(SAT)检测采集于犊牛免疫各时段的血清中抗体变化。结果显示,试验一中犊牛皮下接种常规剂量A19疫苗和A19-△VirB12疫苗在免疫2周均会产生较高水平的抗体。在免疫24周两组仍有5%~15%的血清抗体效价维持在1:200以上。试验二中采用1/10常规剂量的A19疫苗和A19-△VirB12疫苗通过黏膜和皮下免疫犊牛,各组在免疫15周均出现较高水平的抗体效价,在免疫30周,两个皮下免疫组仍有11.76%的血清抗体效价维持在1:200以上。试验结果表明,犊牛皮下接种常规剂量A19-△VirB12疫苗与接种常规剂量A19疫苗产生的抗体效价水平相当。犊牛黏膜免疫和皮下免疫1/10剂量的A19-△VirB12疫苗与同一方法接种同一剂量A19疫苗产生的抗体效价水平相当。

布鲁氏菌病M5、S2疫苗免疫血清半抗原-琼脂扩散试验方法检测评价

目的应用NH-AGID方法对布鲁氏菌M5、S2疫苗株免疫血清进行检测,评价该方法适用性。方法选取3~5月龄羔羊74只,随机分为3组。分别以S2株1.0×1010 CFU、5.0×109 CFU灌服和皮下注射接种羔羊各25只,M5株以1.0×10^(9) CFU皮下注射接种羔羊24只。免疫后7 d~150 d采集羊全血,分离血清,经RBT初筛和SAT确诊免疫抗体阳性血清。评估NH-AGID方法对M5和S2株疫苗免疫抗体与感染抗体的鉴别诊断特异性。结果NH-AGID方法对M5株疫苗免疫阳性血清的LPS抗体检出率为100%,NH抗体检出率8.3%~29.2%,鉴别诊断特异性为82.8%。对S2株疫苗口服组免疫阳性血清的LPS抗体检出率为31.2%~66.7%,NH抗体检出率为0%;皮下注射组免疫阳性血清的LPS抗体检出率为45.4%~100%,NH抗体检出率为4.5%~20%。对S2株疫苗免疫血清的鉴别诊断特异性为96.5%。结论NH-AGID方法不完全适用于羊用布鲁氏菌疫苗M5株和S2株的鉴别诊断,该方法的鉴别诊断特异性与疫苗毒力、免疫剂量和途径等因素相关,应进一步研究明确该方法的适用范围及条件,以期合理应用于布病防控诊断工作中。

高敏荧光层析法在骆驼布鲁氏菌病流行病学调查中的应用

目的了解新疆部分地区骆驼布鲁氏菌病(简称布病)流行情况,探索高敏荧光层析法在骆驼布病流行病学调查中的应用。方法分别在新疆阿勒泰地区、塔城地区、和田地区、伊犁地区、博尔塔拉蒙古自治州采集骆驼血清2000份,骆驼乳307份。应用布病虎红平板凝集试验(RBT)和试管凝集试验(SAT)进行骆驼布病血清学调查。提取骆驼乳基因组DNA,应用实时荧光PCR(Realtime-PCR)和AMOS-PCR方法进行病原学检测并分型。同时应用高敏荧光层析法对200份骆驼血清和100份骆驼乳样进行布病符合率检测。结果新疆5个地区骆驼血清SAT确诊阳性31份,布病血清学阳性率为1.55%(31/2000)。307份骆驼乳经Realtime-PCR检测,5份骆驼乳出现扩增曲线且Ct值在29.65~33.68,骆驼乳布鲁氏菌核酸阳性率为1.63%(5/307)。其中2份骆驼乳提取基因组DNA经AMOS-PCR扩增获得498 bp目的条带,测序并在NCBI进行BLAST比对分析,结果与牛种生物I型布鲁氏菌序列同源性在99.8%~100%。高敏荧光层析法检出骆驼布病阳性血清33份,阴性血清167份,该方法敏感性为96.77%,特异性为98.22%,与SAT检测方法总体符合率为98%,两种方法的Kappa值为0.925。高敏荧光层析法对100份骆驼乳检出布病抗体阳性乳7份,阴性乳93份,该方法与病原学检测方法(Realtime-PCR)总体符合率为98%。结论布鲁氏菌高敏荧光层析法具有灵敏度和特异度高的优点,且与布病常规检测方法符合率较好,可用于骆驼布病现场快速检测。骆驼布病流行病学调查数据提示应加强骆驼布病防控,同时加强骆驼乳的食品安全监管。

布鲁氏菌A19-△VirB12疫苗接种犊牛的免疫抗体变化

为了解不同剂量的布鲁氏菌A19-△VirB12疫苗采用不同接种方式免疫犊牛的抗体变化,使用不同剂量的布鲁氏菌A19-△VirB12疫苗采用点眼和皮下接种两种方式免疫3~6月龄母犊牛,用试管凝集试验(SAT)检测采集于犊牛免疫各时段的血清中抗体变化。结果表明,首次试验中在免疫24周除点眼10亿组和皮下接种50亿组外的其他免疫组均能检出SAT阳性结果。第二次试验中皮下免疫50亿组在免疫3周的SAT检测阳性率达到84.21%,在免疫25周之后的SAT检测均为阴性;两个点眼免疫组在免疫12周初次检出持续抗体阳性,至免疫52周抗体阳性率为4.54%~9.09%。可以得出,布鲁氏菌A19-△VirB12疫苗大剂量免疫犊牛后可能会干扰后期布病检疫结果的判定,A19-△VirB12疫苗50亿CFU/mL皮下免疫犊牛后具有免疫原性较好和抗体转阴时间较早的优势。点眼免疫组检出抗体时间晚,现缺乏针对前期该疫苗细胞免疫指标的检测方法,需要进一步研究。

流产布鲁氏菌疫苗A19-ΔVirB12突变株生物学特性研究

目的为了开发布鲁氏菌病新型标记疫苗,对流产布鲁氏菌A19-ΔVirB12突变株生物学特性研究。方法以亲本A19菌株为参照,对A19-ΔVirB12突变株的菌落形态、生物学特性、毒力、遗传稳定性、免疫原性进行实验比较。结果 A19-ΔVirB12突变株形态及生化特性同亲本株A19基本一致,其毒力弱于A19。A19-ΔVirB12突变株遗传稳定性良好且与A19具有相似的免疫原性。结论流产布鲁氏菌A19-ΔVirB12株毒力较低、遗传性状稳定、并具有良好的免疫保护效力,可作为新型动物布鲁氏菌病标记疫苗研制的候选株。

新疆牛羊布鲁氏菌流行株种及生物型鉴定

【目的】掌握新疆畜间布鲁氏菌病流行株的流行病学特征,为新疆制定切实可行的布鲁氏菌病综合性防控措施提供科学依据和技术支撑。【方法】应用传统分离病原方法从牛羊病料中获得疑似布鲁氏菌11株,应用分子生物学方法对分离菌株进行布鲁氏菌属与种型鉴定,应用常规生化试验对AMOS-PCR鉴定的羊种Brucella进行生物亚型鉴定。【结果】9株分离株均为布鲁氏菌,而且经AMOS-PCR分型方法鉴定均为羊种菌。进一步采用传统细菌分类鉴定,9株布鲁氏菌均为羊种生物3型。【结论】新疆近两年人感染布鲁氏菌的流行菌株为羊种生物3型,应用AMOS-PCR方法可以安全、快速对布鲁氏菌流行株进行种型鉴定而确定传染源,为新疆制定布鲁氏菌病的综合防制策略莫定基础。

牛乳样品中布鲁氏菌的分离和鉴定

为进一步改良布鲁氏菌(Brucella)的分离和鉴定方法,本研究于2010年～2012年对新疆部分奶牛场进行Brucella病的监测,采用改良Brucella选择添加剂培养分离的方法,从试管凝集试验(SAT)检测阳性的25头奶牛的牛乳样中分离到9株分离菌,经VirB8-PCR方法扩增Brucella的VirB8基因对分离株进行鉴定,结果表明9个分离株均为Brucella。同时采用Brucella分子分型PCR及生物学分型方法进一步対分离株鉴定,结果显示其中7个分离株为牛3型,另外2个分离株为羊3型。本研究为奶牛Brucella病的检疫与防控提供了快速分离及鉴定方法。

微波消解-ICP-AES法测定新疆贯叶连翘中的微量元素

微波溶样技术具有方便快捷、节约试剂、污染少和样品溶解完全等特点。采用HNO3 HClO4 (5∶1)作消解剂进行微波溶样 ,利用ICP法同时测定新疆贯叶连翘中Fe ,Ca,Mg ,Zn ,Mn ,Cu ,Na ,K ,Al,Ba,Pb和Cr等元素 ,进行了微波消化条件的选择及消化结果精密度实验 ,方法的回收率在 93 2 %～ 10 3 0 % ,测定的RSD(n =11)在 0 4 %～ 2 9%之间。并利用国家标准物质灌木枝叶GBW0 76 0 2验证了方法的准确度 ,测定值与标准值基本吻合。实验结果表明 ,此方法获得了满意的精密度和准确度。

应用一步PCR法检测并鉴定马疱疹病毒1型和4型

聚合酶链反应 (PCR)可作为一种快速检测并鉴别马疱疹病毒 1型 (EHV 1)和马疱疹病毒 4型 (EHV 4)的诊断方法。PCR引物是根据编码EHV 1和EHV 4的糖蛋白B(gB)基因上的共有的核苷酸序列或型特有的核苷酸序列设计的。利用这两种病毒的型特异性混合引物 ,在一步PCR反应中检测并鉴别EHV 1和EHV 4,而同一疱疹病毒科的单纯疱疹病毒 1型 (HSV 1)、伪狂犬病毒 (PRV)、马立克氏病病毒 (MDV)均无特异性扩增。应用建立的PCR方法检测了普氏野马流产胎儿病料 ,实验结果表明 ,这种PCR方法是一种直接检测并鉴定EHV 1和EHV 4的快速、敏感的诊断方法 ,同时 ,它可在一步PCR反应中直接鉴别这两种病毒 ,可用于病料中EHV 1和EHV 4检测的初步筛选。

新疆桑叶中矿物质元素含量的分析

研究了原子吸收法测定条件,并用火焰原子吸收法、火焰发射法、石墨炉原子吸收法测定了新疆不同地 区桑叶中10种微量元素的含量.用国家标准物质茶树叶GBW08501验证了该法的准确度,测定值与标准植基本 吻合.方法简便、准确、可靠.

评价牛型布鲁氏菌疫苗免疫保护力BALB/c鼠模型的建立

为建立评价流产布鲁氏菌疫苗株免疫保护力的小鼠模型,选取6周龄雌性BALB/c小鼠为试验动物,随机分为3组(n=40):A19免疫攻毒组、非免疫攻毒组和PBS对照组。A19免疫组腹腔接种BALB/c鼠A19 5.0×104 CFU,非免疫攻毒组和PBS对照组均接种PBS液0.2mL。免疫后45d,A19免疫攻毒组和非免疫攻毒组BALB/c鼠以3.0×104 CFU剂量的2308强毒株攻击,攻毒后15和45d分别剖杀小鼠,取小鼠脾脏称重、细菌分离、病理组织学检测。结果表明,攻毒后15d,A19免疫攻毒组与未免疫攻毒组和PBS对照组之间克脾指数差异显著(P<0.05);攻毒后45d,A19免疫攻毒组与PBS对照组的克脾指数差异不显著(P>0.05),与未免疫攻毒组克脾指数差异显著(P<0.05);免疫攻毒组的小鼠组织病理变化明显轻于未免疫攻毒组。结果表明,用BALB/c鼠为试验动物,以A19为疫苗参考株建立动物实验模型可以应用于牛型布鲁氏菌疫苗免疫保护力评价。

微波溶样-AAS法测定麻黄素浸膏粉中的12种元素

微波溶样技术具有方便快捷、节约试剂、污染少、样品溶解完全等特点。本文采用HNO3+H2O2 微波溶样 ,利用原子吸收分光光度法 ,通过对麻黄素浸膏粉中Fe,Ca ,Mg,Zn ,Mn,Cu ,Na ,K ,Ni,Cd ,Pb ,Cr元素的测定 ,进行了微波消化条件的选择及消化结果精密度实验 ,并利用国家标准物质茶树叶GBW0 850 1验证了方法的准确度 ,测定值与标准值基本吻合。实验结果表明 ,该方法获得了满意的精密度、准确度。

套式PCR分型检测马鼻肺炎病毒的方法研究

马鼻肺炎病毒亚型１和亚型２被重新分类并命名为马疱疹病毒１型（ＥＨＶ－１）和马疱疹病毒４型（ＥＨＶ－４）。聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术可应用于检测并区分ＥＨＶ－１和ＥＨＶ－４。选择编码ＥＨＶ－１和ＥＨＶ－４的糖蛋白Ｂ（ｇＢ）基因作为引物。外侧引物为ＥＨＶ－１和ＥＨＶ－４ ＤＮＡ共有的核苷酸序列。内侧引物分别为ＥＨＶ－１或ＥＨＶ－４ ＤＮＡ特有的核苷酸序列。将琼脂免疫扩散试验检测为阴性的７１份马血清样品进行ＰＣＲ检测，其中检出３份血清为阳性，并确诊为ＥＨＶ－１型。结果表明，套式ＰＣＲ的灵敏度比一般ＰＣＲ提高１００倍左右，从而建立了一种快速、敏感、特异的检测并区分ＥＨＶ－１和ＥＨＶ－４的方法，确诊了从新疆普氏野马上分离的ＰＨ９３－１株为ＥＨＶ－１型。

布鲁氏菌PCR鉴定方法的研究与应用

目的采用PCR、PCR-SSCP方法对布鲁氏菌进行快速鉴定,并对其种、型鉴别。方法分析已发表布鲁氏菌属、种、型基因序列,寻找出不同布鲁氏菌的种、型特异性碱基分布规律,设计特异性引物,用于布鲁氏菌属、种、型的鉴定;根据聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析原理,建立PCR-SSCP方法,用于区分牛种A19疫苗株与其他型布鲁氏菌。结果所建立的PCR方法能高效、准确鉴定出布鲁氏菌,并能对其种、型进行区分;PCR-SSCP方法可将A19疫苗株从其他型布鲁氏菌中区分出来。结论利用PCR、PCR-SSCP方法能快速、准确地进行布鲁氏菌属、种、型以及疫苗株A19的鉴别,且简便、可靠,便于临床应用。

新疆库蠓源性盖塔病毒的分离与鉴定

为了解新疆尉犁县库蠓体内携带病毒情况,从该县采集18 000只库蠓,50只为一组研磨后分别接种于BHK-21、C6/36、Vero细胞,盲传5代,一组样品使BHK-21出现CPE,先用5-氟尿核苷药敏试验鉴定为RNA病毒,之后用虫媒RNA病毒引物扩增,鉴定为甲病毒,疑似盖塔病毒,最后用中和试验、免疫电镜观察和盖塔病毒C基因特异性引物PCR等方法鉴定分离毒株为盖塔病毒。本研究首次从新疆库蠓体内分离到盖塔病毒,该毒株与2005年日本分离株相似性高达98%,推测可能是由于引进日本带病种公畜或精液有关,提示在进出口畜牧贸易活动中,应加强盖塔病毒的检疫工作。

羊用布鲁菌病疫苗研究进展

布鲁菌病是重要的人兽共患病,对畜牧业发展和人类健康威胁严重。疫苗免疫仍是目前预防和控制动物布鲁菌病的措施之一,用于羊布鲁菌病防控有多种疫苗,如S19、RB51、Rev.1等,每种疫苗均各有利弊。现今,众多研究者也通过基因工程等技术积极研究DNA疫苗、基因缺失疫苗、亚单位疫苗等。论文就羊用布鲁菌病疫苗的应用及新型疫苗的研究现状进行综述,以期为羊布鲁菌病的预防提供参考。

牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗双重实时荧光定量PCR方法的建立

目的建立一种区分牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株与布鲁氏菌野毒感染株的双重荧光定量PCR方法。方法分别以布鲁氏菌4型分泌系统中VirB8基因、VirB12基因序列设计2对引物及探针,优化实时荧光PCR反应体系及条件。以牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株、牛种布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌M5疫苗株以及猪种布鲁氏菌S2疫苗株、大肠杆菌、沙门氏菌基因组DNA进行Realtime-PCR扩增,评价该方法特异性。分别构建布鲁氏菌VirB12基因和VirB8基因片段阳性质粒,10倍系列稀释后进行Realtime-PCR扩增,测定该方法的敏感性。结果本方法具有良好的特异性,牛种布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌M5疫苗株以及猪种布鲁氏菌S2疫苗株基因组DNA同时出现VirB8基因与VirB12基因阳性扩增,牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株仅出现VirB8基因阳性扩增,大肠杆菌、沙门氏菌均未扩增出目的条带,对VirB8基因及VirB12基因片段阳性质粒的检测限分别为约10^(2) copies/μL和10^(3) copies/μL。该方法仅用于鉴别区分牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株与布鲁氏菌野毒株。结论本研究建立的布鲁氏菌双重Realtime-PCR方法,具有良好的特异性和敏感性,为今后鉴别牛种布鲁氏菌A19-△VirB12分子标记疫苗免疫牛与自然感染牛提供技术支撑。

HPLC法测定新疆贯叶连翘中芦丁及槲皮素的含量

采用高效液相色谱法测定了新疆贯叶连翘中芦丁及槲皮素的含量．以Hypersil ODS（12．5cm×6．0mm i．d．5μm）为色谱柱，甲醇和0．4％磷酸水溶液为流动相，检测波长为360nm，芦丁的进样量在0．058-0．580μg范围内（r=0．9998），槲皮素进样量在0．014-0．140μg范围内（r=0．9999）都与峰面积线性关系良好．芦丁的回收率为99．0％，相对标准偏差RSD为0．66％（n=6），槲皮素的回收率为95.9％，相对标准偏差RSD为1．60％（n=6）．实验表明该方法简便、快速、适用性好．